糖尿病腎病大鼠腎臟MATE1和OCT2表達(dá)及體內(nèi)二甲雙胍排泄變化研究*

黃陳， 余丹， 楊海峰△

糖尿病腎病大鼠腎臟MATE1和OCT2表達(dá)及體內(nèi)二甲雙胍排泄變化研究*

黃陳1， 余丹2△， 楊海峰1△

（1江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023）

研究糖尿病腎病狀態(tài)下大鼠體內(nèi)二甲雙胍排泄的變化和腎臟中多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體1（MATE1）和有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2（OCT2）表達(dá)的變化，并探討兩者之間的關(guān)系。雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（=12）和造模組（=12），鏈脲佐菌素腹腔注射誘導(dǎo)大鼠糖尿病腎病模型；大鼠尾靜脈注射二甲雙胍（10 mg/kg），考察其在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，膀胱插管實(shí)驗(yàn)考察大鼠體內(nèi)各時(shí)間段的累積尿藥排泄分?jǐn)?shù)及腎清除率，測(cè)定大鼠肝臟和腎臟藥物濃度；RT-qPCR和Western blot檢測(cè)大鼠腎臟組織MATE1和OCT2的mRNA及蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，糖尿病腎病大鼠體內(nèi)的二甲雙胍血漿暴露量顯著降低（<0.01），二甲雙胍清除率顯著升高（<0.01），二甲雙胍在大鼠體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)表觀分布容積顯著降低（<0.01），平均滯留時(shí)間顯著降低（<0.01），半衰期顯著縮短（<0.05）；糖尿病腎病大鼠2 h內(nèi)二甲雙胍的累積尿藥排泄分?jǐn)?shù)顯著升高（<0.05），腎清除率顯著升高（<0.01）；糖尿病腎病大鼠腎臟中二甲雙胍的藥物濃度顯著降低（<0.05），肝臟中藥物濃度無顯著性差異；糖尿病腎病大鼠腎臟MATE1的mRNA表達(dá)水平顯著升高（<0.05），OCT2的mRNA水平顯著降低（<0.05），MATE1的蛋白表達(dá)水平顯著升高（<0.01），OCT2的蛋白表達(dá)水平顯著降低（<0.01）。糖尿病腎病狀態(tài)下大鼠腎臟MATE1表達(dá)升高，而OCT2表達(dá)下降；糖尿病腎病大鼠二甲雙胍腎臟排泄的加快，可能主要與腎臟MATE1轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)升高相關(guān)。

糖尿病腎病；多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體1；有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2；二甲雙胍；藥物代謝動(dòng)力學(xué)

糖尿?。╠iabetic mellitus， DM）是由胰島素分泌缺陷、胰島素生物作用受損或兩者兼有引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。隨著DM病程的發(fā)展，機(jī)體的組織、器官和血管等會(huì)發(fā)生病變，形成相應(yīng)的并發(fā)癥。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy， DN）是DM的主要并發(fā)癥之一，約有1/3的DM患者伴隨有DN并發(fā)癥的發(fā)生，其病理學(xué)改變主要包括系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的累積，基底膜的增厚，腎小管及間質(zhì)的損傷和纖維化，目前DN已成為終末期腎臟疾病的主要原因［1］。DM所造成機(jī)體生理?xiàng)l件的改變，可能會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)藥物在機(jī)體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)過程發(fā)生改變。

腎臟作為機(jī)體的主要排泄器官，主要承擔(dān)體內(nèi)代謝內(nèi)源性物質(zhì)、藥物以及毒物等物質(zhì)的排泄功能［2］。在腎臟排泄的過程中，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮著重要的作用［3］。其中，有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族（organic cation transporters， OCTs）和多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體家族（multidrug and toxic compound extrusion transporters， MATEs）是在腎臟中表達(dá)的兩個(gè)重要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體家族。MATEs與OCTs共同調(diào)節(jié)底物的運(yùn)動(dòng)，作用在腎臟和肝臟最為明顯，OCTs位于腎臟近端小管的基底膜外側(cè)及肝細(xì)胞微管膜，底物通過OCTs攝入細(xì)胞；MATEs位于極化細(xì)胞的頂膜，將底物排出細(xì)胞；在肝臟和腎臟中，OCTs-MATEs介導(dǎo)不同結(jié)構(gòu)的陽離子型化合物的吸收及排泄過程，目前約有40種臨床使用藥物已被證實(shí)為OCTs-MATEs的底物。OCT2主要在腎小管細(xì)胞基底外側(cè)膜中表達(dá)，是腎臟中主要的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，可將底物轉(zhuǎn)運(yùn)入腎小管細(xì)胞內(nèi)［4］；MATE1主要在肝細(xì)胞和腎近端腎小管上皮細(xì)胞的刷狀緣膜中表達(dá)，負(fù)責(zé)相應(yīng)底物膽汁和尿液排泄的最后一步［5］。

鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）誘導(dǎo)的DN大鼠模型表現(xiàn)出的蛋白尿、血清肌酐升高及一些組織學(xué)病變，與人DN相似，常用于DN的相關(guān)分子機(jī)制研究［6］。大鼠腎臟中OCT1和OCT2均有表達(dá)，人腎臟中主要有OCT2表達(dá)；嚙齒類動(dòng)物MATE1與人腎臟中MATE1的特性相似［7-9］。

二甲雙胍是目前被多國(guó)指南推薦用作DM治療的一線藥物，其不僅可以降血糖，還可以明顯減少DN患者的尿蛋白排泄，抑制單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化［10］，對(duì)DM腎臟病變有一定的保護(hù)作用；其在體內(nèi)被動(dòng)擴(kuò)散很少，吸收、攝取和排泄主要由膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)［11］，在血漿中幾乎不與血漿蛋白結(jié)合，血漿蛋白結(jié)合率較低；在體內(nèi)不發(fā)生代謝過程，以原形排出體外；其排泄幾乎全部經(jīng)過腎臟由尿液排泄［12-13］。二甲雙胍在腎臟中的排泄主要通過OCT2、MATE1和MATE2-K轉(zhuǎn)運(yùn)［14-15］，且有研究表明，相對(duì)于肝臟上OCT1轉(zhuǎn)運(yùn)體來說，二甲雙胍更容易被腎臟上OCT2轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)［16］。基底膜側(cè)的OCT2轉(zhuǎn)運(yùn)體將二甲雙胍攝取進(jìn)入腎小管上皮細(xì)胞，管腔膜側(cè)的MATEs家族轉(zhuǎn)運(yùn)體將其排出至尿液中。

本研究以STZ誘導(dǎo)的DN大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以MATE1和OCT2的代表性轉(zhuǎn)運(yùn)底物二甲雙胍為探針?biāo)幬?，研究DN大鼠體內(nèi)二甲雙胍排泄的變化，為DN時(shí)使用二甲雙胍治療提供參考；并進(jìn)一步考察DN狀態(tài)下大鼠腎臟中MATE1和OCT2表達(dá)水平的變化，探討DN狀態(tài)下藥物代謝動(dòng)力學(xué)變化與腎臟中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)水平變化之間的關(guān)系。

材料和方法

1　動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，24只，雌性，180～200 g，來源于上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。許可證號(hào)為SCXK（滬）2016-0016。飼養(yǎng)于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物房。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的所有相關(guān)過程均得到江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2　藥品與試劑

鹽酸二甲胍標(biāo)準(zhǔn)品購自上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；STZ購自Sigma-Aldrich；葡萄糖試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；甘油三酯試劑盒、肌酐試劑盒和尿素氮試劑盒購自南京建成生物工程研究所；考馬斯亮藍(lán)試劑盒、BCA試劑盒、RIPA裂解液（強(qiáng)）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5x）、30%丙烯酰胺-甲叉丙烯酰胺和Western Ⅰ抗稀釋液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；TriPure Reagent總RNA提取劑購自北京艾德萊生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Toyobo；qPCR SYBR Green Master Mix購自上海翊圣生物科技有限公司；SLC22A2（OCT2）兔抗單克隆抗體購自Abcam；SLC47A1（MATE1）兔抗多克隆抗體購自ABclonal；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG Ⅱ抗和β-actin兔抗多克隆抗體均購自Bioworld；預(yù)染色的蛋白marker和ECL化學(xué)發(fā)光液購自上海天能科技有限公司。

3　主要儀器

HPLC-UV系統(tǒng)（Shimadzu）；高速冷凍離心機(jī)Centrifuge 5430R和Mastercycler nexus梯度PCR儀（Eppendorf）；高速冷凍離心機(jī)Sorvall RC6 PLUS（Thermo）；多功能酶標(biāo)儀POLARstar Omega（BMG LABTECH）；NANO超微量核酸分析儀（北京原平皓生物技術(shù)有限公司）；全自動(dòng)熒光定量PCR儀LightCycler 96（Roche）；Western blot 電泳和濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)（Bio-Rad）；Tanon 5200 Multin凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

4　主要方法

4.1動(dòng)物分組及造模雄性健康SD大鼠24只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照（control， CON）組和造模組（DM組），每組12只。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6， 17-18］建立DM模型：所有大鼠禁食不禁水過夜后，造模組大鼠腹腔注射STZ（65 mg/kg），對(duì)照組腹腔注射等體積溶媒（0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.5）。注射STZ后第7天，所有大鼠禁食不禁水6 h后，從眼底靜脈叢取血100 μL收集于已肝素化的離心管中，8 000×離心5 min，獲得血漿，用葡萄糖試劑盒測(cè)定其空腹血糖水平。DM組大鼠空腹血糖水平>16.7 mmol/L則視為1型DM大鼠模型造模成功［19］。

