小檗堿對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛行為及IRAK1/TRAF6信號(hào)通路介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的影響*

王士珍， 張曉蕾， 丁蘇彭， 顧玲玲， 陳培， 李廣智， 張萌△

小檗堿對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛行為及IRAK1/TRAF6信號(hào)通路介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的影響*

王士珍1， 張曉蕾1， 丁蘇彭1， 顧玲玲2， 陳培1， 李廣智1， 張萌2△

［1江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院解剖生理教研室，江蘇 淮安 223005；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院（淮安市第二人民醫(yī)院）急診科，江蘇 淮安 223001］

探討小檗堿對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠是否具有疼痛緩解作用，并分析白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（IRAK1）/腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）通路在其中的作用機(jī)制。60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、脊神經(jīng)結(jié)扎組（模型組）、小檗堿（低、高劑量）組及陽(yáng)性藥物（阿魏酸鈉）組，每組12只。對(duì)各組大鼠進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)評(píng)估，測(cè)定大鼠后足熱縮足反射潛伏期（TWL）、機(jī)械縮足反射閾值（MWT）；六胺銀染色觀察患側(cè)脊髓背角病理變化；ELISA法檢測(cè)各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中炎癥相關(guān)因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和IL-6的表達(dá)水平；RT-qPCR法和Western blot法分別檢測(cè)脊髓IRAK1和TRAF6的mRNA及蛋白表達(dá)水平。脊髓背角病理切片顯示，模型組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元纖維增粗并纏繞成結(jié)，且有大量空泡變性，并且神經(jīng)細(xì)胞的胞質(zhì)出現(xiàn)含有嗜銀顆粒的空泡；小檗堿和陽(yáng)性藥物治療后脊髓背角損傷明顯減少。與假手術(shù)組相比，模型組MWT和TWL顯著降低，大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著升高，脊髓中IRAK1和TRAF6 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高（<0.05）；與模型組相比，小檗堿（低、高劑量）組及陽(yáng)性藥物組MWT和TWL顯著升高，大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著降低，脊髓中IRAK1和TRAF6 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低（<0.05）；與小檗堿高劑量組相比，小檗堿低劑量組MWT和TWL顯著降低，大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著升高，脊髓中IRAK1和TRAF6 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高（<0.05）。陽(yáng)性藥物組各項(xiàng)指標(biāo)與小檗堿高劑量組相比均無(wú)顯著性差異（>0.05）。小檗堿可以抑制IRAK1/TRAF6通路介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)病理性疼痛大鼠的疼痛反應(yīng)。

小檗堿；神經(jīng)病理性疼痛；白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶；腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6

神經(jīng)病理性疼痛主要是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)直接損傷所引起的疼痛，其嚴(yán)重影響患者正常的生活活動(dòng)。神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病病因多種多樣，其中以機(jī)械性損傷最為多見。因該病內(nèi)在機(jī)制尚不明確，故難以對(duì)其靶向治療［1］。目前對(duì)于神經(jīng)病理性疼痛的治療方法主要有通過常規(guī)抗炎藥物緩解病痛，或通過作用于神經(jīng)元，暫時(shí)阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)緩解疼痛，但以上治療方法均難以有效緩解患者的病情，且都存在一定程度的副作用［2-3］。因此闡明神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機(jī)理，進(jìn)而通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路治療神經(jīng)疼痛成為了當(dāng)前人們研究的重點(diǎn)［4］。研究表明，有多條信號(hào)通路參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控，其中白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（interleukin-1 receptor-associated kinase， IRAK1）通過神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮重要作用，其可以調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損引起的神經(jīng)炎癥，誘導(dǎo)神經(jīng)疼痛［5］。IRAK1與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6， TRAF6）結(jié)合，亦可進(jìn)一步調(diào)控神經(jīng)炎癥［6］。而抑制IRAK1的表達(dá)可阻斷神經(jīng)炎癥發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而緩解神經(jīng)病理性疼痛，因此IRAK1/TRAF6通路往往被視作通過調(diào)控神經(jīng)炎癥抑制神經(jīng)病理性疼痛的重要靶點(diǎn)［7］。

