酯化酶用于酒廠黃水酸性成分再利用的研究進(jìn)展

江曉欽,唐羽翼，張立，黃張樂(lè)，番自琰，韓磊，梅冰*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 建筑工程學(xué)院，云南昆明 650000；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，云南昆明 650000；3.四川溢陽(yáng)環(huán)保設(shè)備技術(shù)工程有限公司，四川成都 610041）

白酒是我國(guó)特有的一種蒸餾酒，由原料中的淀粉以及糖類在酒曲的發(fā)酵作用下生成。黃水則是在白酒發(fā)酵過(guò)程中，沉積在窖底的一種具有高COD、BOD的棕黃色、黏稠的有機(jī)廢水。黃水中含有較多的酸、酯、醇、醛等香味物質(zhì)，特別是有機(jī)酸含量豐富。但黃水雜味較重，且蛋白質(zhì)、菌體自溶物及果膠質(zhì)含量較多。

工業(yè)上處理黃水主要是用清潔水對(duì)黃水進(jìn)行稀釋，并與生產(chǎn)過(guò)程中的其他高濃度有機(jī)廢水混合后進(jìn)行統(tǒng)一處理。后續(xù)的處理工藝主要是利用厭氧處理工藝降低COD和BOD，再用好氧處理工藝去除磷酸鹽和氨等。已應(yīng)用于工程實(shí)踐且取得較好效果的高濃度有機(jī)廢水工程治理措施有“水解酸化 +IC+CASS+BAF”工藝[1]、“ABR+SBR”工藝[2]、“UASB-SBR-陶粒過(guò)濾”工藝[3]、“AF-ABR-氣浮-CASS”工藝[4]等，均可實(shí)現(xiàn)廢水的達(dá)標(biāo)排放。

但以上處理方式存在一定的水資源浪費(fèi)以及處理成本過(guò)高的問(wèn)題。因此，如能對(duì)黃水中的酸性成分進(jìn)行有效利用，對(duì)于企業(yè)而言，在減少高酸廢水的處理成本的同時(shí)還可以避免資源浪費(fèi)，提高收益，意義重大。

1 黃水中的酸性成分

黃水是酒廠在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的高酸液體，含有大量的脂肪酸，直接排放將對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。研究發(fā)現(xiàn)酯化酶可將黃水中的酸轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯，可用于酒的調(diào)香及生產(chǎn)。黃水中其他的有機(jī)成分為小分子糖、酸、醇和脂類物質(zhì)，其中主要的酸性成分有乳酸、甲酸、己酸和乙酸，不同酒廠的黃水中酸性成分的含量有一定差異。盛杰等[5]對(duì)江蘇某酒業(yè)生產(chǎn)的黃水進(jìn)行分析，結(jié)果表明其中乙酸含量最多，為7 375.8 mg/L，其次為甲酸。從黃水中豐富的有機(jī)酸性成分來(lái)看，將其酸性成分進(jìn)行再利用，可以有效降低黃水中的COD和BOD，從而降低酒廠廢水處理難度與處理費(fèi)用。

2 酯化酶對(duì)黃水中酸性成分資源化的利用

濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的主要液態(tài)副產(chǎn)物為黃水，不僅含有豐富的濃香型白酒風(fēng)味（前體）物質(zhì)（如醇、醛、酸和酯類等），還含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如淀粉、還原糖、酵母自溶物等），以及大量經(jīng)長(zhǎng)期馴化的釀造微生物。當(dāng)前，黃水一方面可用于人工窖泥生產(chǎn)、養(yǎng)窖護(hù)窖，另一方面可利用黃水中豐富的風(fēng)味（前體）物質(zhì)提高原酒品質(zhì)或生產(chǎn)新型白酒。將復(fù)合生物制劑應(yīng)用在濃香型白酒黃水酯化中，反應(yīng)后丁酸乙酯及己酸乙酯含量均大幅上升；利用紅曲霉或酵母制成的各種酯化酶粗酶制劑對(duì)黃水進(jìn)行酯化，黃水中的酯含量大幅上升，香味物質(zhì)含量高[6-8]。