造模成功的DM大鼠和正常組大鼠飼養(yǎng)8周后，禁食不禁水過夜，從眼底靜脈叢取血0.25 mL收集于已肝素化的離心管中，8 000×離心5 min，獲得血漿，用葡萄糖試劑盒、甘油三酯試劑盒、肌酐試劑盒及尿素氮試劑盒分別測(cè)定空腹血糖、血漿甘油三酯、血清肌酐及血尿素氮［6， 20］的含量；收集留取所有大鼠24 h的尿液，并記錄尿液體積；取100 μL尿液，8 000×離心5 min，肌酐試劑盒與考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定尿肌酐含量［21］和24 h尿蛋白含量，計(jì)算肌酐清除率。相關(guān)生化指標(biāo)顯著高于對(duì)照組的DM組大鼠視為1型DN大鼠模型構(gòu)建成功。

4.2血漿及尿液樣品的處理取100 μL生物樣品（尿液或血漿）于1.5 mL離心管中，加入200 μL乙腈，震蕩渦旋10 min，18 000×離心10 min，轉(zhuǎn)移上清250 μL于新的1.5 mL離心管中，18 000×離心10 min，取上清100 μL于含有內(nèi)襯管的進(jìn)樣瓶中。

4.3生物樣品中二甲雙胍的測(cè)定使用HPLC-UV系統(tǒng)，水相（A）為含2 mmol/L十二烷基硫酸鈉、0.08%磷酸、0.1%三乙胺的超純水溶液，有機(jī)相（B）為乙腈，等度洗脫，流速為1 mL/min［22-23］；柱溫：40 ℃；單針進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；測(cè)定血漿、腎臟以及肝臟中二甲雙胍的藥物濃度時(shí)，有機(jī)相比例35%，測(cè)定尿液中二甲雙胍的藥物濃度時(shí)，有機(jī)相比例為33%；測(cè)定樣品時(shí)長(zhǎng)為10 min。

4.4DN大鼠靜脈注射二甲雙胍的藥物代謝動(dòng)力學(xué)對(duì)照組與DM組大鼠禁食后，尾靜脈注射含5 g/L二甲雙胍的溶液（10 mg/kg），分別在5、10、15、30、60、90、120、240和360 min時(shí)，眼底后靜脈叢取血0.25 mL于已肝素化的離心管中，8 000×離心5 min，轉(zhuǎn)移血漿，按照4.2方法處理血漿樣品，按照4.3方法測(cè)定血漿中二甲雙胍的藥物濃度。根據(jù)所得數(shù)據(jù)，繪制二甲雙胍的血藥濃度-時(shí)間曲線，用Phoneix WinNonlin軟件計(jì)算出相關(guān)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

4.5DN大鼠膀胱插管實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與DM組大鼠禁食10 h后，進(jìn)行膀胱插管實(shí)驗(yàn)。每只大鼠灌胃給予2 mL生理鹽水使膀胱充盈，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，開腹，用鑷子提拉起膀胱，開一小口，插管插入小口中，用縫合線固定；擠壓膀胱，待尿液流暢穩(wěn)定排出時(shí)，尾靜脈注射含5 g/L二甲雙胍的溶液（10 mg/kg），每隔15 min收集一次尿液，共2 h。按照4.2方法處理尿液樣品，按照4.3方法測(cè)定尿液中二甲雙胍的藥物濃度。計(jì)算對(duì)照組與DM組大鼠各時(shí)間段的累積尿藥排泄分?jǐn)?shù)及腎清除率。

4.6DN大鼠肝臟、腎臟藥物濃度的測(cè)定大鼠膀胱插管實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，留取腎臟、肝臟，并稱重。精密稱取腎臟和肝臟組織0.1 g，加入1 mL的超純水勻漿。取100 μL腎臟和肝臟勻漿液于1.5 mL離心管中，加入200 μL乙腈，震蕩渦旋10 min后，18 000×離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液250 μL于新的1.5 mL離心管中，18 000×離心10 min，取上清液100 μL于含有內(nèi)襯管的進(jìn)樣瓶中，按照4.3方法測(cè)定組織勻漿液中二甲雙胍的濃度。