小檗堿又稱黃連素，研究表明其具有抗心力衰竭、抗炎癥和抗腦缺血等多種藥用活性，作為常見的中藥而廣泛用于治療腦缺血損傷等疾?。?］。近年來有研究指出，小檗堿可下調(diào)炎癥因子和凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，減少神經(jīng)炎癥的發(fā)生和神經(jīng)元的凋亡，減輕神經(jīng)元的損傷，從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用［9］。但小檗堿神經(jīng)功能保護(hù)作用的具體途徑并未明確，其對(duì)神經(jīng)病理性疼痛是否具有治療作用尚有待驗(yàn)證。本研究以脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、ELISA、RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)探究小檗堿對(duì)IRAK1/TRAF6神經(jīng)炎癥通路及神經(jīng)病理性疼痛的影響，以期為靶向治療神經(jīng)病理性疼痛藥物的研發(fā)提供參考。

材料和方法

1　動(dòng)物

由山東艾萊克生物科技有限公司購(gòu)得SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，6～7周齡，體重（220±10） g，許可證號(hào)為SCXK（魯）20190007。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均給予24 h晝夜燈光照射控制，并維持溫度在24 ℃左右條件下飼養(yǎng)，濕度控制在45%～55%之間。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物嚴(yán)格遵守3R原則，并通過江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2　主要試劑與儀器

小檗堿購(gòu)于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；阿魏酸鈉（國(guó)藥準(zhǔn)字H20073115）購(gòu)于成都亨達(dá)藥業(yè)有限公司；von Frey Hair纖維絲刺激針購(gòu)于上海玉研科學(xué)儀器有限公司；mRNA提取試劑盒和基底膜六胺銀染色液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR反應(yīng)體系購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司；血清腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α） ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于江萊生物科技有限公司；白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒、GAPDH抗體、IRAK1抗體和TRAF6抗體購(gòu)于Abcam。熱測(cè)痛儀（Bioserve，北京友誠(chéng)嘉業(yè)生物科技有限公司）；熒光定量PCR儀（7500，ABI）；凝膠成像系統(tǒng)（ZF-268，上海嘉鵬科技有限公司）。

3　實(shí)驗(yàn)方法

3.1動(dòng)物模型的構(gòu)建60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、脊神經(jīng)結(jié)扎（模型）組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組和陽(yáng)性藥物組，每組12只。參考周曄等［10］造模方法并加以改進(jìn)，建立脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠模型，麻醉各模型大鼠，固定于操作臺(tái)上，呈俯臥位，剪去背部毛后沿背側(cè)切開皮膚，剝離組織，鈍性分離暴露脊神經(jīng)，造模大鼠在第5脊神經(jīng)處用5號(hào)絲線結(jié)扎，縫合后消毒處理，假手術(shù)組立即逐層縫合并消毒處理。術(shù)后，根據(jù)前人研究結(jié)果［11-12］及本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)，小檗堿低劑量組大鼠灌胃給予小檗堿50 mg/kg，小檗堿高劑量組大鼠灌胃給予小檗堿150 mg/kg，陽(yáng)性藥物組大鼠灌胃給予阿魏酸鈉150 mg/kg，大鼠假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃給予等體積（10 mL/kg）的生理鹽水，每天1次，連續(xù)10 d。

3.2機(jī)械縮足反射閾值（mechanical withdraw threshold， MWT）檢測(cè)依據(jù)參考文獻(xiàn)方法［10］，術(shù)前2 h、術(shù)后3、5、7、10 d將各組大鼠分別置于透明玻璃箱中，箱底部為鐵絲網(wǎng)結(jié)構(gòu)。待大鼠適應(yīng)15 min后，通過下層鐵絲網(wǎng)網(wǎng)眼，將特制的von Frey Hair纖維絲刺激針以垂直方向刺激大鼠兩側(cè)后肢足底，刺激部位為足底正中心位置，待纖維絲刺激針緩慢接觸足底后逐漸用力按壓，記錄各組大鼠后肢回縮時(shí)間，連續(xù)檢測(cè)5次，檢測(cè)時(shí)間間隔為30 s。