酯化黃水酸性成分的酯化酶主要包括脂肪酶、酯合成酶、磷酸酯酶。酯化酶分為胞外酶與胞內(nèi)酶，胞外酶制備粗酶液可直接進(jìn)行離心取上清，胞內(nèi)酶則需進(jìn)行細(xì)胞破碎再離心取上清。通過(guò)酯化酶的作用，黃水中的乙酸、己酸、乳酸以及醇類轉(zhuǎn)化為乙酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯等白酒中的主體香味成分。應(yīng)用于黃水酸性成分處理的酯化酶一般來(lái)源于釀酒大曲中具有較強(qiáng)產(chǎn)酯化酶能力的菌株。對(duì)菌株產(chǎn)酯化酶的最適條件進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)最大酶活力值來(lái)衡量該菌株的酯化能力。細(xì)菌、真菌、酵母都可具有產(chǎn)酯化酶能力，侯小歌等[6]發(fā)現(xiàn)一部分放線菌也具有產(chǎn)酯化酶能力。目前的研究表明，具有較強(qiáng)酯化能力的菌株主要為紅曲霉屬（Monascusspp.），如血紅紅曲霉（Monascus sanguineus）X1，其酯化酶活力可達(dá)315.19 U/mL；紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018酯化酶酶活最大可達(dá)919.12 U/mL[7-8]。此外紅曲霉Hm、紅曲霉MZ-1、紅曲霉H-7、紫色紅曲霉LZLJ2103、紫色紅曲霉YJX-8、紫色紅曲霉EM-56、黑曲霉（Aspergillus niger）T206、黃曲霉（Aspergillus flavus）、、橙色紅曲霉（Monascus apelsin）、青鏈霉菌（Streptomyces lividans）、藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces azureus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、傘 狀 毛 霉（Lichtheimia corymbifera）、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、伯克霍爾德氏菌（Burkholderiasp.）X10、橫 梗 霉（Lichtheimia）HSM、地衣芽胞桿菌（Bacilluslicheniformissp.）G2、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）都具有一定的酯化能力。

經(jīng)過(guò)酯化酶催化轉(zhuǎn)化后生成的黃水酯化液，其COD和BOD含量相比黃水可下降80%左右[7-8]，能直接進(jìn)行后續(xù)的生化處理，無(wú)需稀釋，節(jié)省成本。酯化液中含有大量的脂類及微生物，在提高成品酒品質(zhì)的同時(shí)還可以縮短釀造白酒的發(fā)酵周期。因此，酯化液可應(yīng)用于釀酒的主發(fā)酵期后，與低度酒尾按一定比例配合灌入酒窖內(nèi)進(jìn)行二次發(fā)酵，或在蒸餾丟糟酒前倒入底鍋內(nèi)串蒸。酯化液也可直接進(jìn)行脫色制成調(diào)味酒。

3 酯化酶催化活性的影響因素

酯化酶對(duì)黃水中酸性成分的催化活性受到酶的自身活力、酶的濃度、底物濃度、溫度、pH、外源物質(zhì)等諸多因素的影響。

3.1 底物濃度

在生化反應(yīng)中，若酶的濃度為定值，底物的起始濃度較低時(shí)，酶促反應(yīng)速度與底物濃度成正比；當(dāng)初始底物濃度較高時(shí)，提高底物濃度對(duì)加快反應(yīng)速率的效果降低；當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到酶的最大處理極限時(shí)，提高底物濃度對(duì)反應(yīng)速率沒(méi)有影響。唐取來(lái)等[9]的研究表明，當(dāng)?shù)孜镏腥樗豳|(zhì)量濃度較低時(shí)（低于8 g/L)，大曲中的酯化酶表現(xiàn)為合成作用，催化乙酸乙酯的合成；隨乳酸質(zhì)量濃度的增加，大曲酯化酶的合成作用減弱；當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度較高時(shí)（高于16 g/L），酯化酶表現(xiàn)為水解作用，將酯分解為相應(yīng)酸和醇，可能與酶的活性中心改變及底物的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用有關(guān)。張浩等[10]研究了己酸、乳酸、丁酸、乙酸的濃度對(duì)酯化酶催化的影響，結(jié)果表明，當(dāng)己酸、乳酸、丁酸、乙酸的濃度分別為8 g/L、1 g/L、9 g/L和12 g/L時(shí)，大曲酯化酶催化效果最好。