4.7RT-qPCR（1）RNA提?。喝∧I臟組織0.1 g，置入含有1 mL TriPure?RNA提取劑的研缽中研磨，轉(zhuǎn)移至1.5 mL無核酸酶的離心管中，加入200 μL氯仿，4 ℃、12 000×離心10 min后，吸取上清液400 μL，加入500 μL異丙醇，顛倒混勻10次后室溫放置10 min；在4 ℃、12 000×離心10 min后，棄去上清液，加入用DEPC水配置的75%乙醇1 mL，輕彈管底，使沉淀懸??；在4 ℃、8 000×離心5 min后，棄去上清液，靜置使溶劑揮發(fā)，據(jù)沉淀量加入DEPC水靜置溶解并測(cè)定RNA濃度。（2）RT-qPCR：使用ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。目的基因的mRNA水平通過β-actin校正，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法。引物序列見表1。

表1　RT-qPCR引物序列

4.8Western blot取大鼠腎臟組織約100 mg，加入1 mL含有1 mmol/L PMSF的RIPA（強(qiáng)）裂解液，冰水浴中勻漿，4 ℃靜置30 min后13 000×離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，BCA方法測(cè)定蛋白濃度，隨后100 ℃煮沸10 min進(jìn)行蛋白變性。上樣后進(jìn)行SDS-PAGE（80 V 30 min，120 V 90 min）、濕轉(zhuǎn)（200 mA 90 min），5%脫脂牛奶封閉2 h，Ⅰ抗溶液4 ℃條件下孵育過夜，次日孵育Ⅱ抗；ECL化學(xué)發(fā)光，暗室顯定影。圖像采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值半定量分析，目的蛋白灰度值用內(nèi)參蛋白β-actin灰度值進(jìn)行校正后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

5　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)選擇LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)選擇Dunnett T3檢驗(yàn)。當(dāng)<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　1型DN大鼠模型的建立

如表2所示，造模成功的DM組大鼠和對(duì)照組大鼠飼養(yǎng)8周后，與對(duì)照組大鼠相比，DM組大鼠體重顯著低于對(duì)照組（<0.01），空腹血糖水平顯著高于對(duì)照組（<0.01），血漿甘油三酯水平顯著高于對(duì)照組（<0.05），表明DM大鼠模型構(gòu)建成功。DM大鼠血尿素氮含量顯著高于對(duì)照組（<0.01），血清肌酐含量無顯著性差異，24 h尿液中蛋白含量顯著高于對(duì)照組（<0.01），尿肌酐含量顯著低于對(duì)照組（<0.01），肌酐清除率顯著低于對(duì)照組（<0.01），綜合上述生理生化指標(biāo)結(jié)果，顯示1型DN大鼠模型構(gòu)建成功。

表2　1型糖尿病腎病大鼠生理生化指標(biāo)

FBG： fasting blood glucose； TG： triglyceride； BUN： blood urea nitrogen； Upro： urea protein； SCr： serum creatinine； UCr： urea creatinine； CCr： clearance of creatinine.*<0.05，**<0.01CON group.

2　DN大鼠靜脈注射鹽酸二甲雙胍的藥物代謝動(dòng)力學(xué)變化

2.1二甲雙胍在DN大鼠血漿中濃度和藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化與對(duì)照組相比，DM組大鼠血漿中二甲雙胍濃度在30 min內(nèi)均顯著下降（<0.01），見圖1。從藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果（表3）可知，與對(duì)照組相比，DM組大鼠體內(nèi)的二甲雙胍血漿暴露量顯著降低（<0.01），二甲雙胍清除率顯著升高（<0.01），二甲雙胍在體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)表觀分布容積顯著降低（<0.01），平均滯留時(shí)間顯著減少（<0.01），半衰期也顯著縮短（<0.05）。

Figure 1.　Plasma concentration of metformin after intravenous injection of metformin （10 mg/kg） in rats. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group.

表3　實(shí)驗(yàn)大鼠靜脈注射10 mg/kg二甲雙胍的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)

1/2： half-life time； AUC： area under the curve； Cl： clearance； Vss： steady state apparent distribution volume； MRT： mean retention time.*<0.05，**<0.01control group.

2.2大鼠膀胱插管實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)照組和DM組大鼠2 h內(nèi)二甲雙胍的累積尿藥排泄分?jǐn)?shù)分別為57%和69%左右，兩組間有顯著差異（<0.05），見圖2A；與對(duì)照組相比，DM組大鼠45 min后的累積尿藥排泄分?jǐn)?shù)顯著升高（<0.05），DM組大鼠二甲雙胍的腎清除率顯著升高（<0.01），見圖2B。

Figure 2.　Accumulative urinary excretion fraction （A）and renal clearance rate （B）after intravenous injection of metformin （10 mg/kg） for 2 h. Mean±SD. n=6. *P<0.05， **P<0.01 vs control group.