3.3后足熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency， TWL）檢測(cè)每次MWT檢測(cè)結(jié)束30 min后，將各組大鼠放入透明的有機(jī)玻璃箱中，設(shè)定熱測(cè)痛儀并維持輻射熱強(qiáng)度，確保大鼠基礎(chǔ)值維持在15 s，熱輻射照射時(shí)間18 s。待大鼠適應(yīng)15 min后，將輻射熱光源對(duì)準(zhǔn)大鼠足底正中心位置，當(dāng)大鼠出現(xiàn)縮足時(shí)關(guān)閉輻射熱光源，否則持續(xù)照射至18 s。記錄各組大鼠縮足反射潛伏期，重復(fù)測(cè)量3次，檢測(cè)時(shí)間間隔為5 min。

3.4脊髓背角病理檢測(cè)各組大鼠深度麻醉后，經(jīng)主動(dòng)脈迅速灌注200 mL氯化鈉溶液（0.9%），接著再灌注4%多聚甲醛溶液，然后將L4～L6斷脊髓組織取出，4%多聚甲醛溶液固定，并制成5 μm厚的石蠟切片。切片于60 ℃處理4 h，經(jīng)過脫蠟、脫水、氧化、洗滌等操作后，使用六胺銀在60 ℃的水浴鍋中進(jìn)行染色，30 min左右時(shí)切片呈現(xiàn)煙草樣黃色或黑色，則染色結(jié)束，用蒸餾水洗滌。氯化金進(jìn)行調(diào)色（1～2 min），清洗后加入海波溶液，孵育1 min，用淡綠溶液進(jìn)行復(fù)染（1 min），清洗后進(jìn)行脫水，封片，最后在顯微鏡下觀察其病理變化（每張切片5個(gè)視野）。

采用改良的Campbell-Switzer銀染法觀察大鼠脊髓背角病理變化［13］。各組大鼠深度麻醉后，經(jīng)主動(dòng)脈迅速灌注200 mL氯化鈉溶液（0.9%），接著再灌注4%多聚甲醛溶液，然后將L4～L6斷脊髓組織取出，4%多聚甲醛溶液固定，并制成5 μm厚的石蠟切片。切片脫蠟后，用水沖洗，在2%氫氧化銨溶液中孵育15～20 min。水沖洗后，將切片轉(zhuǎn)移到碳酸銀溶液中，在黑暗條件下孵育40 min。樣品在1%檸檬酸中沖洗，在pH 5.0的乙酸緩沖液中浸泡。將硝酸銀和乙醛加入溶液中顯影幾分鐘。然后用清水沖洗載玻片，并放入0.5%硫代硫酸鈉溶液中幾分鐘。樣品經(jīng)過水洗和脫水后進(jìn)行蓋滑。使用數(shù)字Aperio切片掃描儀掃描染色的切片。

3.5神經(jīng)節(jié)炎癥因子檢測(cè)末次TWL檢測(cè)后，迅速處死各組大鼠，剝離背部皮膚，暴露脊髓，迅速截取第四至第六脊神經(jīng)處脊髓，并分離獲取兩側(cè)背根神經(jīng)節(jié)。脊髓、背根神經(jīng)節(jié)經(jīng)液氮處理并研磨至粉，將脊髓粉末凍存?zhèn)溆?，并取背根神?jīng)節(jié)粉末進(jìn)行勻漿，所獲勻漿液充分振蕩，離心獲取上清，按照試劑盒說明書方法檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白水平。

3.6脊髓IRAK1和TRAF6 mRNA檢測(cè)取出凍存?zhèn)溆玫募顾璺勰┥僭S，根據(jù)試劑盒說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，上機(jī)檢測(cè)IRAK1和TRAF6 mRNA表達(dá)水平。引物序列獲自文獻(xiàn)，并由廣州吉賽生物公司參與合成：GAPDH正義引物為5'-GTGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3'，反義引物為5'-GGTTCACACCCATCACAAACATG-3'；IRAK1正義引物為5'-GCTCCCAGACCCATTCTGAG-3'，反義引物為5'-CTCTGGGCTTGGCTTGATGG-3'；TRAF6正義引物為5'-GCCCATGCCGTATGAAGAGA-3'，反義引物為5'-ACTGAATGTGCAGGGGACTG-3'。

