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    鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金體外生物相容性研究

    2022-09-20 09:17:54許東光馬春華冷玉敏楊浩
    生物化工 2022年4期
    關(guān)鍵詞:增殖率培養(yǎng)箱鎂合金

    許東光,馬春華,2,3*,冷玉敏,3,楊浩

    (1.南陽師范學(xué)院 機電工程學(xué)院,河南南陽 473061;2.重慶大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,重慶 400044;3.河南省稀土合金材料工程技術(shù)研究中心,河南南陽 473061;4.南陽師范學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院,河南南陽 473061)

    由于鎂合金在人體內(nèi)具有原位降解的能力,其生物相容性、骨傳導(dǎo)性有能力積極刺激人體新骨骼的形成,優(yōu)良的強度、延展性、抗疲勞性和生物耐腐蝕性是鎂合金作為生物降解種植體在骨科應(yīng)用中的重要前提,是一種發(fā)展?jié)摿薮蟮墓切迯?fù)金屬材料。近年來,Mg-Zn-Zr鎂合金,特別是ZK40(Mg-4Zn-0.5Zr)和ZK60(Mg-6Zn-0.5Zr)鎂合金由于具有良好的生物安全性和生物相容性受到廣大研究學(xué)者的關(guān)注。除了上述商用鎂合金系列外,研究者還開發(fā)了新的鎂合金用于骨科領(lǐng)域,包括Mg-Ca、Mg-Sr、Mg-Zn和Mg-RE合金系列[1]。

    以往的研究表明[2-8],營養(yǎng)元素(如Ca、Sr、Zn、Si和Mn)和微量無毒元素(如Zr、Nd和Y)單獨或一起添加到Mg基質(zhì)中,不會造成有害的局部組織反應(yīng),易被周圍組織吸收?;谌苎蚆C3T3-E1細(xì)胞粘附試驗結(jié)果表明,Mg-6Zn合金具有良好的體外生物相容性[9]。YU等[10]對擠壓態(tài)Mg-6Zn鎂合金的體外生物相容性進(jìn)行了評價,發(fā)現(xiàn)當(dāng)Mg-6Zn鎂合金植入兔子的腸道1、2和3周后,能夠上調(diào)體內(nèi)閉合蛋白(Occludin)和緊密連接蛋白(ZO-1)的表達(dá),并促進(jìn)周圍腸道組織緊密連接的再生。

    因此,本文通過pH測試、合金體外溶血率測試、CCK-8細(xì)胞毒性試驗以及細(xì)胞形態(tài)觀察等方法對鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金的體外生物相容性進(jìn)行了探討研究,以確定其作為可降解生物醫(yī)用金屬材料的可行性。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    本實所用基礎(chǔ)材料為洛陽邁格鎂業(yè)有限公司提供的純鎂和鍛造態(tài)鎂合金板材,純鎂板的純度為99.98%,鍛造態(tài)鎂合金板材的名義成分為Mg-5.45Zn-0.38Zr(質(zhì)量分?jǐn)?shù),%)和Mg-5.45Zn-0.38Zr-0.73Y(質(zhì)量分?jǐn)?shù),%),經(jīng)過合金配比—熔鑄—板坯—軋制生產(chǎn)工藝制成。純鎂及鍛造態(tài)鎂合金板材的實際化學(xué)成分如表1所示。

    表1 純鎂及鍛造態(tài)鎂合金的實際化學(xué)成分

    1.2 儀器與試劑

    FA1004電子天平,上海天平儀器廠;HM350A電火花線切割,深圳?,敂?shù)控有限公司;WD-9415B超聲波清洗器,北京市六一儀器廠;Nikon D3300數(shù)碼相機,日本尼康公司;DX708D金相顯微鏡,上海上光新光學(xué)科技有限公司;CMT5305微機控制電子萬能試驗機,美斯特工業(yè)系統(tǒng)(中國)有限公司;400HBS-3000數(shù)顯布氏硬度計,萊州華銀實驗儀器有限公司;D8 ADVANCE型X射線多晶衍射儀,德國布魯克公司;ZEISS Sigma 500場發(fā)射掃描電子顯微鏡,德國蔡司公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,金壇市杰瑞爾電器有限公司;CHI 660D電化學(xué)工作站,上海辰華儀器有限公司;Forcipol 2V研磨拋光機,英國科密特公司;HF90 CO2培養(yǎng)箱,力新儀器(上海)有限公司;Leica DMi8倒置相差顯微鏡,德國徠卡公司;MK3酶標(biāo)儀,美國賽默飛世爾公司;PHS-3C精密酸度計,上海大普儀器有限公司。

    無水乙醇,99.5%,天津市風(fēng)船試劑科技化工有限公司;冰乙酸,99.5%,天津市津北精細(xì)化工有限公司;模擬體液(SBF),東莞市創(chuàng)峰自動化科技有限公司;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),中國科學(xué)院細(xì)胞庫;1640細(xì)胞培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(PBS),江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;胎牛血清(FBS),美國GeminiBio公司;CCK-8檢測試劑盒,日本Dojindo公司。