2.3大鼠腎臟和肝臟中二甲雙胍的藥物濃度靜脈注射10 mg/kg二甲雙胍2 h后，對(duì)照組和DM組大鼠肝臟中二甲雙胍的藥物濃度接近且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；DM組大鼠腎臟中二甲雙胍濃度顯著低于對(duì)照組（<0.05），見圖3。

Figure 3.　Concentration of metformin in the liver and kidney of rats after intravenous injection of metformin （10 mg/kg） for 2 h. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group.

3　DN大鼠腎臟中MATE1和OCT2轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的變化

3.1DN大鼠腎臟中MATE1和OCT2轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平的變化RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖4），DM組大鼠腎臟MATE1的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（<0.05），OCT2的mRNA水平顯著低于對(duì)照組（<0.05）。

Figure 4.　Relative mRNA levels of MATE1 and OCT2 in the kidneys of experimental rats. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group.

3.2DN大鼠腎臟中MATE1和OCT2轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)水平的變化Western blot結(jié)果顯示（圖5），DM組大鼠腎臟上MATE1蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（<0.01），約為正常組大鼠的1.5倍；DM組大鼠腎臟上OCT2蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（<0.01），約為正常組的0.34倍。蛋白表達(dá)水平變化的趨勢(shì)與mRNA水平變化趨勢(shì)結(jié)果相一致。

Figure 5.　Expression of MATE1 and OCT2 in kidney of experimental rats. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group.

討論

本實(shí)驗(yàn)研究了二甲雙胍在DN大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及排泄變化。結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，DN大鼠二甲雙胍血藥濃度顯著下降，血漿暴露量顯著降低，清除率顯著升高，體內(nèi)的滯留時(shí)間和半衰期顯著降低，說明二甲雙胍在DN大鼠體內(nèi)清除加快。膀胱插管實(shí)驗(yàn)顯示，二甲雙胍在DN大鼠體內(nèi)的累積尿藥排泄分?jǐn)?shù)和腎清除顯著升高；在藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中，用Phoneix WinNonlin經(jīng)非房室模型估算所得到的對(duì)照組和DM組大鼠二甲雙胍的總清除率分別為（27.62±2.11） mL·kg-1·min-1和（39.59±4.45） mL·kg-1·min-1，膀胱插管實(shí)驗(yàn)中計(jì)算得到兩組大鼠的腎臟清除率分別為（17.48±3.31） mL·kg-1·min-1和（31.95±7.52） mL·kg-1·min-1，綜合以上結(jié)果顯示，二甲雙胍在DN大鼠體內(nèi)清除加快，主要是由于腎臟清除率的增加所致，其他組織的清除率并沒有顯著變化。二甲雙胍以原型經(jīng)腎代謝，本身并無腎毒性，但嚴(yán)重腎功能衰竭時(shí)易在體內(nèi)蓄積，存在血乳酸水平升高的風(fēng)險(xiǎn)，乳酸酸中毒是二甲雙胍最為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，也是二甲雙胍的禁忌癥。在二甲雙胍的臨床使用中，如果估算腎小球?yàn)V過率大于30 mL/min，可以正常使用二甲雙胍，小于30 mL/min是二甲雙胍使用的禁忌。本研究結(jié)果提示在DN狀態(tài)下使用二甲雙胍，不僅要關(guān)注乳酸酸中毒等不良反應(yīng)，還應(yīng)關(guān)注在估算腎小球?yàn)V過率大于30 mL/min的情況下，由于相關(guān)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的變化導(dǎo)致的二甲雙胍腎臟清除率的增加以及對(duì)降糖治療效果的影響。

本實(shí)驗(yàn)從mRNA與蛋白表達(dá)水平上研究了腎臟中與二甲雙胍轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的MATE1和OCT2兩種轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)差異。Thomas等［24］的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，DM大鼠中腎臟上OCT1、OCT2和OCT3表達(dá)均顯著下調(diào)；Grover等［25］的研究中同樣發(fā)現(xiàn)DM狀態(tài)下，大鼠腎臟上OCT2蛋白表達(dá)的下調(diào)與DM病程呈現(xiàn)正相關(guān)；在Ⅱ型DM大鼠中，腎臟上OCT2的表達(dá)同樣存在下調(diào)現(xiàn)象［26］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示DN狀態(tài)下大鼠腎臟組織中OCT2的mRNA與蛋白表達(dá)水平顯著降低，同以上研究結(jié)果相一致；同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)DN狀態(tài)下大鼠腎臟MATE1表達(dá)進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MATE1在mRNA水平與蛋白表達(dá)水平上均顯著升高。