3.7脊髓IRAK1、TRAF6蛋白檢測(cè)取出凍存?zhèn)溆玫募顾璺勰┥僭S，加入含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液0.5 mL，充分裂解細(xì)胞，測(cè)定蛋白濃度后經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶溶液室溫封閉100 min，加入Ⅰ抗（GAPDH抗體、IRAK1抗體和TRAF6抗體；均1∶2 000稀釋），4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次，每次3 min。加入Ⅱ抗（1∶1 000），常溫孵育40 min，TBST清洗3次，每次3 min?；旌习l(fā)光液A和發(fā)光液B，倒于膜上，充分浸泡1 min，吸去多余液體，置于光密度掃描系統(tǒng)下，檢測(cè)各組條帶灰度值。采用ImageJ分析條帶灰度值。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1　小檗堿對(duì)脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠MWT和TWL的影響

術(shù)前2 h檢測(cè)，各組間MWT和TWL無(wú)顯著差異（>0.05）；術(shù)后3、5、7和10 d，與假手術(shù)組相比，模型組MWT和TWL顯著降低（<0.05）；與模型組相比，小檗堿（低、高劑量）組及陽(yáng)性藥物組MWT和TWL顯著升高（<0.05），且小檗堿高劑量組MWT和TWL顯著高于小檗堿低劑量組（<0.05），而陽(yáng)性藥物組較小檗堿高劑量組比較，兩組MWT和TWL無(wú)顯著差異（>0.05），見圖1。

Figure 1.　Effects of berberine on MWT and TWL in rats with spinal nerve ligation. Mean±SD. n=12. *P<0.05 vs sham operation group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs berberine low-dose group.

2　小檗堿緩解脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠脊髓背角病理?yè)p傷

假手術(shù)組只有極少的空泡樣變化，未觀察到明顯的神經(jīng)原纖維纏繞和嗜銀顆粒；模型組的神經(jīng)原纖維明顯增粗，纏繞成結(jié)，為焰狀，同時(shí)神經(jīng)元胞質(zhì)出現(xiàn)含有嗜銀顆粒的空泡，說明神經(jīng)元已壞死，且嗜銀顆粒呈現(xiàn)橢圓形或圓形，并成簇分布；相比模型組，陽(yáng)性藥物組、小檗堿高劑量組、小檗堿低劑量組神經(jīng)元纖維顯示較少的纏繞成結(jié)和少量的空泡變性，見圖2。

Figure 2.　Hexamine silver staining to observe the pathological changes of the dorsal horn of the spinal cord in rats. The scale bar=50 μm.

3　小檗堿減輕脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠神經(jīng)炎癥

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著升高（<0.05）；與模型組相比，小檗堿（低、高劑量）組及陽(yáng)性藥物組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著降低（<0.05）；與小檗堿低劑量組相比，小檗堿高劑量組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著降低（<0.05），而陽(yáng)性藥物組背根神經(jīng)節(jié)各炎癥因子含量較小檗堿高劑量組無(wú)顯著差異（>0.05），見圖3。

Figure 3.　Comparison of the contents of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the dorsal root ganglion of rats in each group. Mean±SD. n=12. *P<0.05 vs sham operation group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs berberine low-dose group.

4　小檗堿對(duì)脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠脊髓IRAK1和TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓IRAK1和TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著升高（<0.05）；與模型組相比，小檗堿（低、高劑量）組及陽(yáng)性藥物組大鼠脊髓IRAK1和TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著降低（<0.05）；與小檗堿高劑量組相比，小檗堿低劑量組大鼠脊髓IRAK1和TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著降低（<0.05），而陽(yáng)性藥物組較小檗堿高劑量組比較，脊髓IRAK1和TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異（>0.05），見圖4、5。

Figure 4.　Comparison of IRAK1 and TRAF6 mRNA expression in spinal cord of rats in each group. Mean±SD. n=12. *P<0.05 vs sham operation group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs berberine low-dose group.

Figure 5.　Comparison of IRAK1 and TRAF6 protein expressions in spinal cords of rats in each group. Mean±SD. n=12. *P<0.05 vs sham operation group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs berberine low-dose group.