3.2 酶濃度

酶濃度的影響主要體現(xiàn)在菌株的接種量對(duì)酶催化轉(zhuǎn)化黃水中酸性成分能力的影響。當(dāng)菌株的接種量過(guò)低時(shí)，菌體數(shù)量少，催化能力較弱；當(dāng)接種量過(guò)多時(shí)，則會(huì)快速消耗底物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并產(chǎn)生抑制酯化酶活力的代謝物。研究表明，傘枝犁頭霉的最適接種量為4%，紅曲霉H-7為1.5%，紫色紅曲霉FBKL3.0018為10%，傘狀毛霉為5%，紅曲霉Hm為10%[11-13]。

3.3 溫度

溫度對(duì)酯化酶的催化效果也具有一定影響。溫度與酯化酶本身基團(tuán)的解離或者與底物的結(jié)合能力等具有一定相關(guān)性。據(jù)研究，酯化酶催化合成能力隨溫度升高而增強(qiáng)，但溫度過(guò)高時(shí)，酯化酶活力逐漸下降并最終失活，如黑曲霉酯化催化的最適溫度為30～36 ℃；紅曲霉酯化酶催化作用的最適溫度為30～40 ℃；傘狀毛霉和卷枝毛霉酯化酶催化作用的最適溫度為30 ℃；伯克霍爾德氏菌X10酯化酶催化作用的最適溫度為35 ℃；傘枝犁頭霉酯化酶催化作用的最適溫度為34 ℃；葡萄球菌酯化酶催化作用的最適溫度為37 ℃[12-16]。

3.4 pH

pH會(huì)對(duì)酯化酶的自身活性以及底物結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而影響酯化酶的催化能力。紅曲霉酯化酶催化作用的最適pH為4.5～6.5；傘狀毛霉酯化酶催化作用的最適pH為3.0；卷枝毛霉酯化酶催化作用的最適pH為3.5；伯克霍爾德氏菌X10酯化酶催化作用的最適 pH 為 6.5[11-15]。

3.5 外源物質(zhì)

外源物質(zhì)主要分為激活劑與抑制劑。葡萄糖可以作為速效碳源促進(jìn)紅曲霉產(chǎn)酯化酶能力；新鮮酵母破壁液對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶具有誘導(dǎo)作用；乙醇與乳酸對(duì)酯化催化也具有促進(jìn)效果；無(wú)水硫酸鈉可以通過(guò)吸水作用，使酶促反應(yīng)平衡向右，提高酯化催化活力。胡娜等[11]發(fā)現(xiàn)低濃度的乙酸乙酯對(duì)酯化酶酶活力具有抑制作用，而當(dāng)其含量為30%時(shí)，對(duì)酶活力起促進(jìn)作用；低濃度K+、Ca2+對(duì)酯化酶催化反應(yīng)有促進(jìn)作用，而 Fe2+、Na+、Mn2+、Mg2+、Li+、Zn2+對(duì)酯化酶催化反應(yīng)有抑制作用；表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）等對(duì)酯化酶活力也具有抑制作用[11,16-17]。

4 酯化酶用于黃水處理的效益分析

（1）企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。黃水中添加酯化酶可大幅降低釀酒廢水中COD含量，節(jié)省稀釋用水費(fèi)用，減少電力支出、設(shè)備損耗等，并一定程度上減少企業(yè)的排污費(fèi)；同時(shí)酯化液可以用于二次發(fā)酵以及串蒸，減少制酒用曲量的同時(shí)提高酒的品質(zhì)，增加收益。蔣學(xué)劍等[18]研究發(fā)現(xiàn)黃漿水用量40%、酒精度30%、己酸含量0.8%、酯化酶用量0.1%，每甑底鍋串蒸酯化液用量20 L，優(yōu)級(jí)品率、一級(jí)品率均提高35%；在公司中試車間推廣使用黃水酯化液串蒸，每年可凈增加效益456.75萬(wàn)元，達(dá)到了降低生產(chǎn)成本、增加經(jīng)濟(jì)效益的效果。

（2）酯化液的直接經(jīng)濟(jì)效益。劉賓等[19]研究表明，在乙醇體積含量為10%、己酸添加量1.5%、酯化酶用量7%、溫度30 ℃的條件下酯化7 d，濃香型白酒中的主要香味物質(zhì)——己酸乙酯的含量大幅度提升，由91.9 mg/L增加至2 746.6 mg/L，可以生產(chǎn)出以濃香型白酒主體香味物質(zhì)為主的高質(zhì)量酯化液。