    1.3 合金浸提液的制備

    鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金樣品(直徑20 mm,厚度3 mm)使用無水乙醇超聲清洗,用去離子水快速沖洗烘干,紫外燈輻照滅菌,正反面各照射30 min,然后放于無菌離心管中,保存在無菌箱中待用。以1640細(xì)胞培養(yǎng)液為浸提介質(zhì),按試樣表面積(cm2)與浸提介質(zhì)體積(mL)之比為1.25∶1.00的比例加入1640細(xì)胞培養(yǎng)液,并置于37 ℃恒溫、95%相對濕度和5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)24 h,得到合金浸提液原液[11-12]。然后加入1640培養(yǎng)基,以單純1640培養(yǎng)基為陰性對照組,以含有0.64%苯酚作為陽性對照組。合金材料均經(jīng)過121 ℃高溫高壓滅菌。

    1.4 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

    HUVEC接種于含10%的FBS、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基,在37 ℃恒溫、95%相對濕度和5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3 d更換1次溶液。當(dāng)細(xì)胞生長成單層匯合至80%時進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

    將培養(yǎng)基倒掉,加2 mL的PBS沖洗一下,加1~2 mL的0.25% EDTA-胰酶(室溫),鏡檢細(xì)胞形態(tài),待細(xì)胞變形后去除胰酶,加入含有FBS的完全培養(yǎng)基終止消化。吸管輕柔吹打,盡量讓細(xì)胞均勻分散,后取出培養(yǎng)基在1 000 r/min離心5 min;去掉上清液,加入3 mL完全培養(yǎng)基后重置,接種到3個培養(yǎng)皿中,放到37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.5 CCK-8法細(xì)胞毒性測試

    細(xì)胞懸液處理細(xì)胞24 h后,每孔加入10 μL的CCK-8試劑,混勻后在培養(yǎng)箱中孵育1 h,測定450 nm波長處的吸光值。細(xì)胞的相對增殖率(RGR)通過式(1)計算:

    式中,ODT1為實驗組材料的平均吸光度值,ODN1為陰性對照組(培養(yǎng)液+CCK-8)的平均吸光度值。

    根據(jù)ISO 10993-5:1999[11]標(biāo)準(zhǔn)要求,細(xì)胞增殖率和細(xì)胞毒性的相對關(guān)系見表2。其中,0級和1級表示沒有細(xì)胞毒性,2級表示輕度細(xì)胞毒性,3級表示中度細(xì)胞毒性,4級表示明顯細(xì)胞毒性。

    表2 細(xì)胞增殖率與細(xì)胞毒性分級的對應(yīng)關(guān)系

    1.6 細(xì)胞形態(tài)觀察

    將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中(5 000個/孔),37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),加細(xì)胞懸液之前細(xì)胞拍照記錄。分別于第1 d、4 d和7 d在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),拍照記錄。

    1.7 體外溶血率測試

    (1)浸提液的制備

    所有樣品均使用無水乙醇超聲清洗,用去離子水快速沖洗烘干,紫外燈輻照滅菌,正反面各照30 min,放于無菌離心管中,保存在無菌箱中待用。按照ISO標(biāo)準(zhǔn)制備浸提液[13]:將2種試驗樣品(鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y合金)按照樣品表面積(cm2)∶溶液體積(mL)為1.25∶1的比例分別浸泡于50 mL生理鹽水中,于(37±0.5)℃無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

    (2)體外溶血試驗

    分實驗組、陰性對照組和陽性對照組,基礎(chǔ)溶液分別為浸提液、生理鹽水及蒸餾水。3組分別加入200 μL樣品至0.6 mL的小試管中,37 ℃恒溫水浴30 min。10 mL生理鹽水與8 mL人抗凝血(含0.5 mL濃度為20 g/L的草酸鉀)混合,之后分別取200 μL加入各試管,37 ℃水浴 60 min,1 500 r/min離心 5 min,上清液在分光光度計545 nm波長處測定吸光度,每組3個平行樣本,計算平均值。根據(jù)公式(2)計算溶血率(HR):

    其中,ODT2、ODN2和ODP2分別代表實驗組、陰性對照組(生理鹽水)和陽性對照組(蒸餾水)吸光度值,溶血率小于5%表示材料無明顯溶血。

    1.8 統(tǒng)計分析

    本實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),兩組間均數(shù)比較采用t檢驗,P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 材料對模擬體液pH值的影響

    圖1為純鎂及鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金在(37±0.5)℃恒溫SBF中浸泡240 h的pH值變化曲線。從圖1中可以看到,在浸泡腐蝕的初期,所有樣品的pH值上升都較快,浸泡48 h后pH值上升到最高點,都在10以上。發(fā)生此種現(xiàn)象的主要原因是鎂合金在浸泡腐蝕過程中,其表面會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并析出大量的H2,陰極溶解會生成OH-,在模擬體液體積保持不變的情況下,體系中的OH-含量必然會越來越多,隨著浸泡腐蝕的不斷進(jìn)行,模擬體液不斷地被堿化,鎂合金腐蝕也越嚴(yán)重。這個堿化特性也決定了鎂合金在實際體液環(huán)境中表面總是更易于堿化。