Fabian等［27］在二甲雙胍（30 μmol/L）犬腎細(xì)胞（Madin-Darby canine kidney cells， MDCK）胞內(nèi)累積實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍被OCT2攝取進(jìn)入細(xì)胞的量高于MATE1排出細(xì)胞的量，即OCT2轉(zhuǎn)運(yùn)二甲雙胍的能力強(qiáng)于MATE1。K?nig等［28］證實(shí)OCT2的吸收與MATE1的外排功能之間存在相互作用，與MDCK細(xì)胞、MDCK-MATE1單轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，雙轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞OCT1-MATE1和OCT2-MATE1細(xì)胞中（二甲雙胍濃度10～2 500 μmoL/L），二甲雙胍向細(xì)胞內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)明顯增加，且該過程在二甲雙胍濃度達(dá)到為2 500 μmol/L之前是不飽和的。由于腎臟分泌陽離子物質(zhì)是通過基底外側(cè)膜的電位差和刷狀緣膜上的H+梯度驅(qū)動(dòng)協(xié)同進(jìn)行。位于基底膜側(cè)的OCT2通過易化擴(kuò)散的方式將其有機(jī)陽離子底物攝入腎小管細(xì)胞中，這一過程主要是依靠?jī)蓚?cè)跨膜電位差來完成［29］。本實(shí)驗(yàn)中肝臟、腎臟組織濃度測(cè)定結(jié)果顯示，二甲雙胍在DN大鼠腎臟中藥物殘留顯著降低。由此可推測(cè)，DN狀態(tài)下大鼠腎小管細(xì)胞因MATE1表達(dá)和功能的增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)二甲雙胍濃度降低，促進(jìn)了二甲雙胍通過OCT2以易化擴(kuò)散方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，由于OCT2對(duì)二甲雙胍的轉(zhuǎn)運(yùn)能力較強(qiáng)，如果轉(zhuǎn)運(yùn)能力未達(dá)到飽和狀態(tài)，OCT2表達(dá)的下調(diào)可能不影響其轉(zhuǎn)運(yùn)二甲雙胍的能力。Tsuda等［30］的研究中，通過基因沉默MATE1小鼠證實(shí)了MATE1在二甲雙胍腎臟消除中發(fā)揮的重要作用。在研究二甲雙胍相關(guān)的藥物相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，西咪替丁抑制二甲雙胍腎臟消除的潛在機(jī)制可能是通過抑制MATE1的功能，而不是抑制OCT2的功能［31］。綜上所述，從OCT2-MATE1協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)的視角來看，DN狀態(tài)下大鼠腎臟MATE1和OCT2表達(dá)的變化總體上表現(xiàn)為二甲雙胍腎臟清除的加快，二甲雙胍腎臟排泄的加快可能主要與MATE1表達(dá)升高相關(guān)。

目前從基因多態(tài)性的角度開展MATE1和OCT2表達(dá)差異的研究較多，已在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)MATEs的遺傳多態(tài)性能影響MATEs轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能，在和中分別發(fā)現(xiàn)16個(gè)突變位點(diǎn)及4個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體功能有影響［33］。本實(shí)驗(yàn)研究了DN狀態(tài)下大鼠腎臟上MATE1和OCT2的功能與表達(dá)變化，表明在疾病狀態(tài)下腎臟中MATE1和OCT2的功能與表達(dá)會(huì)受到影響，導(dǎo)致相關(guān)藥物在腎臟的蓄積或排泄加快，其臨床意義值得進(jìn)一步關(guān)注。

［1］ Tuttle KR， Bakris GL， Bilous RW， et al. Diabetic kidney disease： a report from an ADA Consensus Conference［J］. Diabetes Care， 37（10）：2864-2883.

［2］ Yacovino LL， Aleksunes LM. Endocrine and metabolic regulation of renal drug transporters［J］. J Biochem Mol Toxicol， 2012， 26（10）：407-421.

［3］ Liu X. Overview： role of drug transporters in drug disposition and its clinical significance［J］. Adv Exp Med Biol， 2019， 1141：1-12.

［4］ Kimura N， Okuda M， Inui K. Metformin transport by renal basolateral organic cation transporter hOCT2［J］. Pharm Res， 2005， 22（2）：255-259.

［5］ Otsuka M， Matsumoto T， Morimoto R， et al. A human transporter protein that mediates the final excretion step for toxic organic cations［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2005， 102（50）：17923-17928.

［6］ Tesch GH， Allen TJ. Rodent models of streptozotocin-induced diabetic nephropathy［J］. Nephrology （Carlton）， 2007， 12（3）：261-266.

［7］ Xiaoyan， Chu， Kelly， et al. Species differences in drug transporters and implications for translating preclinical findings to humans［J］. Expert Opin Drug Metab Toxicol， 2013， 9（3）：237-252.