討論

神經(jīng)病理性疼痛常指由機(jī)械損傷引起的神經(jīng)疼痛，目前該疾病的治療方法主要通過消除炎癥配合緩解神經(jīng)疼痛的藥物加以治療［14］。小檗堿作為中藥黃連中含量較高的化合物，價(jià)格低廉且作用廣泛，已被證實(shí)具有多種藥物活性［15］。因其具有抗菌抗病毒的功效，而被應(yīng)用于治療并緩解炎癥反應(yīng)，如小檗堿在治療腦缺血損傷等疾病時(shí)可幫助緩解炎癥反應(yīng)，阻斷電壓依賴性鉀電流，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)的作用，從而改善病情［16］。最近有研究顯示，小檗堿具有保護(hù)神經(jīng)和避免神經(jīng)受損的功效，長(zhǎng)時(shí)間服用一定劑量的小檗堿可以有效緩解突發(fā)引起的神經(jīng)損傷，改善神經(jīng)功能，且其毒副作用很低［17］。故推測(cè)小檗堿可能對(duì)機(jī)械損傷引起的神經(jīng)疼痛具有一定的緩解作用。本研究結(jié)合參考文獻(xiàn)，通過最為有效的脊神經(jīng)結(jié)扎法進(jìn)行建模，并選用治療炎癥和神經(jīng)損傷的常規(guī)藥物阿魏酸鈉作為陽(yáng)性對(duì)照開展實(shí)驗(yàn)［18-19］。

本研究通過測(cè)定MWT和TWL判斷疼痛反應(yīng)及恢復(fù)情況，結(jié)果顯示各組大鼠術(shù)前MWT和TWL無(wú)顯著差異，術(shù)后3、5、7和10 d脊神經(jīng)結(jié)扎處理的大鼠MWT和TWL顯著降低，說明脊神經(jīng)結(jié)扎引起大鼠疼痛反應(yīng)，建模成功。不同濃度的小檗堿和陽(yáng)性藥物作用后，大鼠MWT和TWL顯著升高，與已有報(bào)道一致，說明小檗堿對(duì)于神經(jīng)組織起到了保護(hù)作用，減緩了疼痛反應(yīng)。通過檢測(cè)炎性因子在背根神經(jīng)節(jié)的表達(dá)情況，顯示脊神經(jīng)結(jié)扎處理的大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子含量顯著升高，炎癥反應(yīng)加劇，而不同濃度的小檗堿和陽(yáng)性藥物作用后，大鼠背根神經(jīng)節(jié)中各炎癥因子的含量顯著降低，表明小檗堿可降低機(jī)械損傷引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

IRAK1/TRAF6通路參與炎癥反應(yīng)和神經(jīng)疼痛調(diào)控，成為研究神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)。IRAK1被證實(shí)可促進(jìn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，脊髓中IRAK1的高表達(dá)可增加炎癥因子含量，誘導(dǎo)疼痛加劇，而在神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型中，注射干擾IRAK1的siRNA抑制其表達(dá)，可顯著緩解熱痛覺和機(jī)械性過敏，減輕神經(jīng)疼痛［20-21］。TRAF6作為下游影響因子，起到調(diào)節(jié)和介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，通過靶向干擾TRAF6的表達(dá)可減輕炎癥反應(yīng)，減弱疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)。此外，TRAF6可與IRAK1結(jié)合形成復(fù)合物共同發(fā)揮作用，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)［22-23］。另外，本研究中使用的陽(yáng)性藥物-阿魏酸鈉，常用于治療偏頭痛，張愛霞等［24］研究顯示，阿魏酸鈉能抑制大鼠神經(jīng)病理性疼痛，其中的機(jī)制可能與抑制p38 MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)，然而阿魏酸鈉作為西藥，可能會(huì)引發(fā)過敏性皮疹等不良反應(yīng)。本研究中，脊神經(jīng)結(jié)扎處理的大鼠脊髓IRAK1和TRAF6 mRNA和蛋白的表達(dá)量均顯著升高，使用不同濃度的小檗堿和陽(yáng)性藥物處理后，大鼠脊髓IRAK1和TRAF6mRNA和蛋白的表達(dá)量均顯著降低，表明小檗堿及陽(yáng)性藥物均能通過抑制IRAK1/TRAF6信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而減輕其調(diào)控的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)疼痛，且兩者發(fā)揮的治療作用無(wú)顯著差異，提示小檗堿對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠的治療作用，可能還涉及其它信號(hào)通路，具有成為鎮(zhèn)痛藥的潛能。