    圖1 純鎂及鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y合金對SBF體系pH值變化的影響

    從圖1可以看出堿化效應(yīng)最終使得體系pH值穩(wěn)定在9.5左右。但是應(yīng)當(dāng)注意的是,當(dāng)合金植入生物體內(nèi)時,由于生物體內(nèi)體液環(huán)境是動態(tài)交換循環(huán)的,所以體內(nèi)pH值的升高將會刺激生物體內(nèi)的酸堿平衡系統(tǒng)進(jìn)行自我調(diào)節(jié),因此并不會像體外模擬實驗一樣升高到9.5。

    2.2 合金材料的溶血特性

    由表3可知,鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr合金溶血率為0.6%,鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr-Y合金溶血率為0.5%,均低于5%,表明鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金不會導(dǎo)致嚴(yán)重溶血現(xiàn)象發(fā)生。根據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)[12],鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金在體外降解過程中對紅細(xì)胞無明顯的破壞作用,具有優(yōu)良的血液相容性。

    表3 Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金溶血實驗結(jié)果(n=3)

    2.3 合金材料的體外生物相容性

    2.3.1 鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金的細(xì)胞毒性

    CCK-8法研究合金材料的細(xì)胞毒性實驗結(jié)果見表4。從表4可知,細(xì)胞在鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr(合金A)和Mg-Zn-Zr-Y(合金B(yǎng))鎂合金材料不同濃度浸提液中分別培養(yǎng)1 d、4 d 和7 d后,在同一時間節(jié)點,細(xì)胞的活性(OD值)與陰性對照組相比具有顯著性差異(P<0.05);細(xì)胞在同一濃度浸提液中培養(yǎng)不同時間的細(xì)胞活性之間差異顯著(P<0.05)。

    表4 不同組別吸光度(OD)及細(xì)胞相對增殖率(RGR)結(jié)果(n=3)

    培養(yǎng)7 d后,當(dāng)浸提液濃度為10%時,細(xì)胞的相對增殖率均大于90%,細(xì)胞毒性為0~1級;當(dāng)浸提液濃度為50%時,細(xì)胞的相對增殖率為15.1%~38.2%,細(xì)胞毒性為3~4級,呈中度和明顯細(xì)胞毒性;當(dāng)浸提液濃度為100%時,細(xì)胞的相對增殖率為13.6%~14.9%,細(xì)胞毒性為4級,呈明顯細(xì)胞毒性。

    CCK-8實驗結(jié)果表明鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金材料的浸提液濃度為10%時,對細(xì)胞的毒性較小,幾乎不影響細(xì)胞的增殖;而當(dāng)浸提液的濃度為50%或100%時,對細(xì)胞有毒性作用,且會影響細(xì)胞的增殖。

    2.3.2 鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y合金對細(xì)胞形態(tài)的影響

    圖2為HUVEC在不同濃度(100%、50%、10%)鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr合金浸提液和對照組中培養(yǎng)1 d、4 d和7 d后在倒置相差顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)。圖3為HUVEC在不同濃度(100%、50%、10%)鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr-Y合金浸提液和對照組中培養(yǎng)1 d、4 d、7 d后在倒置相差顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)。

    圖2 不同濃度Mg-Zn-Zr浸提液對HUVEC細(xì)胞形貌的影響(10×)

    圖3 不同濃度Mg-Zn-Zr-Y合金浸提液對HUVEC細(xì)胞形貌的影響(10×)

    從圖2和圖3可以看出,培養(yǎng)第1 d,細(xì)胞密度低,50%Mg-Zn-Zr浸提液和100%、50%Mg-Zn-Zr-Y浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,其他濃度浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞幾乎全部貼附在培養(yǎng)板的底部,細(xì)胞呈現(xiàn)扁平梭形,輪廓清晰;培養(yǎng)第4 d,細(xì)胞增殖迅速,形態(tài)正常;培養(yǎng)第7 d,100%和50%Mg-Zn-Zr-Y浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,10%濃度浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量顯著增加,成團簇增長。然而,在同一時間節(jié)點不同組的細(xì)胞形態(tài)與陰性對照組無明顯差異。

    3 結(jié)論

    本文研究了鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金對模擬體液pH值及其浸提液對HUVEC細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金在模擬體液中的腐蝕速度均高于純鎂的腐蝕速度;鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y合金不會導(dǎo)致嚴(yán)重溶血,體外降解過程中對紅細(xì)胞無明顯的破壞作用,具有優(yōu)良的血液相容性;鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金材料的浸提液濃度為10%時,幾乎不影響細(xì)胞增殖,而當(dāng)浸提液的濃度為50%或100%時,對細(xì)胞有一定的毒性作用,會影響細(xì)胞增殖;在100%和50%Mg-Zn-Zr-Y浸提液培養(yǎng)7 d后,HUVEC出現(xiàn)死亡,10%濃度浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量則顯著增加,成團簇增長。

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