［8］ Nies AT， Damme K， Kruck S， et al. Structure and function of multidrug and toxin extrusion proteins （MATEs） and their relevance to drug therapy and personalized medicine［J］. Arch Toxicol， 2016， 90（7）：1555-1584.

［9］ Damme K， Nies AT， Schaeffeler E， et al. Mammalian MATE （SLC47A） transport proteins： impact on efflux of endogenous substrates and xenobiotics［J］. Drug Metab Rev， 2011， 43（4）：499-523.

［10］馮曄囡， 張幼怡， 肖晗. 二甲雙胍通過AMPK依賴及非依賴途徑抑制腎臟纖維化［J］. 中國(guó)病理生理雜志， 2015， 31（10）：1793.

Feng YN， Zhang YY， Xiao H. Metformin inhibits renal fibrosis through AMPK dependent and independent pathways［J］. Chin J Pathophysiol， 2015， 31（10）：1793.

［11］ Emami Riedmaier A， Fisel P， Nies AT， et al. Metformin and cancer： from the old medicine cabinet to pharmacological pitfalls and prospects［J］. Trends Pharmacol Sci， 2013， 34（2）：126-135.

［12］ Tucker GT， Casey C， Phillips PJ， et al. Metformin kinetics in healthy subjects and in patients with diabetes mellitus［J］. Br J Clin Pharmacol， 1981， 12（2）：235-246.

［13］ Markowicz-Piasecka M， Huttunen KM， Mateusiak L， et al. Is metformin a perfect drug？ Updates in pharmacokinetics and pharmacodynamics［J］. Curr Pharm Des， 2017， 23（17）：2532-2550.

［14］ Liang XM， Giacomini KM. Transporters involved in metformin pharmacokinetics and treatment response［J］. J Pharm Sci， 2017， 106（9）：2245-2250.

［15］ 許希寧， 石榮， 馬越鳴. 基于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體機(jī)制的二甲雙胍體內(nèi)過程研究進(jìn)展［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2017， 52（6）：865-870.

Xu XN， Shi R， Ma YM. Research progress of pharmacokinetics of metformin based on transporters［J］. Acta Pharm Sin， 2017， 52（6）：865-870.

［16］ Kimura N， Masuda S， Tanihara Y， et al. Metformin is a superior substrate for renal organic cation transporter OCT2 rather than hepatic OCT1［J］. Drug Metab Pharmacokinet， 2005， 20（5）：379-386.

［17］ Liu H， Xu X， Yang Z， et al. Impaired function and expression of P-glycoprotein in blood-brain barrier of streptozotocin-induced diabetic rats［J］. Brain Res， 2006， 1123（1）：245-252.

［18］ Kaur M， Bedi O， Sachdeva S， et al. Rodent animal models： from mild to advanced stages of diabetic nephropathy［J］. Inflammopharmacology， 2014， 22（5）：279-293.

［19］ 黃恬， 蔡稀， 鐘玲. 厄洛替尼減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型大鼠的腎損傷［J］. 中國(guó)病理生理雜志， 2017， 33（8）：1460-1466.

Huang T ， Cai X ， Zhong L， et al. Effect of erlotinib on renal injury in rats with STZ-induced diabetic nephropathy［J］. Chin J Pathophysiol， 2017， 33（8）：1460-1466.

［20］ Breyer MD， B?ttinger E， Brosius FC， et al. Diabetic nephropathy： of mice and men［J］. Adv Chronic Kidney Dis， 2005， 12（2）：128-145.

［21］ Mathialagan S， Rodrigues AD，F(xiàn)eng B. Evaluation of renal transporter inhibition using creatinine as a substrateto assess the clinical risk of elevated serum creatinine ［J］. J Pharm Sci， 2017， 106（9）：2535-2541.

［22］ Komazawa H， Yamaguchi H， Hidaka K， et al. Renal uptake of substrates for organic anion transporters Oat1 and Oat3 and organic cation transporters Oct1 and Oct2 is altered in rats with adenine-induced chronic renal failure［J］. J Pharm Sci， 2013， 102（3）：1086-1094.

［23］ Chen Y， Li HQ， Xu JJ， et al. Determination of metformin in diabetic rat plasma by an improved ion-pair high-performance liquid chromatography： application to a pharmacokinetic study［J］. Acta Pharmacol Sin， 2012（3）：211-218.

［24］ Thomas MC， Tikellis C， Kantharidis P， et al. The role of advanced glycation in reduced organic cation transport associated with experimental diabetes［J］. J Pharmacol Exp Ther， 2004， 311（2）：456-466.

［25］ Grover B， Buckley D， Buckley AR， et al. Reduced expression of organic cation transporters rOCT1 and rOCT2 in experimental diabetes［J］. J Pharma Exp Ther， 2004， 308（3）：949.