（3）間接減少制酒成本。王曉丹等[20]利用1株從濃香型大曲中分離篩選得到的合成己酸乙酯能力較強(qiáng)的酯化酶生產(chǎn)菌——紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018，對(duì)其產(chǎn)酯化酶條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，確定該菌株較理想的發(fā)酵產(chǎn)酶條件，將該條件下所產(chǎn)的粗酶制劑用于濃香型大曲酒的生產(chǎn)，減少了用曲量，提高了原酒產(chǎn)量和質(zhì)量。束成忠等[21]研究表明，酯化酶按投料量的0.5%加入，按原加曲量的10%減曲，每1 000 kg原料效益增加304.08元。若每天投入10.8 t原料，每月可多實(shí)現(xiàn)效益98 521.92元，全年按10個(gè)月計(jì)算，每年可增加效益985 219.20元。且發(fā)酵期按正常發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)試驗(yàn)，生產(chǎn)工藝不用改變，使用酯化酶，既提高了酒質(zhì)，又降低了生產(chǎn)成本，帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

（4）環(huán)境生態(tài)效益。酯化酶應(yīng)用于黃水中生成酯化液，通過(guò)對(duì)黃水中酸性成分的有效利用，對(duì)于企業(yè)而言得到直接的經(jīng)濟(jì)效益，此外還極大地減少了黃水對(duì)環(huán)境的危害，取得一定程度上的環(huán)境效益和社會(huì)效益。環(huán)境效益主要是利用釀酒副產(chǎn)物發(fā)酵可以使COD排放量得到控制，減少電力支出、設(shè)備損耗，減少人工支出，減少環(huán)境污染等。如劉子紅等[22]的研究結(jié)果表明，科學(xué)利用黃水有效成分可以降低10%環(huán)保處理費(fèi)用。社會(huì)效益主要是循環(huán)經(jīng)濟(jì)的利用，企業(yè)減少了大量的環(huán)境污染，樹立負(fù)責(zé)任企業(yè)形象，提升品牌形象，實(shí)現(xiàn)了資源的循環(huán)利用與綠色經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

5 展望

白酒釀造中酯化酶技術(shù)的應(yīng)用是中國(guó)白酒工業(yè)的一項(xiàng)重大創(chuàng)新成果，該技術(shù)在濃香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用極大地提高了出酒率和優(yōu)質(zhì)酒率；突出了濃香型白酒己酸乙酯的主體香；酒體協(xié)調(diào)，促進(jìn)了酯化反應(yīng)；能夠在較高的酸度下正常發(fā)酵，利于酒體“潔凈”；較好地解決了酒質(zhì)和出酒率的矛盾；有利于工藝穩(wěn)定，提高生產(chǎn)效率；產(chǎn)酒醇甜，賦予成品酒良好的風(fēng)味。

酯化酶使黃水酸性成分得到二次利用，降低酒廠廢水的處理難度，提高酒的品質(zhì)與出酒率，為企業(yè)產(chǎn)生直接的經(jīng)濟(jì)效益。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，在最優(yōu)條件下酯化酶的催化反應(yīng)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，且無(wú)需改變釀酒的生產(chǎn)工藝及設(shè)備，利于企業(yè)的推廣。從經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境效益以及社會(huì)效益角度來(lái)看，酯化酶應(yīng)用于酒廠黃水處理具有較好前景。

白酒生產(chǎn)過(guò)程中相關(guān)的因素很多，與白酒質(zhì)量相關(guān)的因素也很多，所以在應(yīng)用時(shí)一定要對(duì)酯化菌株及其性質(zhì)和生產(chǎn)進(jìn)行細(xì)致的研究。在實(shí)際生產(chǎn)中合理利用多種方法，加強(qiáng)產(chǎn)酯微生物的資源挖掘、酯化酶純度提高、酒類酯類物質(zhì)比例協(xié)調(diào)性調(diào)節(jié)及復(fù)合生物酯化酶制劑開發(fā)工作，以期進(jìn)一步提高對(duì)黃水中酸性成分的利用，提高白酒品質(zhì)。

目前的研究對(duì)新型高效的產(chǎn)酯化酶的菌株研究較少，且對(duì)菌株的最適產(chǎn)酯條件研究還不夠系統(tǒng)完善，酯化酶商業(yè)化產(chǎn)品尚缺。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)高效產(chǎn)酯化酶菌株的研究，并對(duì)酯化酶的生產(chǎn)和保存技術(shù)進(jìn)行研究，以推動(dòng)其商業(yè)化進(jìn)程。