綜上所述，小檗堿可以通過升高M(jìn)WT和TWL，并抑制IRAK1/TRAF6信號(hào)通路的途徑，減輕神經(jīng)病理性疼痛，參與影響神經(jīng)病理性疼痛大鼠的疼痛反應(yīng)及炎癥反應(yīng)。但由于天然中草藥的作用具有多途徑、多靶點(diǎn)、多機(jī)制的特性，故對(duì)于小檗堿在神經(jīng)病理性疼痛中的治療作用我們還可以進(jìn)一步去探究其作用機(jī)制，在后續(xù)工作中，我們會(huì)從神經(jīng)傳導(dǎo)入手，進(jìn)一步明確小檗堿的在神經(jīng)病理性疼痛中的作用機(jī)理。

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Effects of berberine on pain behavior and neuroinflammation mediated by IRAK1/TRAF6 signaling pathway in neuropathic pain rats

WANG Shi-zhen1， ZHANG Xiao-lei1， DING Su-peng1， GU Ling-ling2， CHEN Pei1， LI Guang-zhi1， ZHANG Meng2△

［1，，223005，；2，（），223001，］

To explore whether berberine can relieve pain in neuropathic pain rats， and to analyze the underlying mechanism of interleukin-1 receptor-associated kinase （IRAK1）/tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 （TRAF6） pathway.Sixty SD rats were randomly divided into sham operation group， spinal nerve ligation group （model group）， （low- and high-dose） berberine groups and positive drug group， with 12 rats in each group. The rats in each group were evaluated by animal behavior， and the thermal withdrawal latency （TWL） and mechanical withdraw threshold （MWT） of the hindfoot in rats were measured. The pathological changes of ipsilateral spinal cord in the affected side were observed by hexamine silver staining. The expression levels of inflammation-related factors， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β） and IL-6， in the dorsal root ganglion of rats were detected by ELISA kits. The IRAK1 and TRAF6 mRNA and protein expression levels in spinal cord were detected by RT-qPCR and Western blot， respectively.In the model group， the neuronal fibers were obviously thickened and entangled into knots， with a lot of vacuolar degeneration， and vacuoles containing silver-loving granules appeared in the cytoplasm of the nerve cells. The spinal dorsal horn injury was significantly reduced after berberine and positive drug treatment. Compared with sham operation group， the MWT and TWL in model group were significantly decreased， the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the dorsal root ganglion of rats were significantly increased， and the mRNA and protein expression levels of IRAK1 and TRAF6 in the spinal cord were significantly increased （<0.05）. Compared with model group， the MWT and TWL in （low- and high-dose） berberine groups and positive drug group were significantly increased， the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the dorsal root ganglion of rats were significantly decreased， and the mRNA and protein expression levels of IRAK1 and TRAF6 in the spinal cord were significantly decreased （<0.05）. Compared with high-dose berberine group， the MWT and TWL in low-dose berberine group were significantly decreased （<0.05）， the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the dorsal root ganglion of rats were significantly increased （<0.05）， and the mRNA and protein expression levels of IRAK1 and TRAF6 in the spinal cord were significantly increased （<0.05）. There were no significant difference in all indicators between positive drug group and high-dose berberine group （>0.05）.Berberine inhibits the neuroinflammation via IRAK1/TRAF6 pathway and attenuates the pain response in rats with neuropathic pain.

Berberine； Neuropathic pain； Interleukin-1 receptor-associated kinase； Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6

1000-4718（2022）09-1561-08

2022-04-28

2022-07-25

15861780633； E-mail： 807307144@qq.com

R285.5； R741.02

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.09.004

［基金項(xiàng)目］浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃（No. 2020358554）； 淮安市自然科學(xué)研究計(jì)劃（No. HAB202134）

（責(zé)任編輯：李淑媛，余小慧）