［26］ Nowicki MT， Aleksunes LM， Sawant SP， et al. Renal and hepatic transporter expression in type 2 diabetic rats ［J］. Drug Metab Lett， 2008， 2（1）：11-17.

［27］ Müller F，Weitz D，Mertsch K， et al. Importance of OCT2 and MATE1 for the cimetidine-metformin interaction： insights from investigations of polarized transport in single- and double-transfected MDCK cells with a focus on perpetrator disposition［J］. Mol Pharm， 2018， 15（8）：3425-3433.

［28］ K?nig J， Zolk O， Singer K， et al. Double-transfected MDCK cells expressing human OCT1/MATE1 or OCT2/MATE1： determinants of uptake and transcellular translocation of organic cations［J］. Br J Pharmacol， 2011， 163（3）：546-555.

［29］ 戴永國(guó)， 陳李杰， 王崴， 等. 腎臟有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2在急性腎損傷中病理生理調(diào)控的研究進(jìn)展［J］. 生命科學(xué)， 2018， 30（7）：790-797.

Dai YG， Chen LJ， Wang W， et al. Pathophysiological regulation of renal organic cation transporter 2 （OCT2） in acute kidney injury： a review［J］. Chin Bull Life Sci， 2018， 30（7）：790-797.

［30］ Tsuda M ， Terada T ， Mizuno T ， et al. Targeted disruption of the multidrug and toxin extrusion 1 （） gene in mice reduces renal secretion of metformin［J］. Mol Pharmacol， 2009， 75（6）：1280-1286.

［31］ Tsuda M， Terada T， Ueba M， et al. Involvement of human multidrug and toxin extrusion 1 in the drug interaction between cimetidine and metformin in renal epithelial cells［J］. J Pharmacol Exper Ther， 2009， 329（1）：185-191.

［32］ Kajiwara M， Terada T， Asaka J， et al. Critical roles of Sp1 in gene expression of human and rat H+/organic cation antiporter MATE1［J］. Am J Physiol Renal Physiol， 2007， 293（5）：F1564-F1570．

Changes of MATE1/OCT2 expression and metformin excretion in kidneys of rats with diabetic nephropathy

HUANG Chen1， YU Dan2△， YANG Hai-feng1△

（1，225300，；2，，210023，）

To investigate the changes of metformin excretion in rats with diabetic nephropathy （DN）and the expression of multi-drug and toxic compound efflux transporter 1 （MATE1） and organic cation transporter 2 （OCT2） in kidneys， and to explore the relationship between them.Male SD rats were randomly divided into control group （=12） and model group （=12）. Streptozotocin was injected intraperitoneally to induce DN model. Metformin solution （10 mg/kg） was injected into the tail vein of rats to investigate its pharmacokinetic parameters in rats. Bladder intubation test was conducted to investigate the cumulative urinary drug excretion fraction and renal clearance rate in rats at various time points， and the drug concentrations in rat liver and kidney were determined. The mRNA and protein expression levels of MATE1 and OCT2 in rat kidney were tested by RT-qPCR and Western blot， respectively.Compared with control group， the plasma exposure of metformin in DN rats dropped significantly （<0.01）， the clearance rate of metformin was elevated significantly （<0.01）， the steady-state apparent distribution volume of metformin declined significantly （<0.01）， the mean residence time was reduced significantly （<0.01）， and half-life time was decreased significantly （<0.05）. The cumulative urinary excretion fraction of metformin in DN rats was elevated significantly within 2 h （<0.05）， and the renal clearance rate was increased significantly （<0.01）. The concentration of metformin in kidney of DN rats declined significantly （<0.05）， and there was no significant difference of drug concentration in livers. In DN rats， the mRNA expression level of MATE1 was significantly increased （<0.05）， the mRNA level of OCT2 was significantly decreased （<0.05）， the protein expression level of MATE1 was significantly increased （<0.01）， and the protein expression level of OCT2 was significantly decreased （<0.01）.Accelerated renal excretion of metformin in DN rats may be mainly related to the increased expression of MATE1 in the kidney.

Diabetic nephropathy； Organic cation transporter 2； Multidrug and toxic compound extrusion transporter 1； Metformin； Pharmacokinetics

1000-4718（2022）09-1645-08

2022-03-28

2022-06-24

余丹Tel： 025-85811389； E-mail： yud@njucm.edu.cn； 楊海峰 Tel： 0523-86158187； E-mail： yhf8142@ sina.com

R965； R587.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.09.014

［基金項(xiàng)目］江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. BK20161368）；江蘇高?！扒嗨{(lán)工程”資助項(xiàng)目；江蘇省“333高層次人才培養(yǎng)工程”資助項(xiàng)目；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目（No. NSF2021TC02）

（責(zé)任編輯：宋延君，李淑媛）