中藥材中玉米赤霉烯酮毒素污染現(xiàn)狀及其脫毒研究進(jìn)展

鄧 桃，袁青松，周 濤，江維克*，肖承鴻，楊昌貴，郭蘭萍

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州貴陽 550025；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700)

隨著中藥在重大疾病、常見病、疑難雜癥的防治上取得巨大的成果，中藥材的質(zhì)量及用藥安全也越發(fā)受到重視。中藥材在種植、采收、運(yùn)輸和貯藏過程中，因方法不當(dāng)而發(fā)生真菌生長(zhǎng)(霉變)和毒素積累，直接影響了中藥的質(zhì)量與安全。玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)又稱為F-2毒素，由Stob等于1962年首次從赤霉病的玉米中分離得到，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為一種酚的二羥基苯酸內(nèi)脂結(jié)構(gòu)，是一種主要由鐮刀菌屬菌株產(chǎn)生的真菌毒素。ZEN及代謝產(chǎn)物具有雌激素樣效應(yīng)、致癌性以及多種毒性，人類食用被其污染的食物會(huì)導(dǎo)致肝癌、睪丸癌、食道癌及青春期早熟等疾病；動(dòng)物食用后則會(huì)影響繁殖機(jī)能，導(dǎo)致其繁殖機(jī)能紊亂。為保證食用安全，ZEN的膳食允許攝入量及其在各類產(chǎn)品中的含量也被世界上多個(gè)組織和國家進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定，GB 2761—2011《糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定供人類使用的谷物及其制品中ZEN的最高水平是60 μg/kg，2020版《中國藥典》也規(guī)定薏苡仁中ZEN不得超過500 μg/kg。

該研究對(duì)中藥材中ZEN污染現(xiàn)狀、ZEN脫毒方法以及ZEN生物降解機(jī)制等相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了綜述，以期為預(yù)防中藥材的ZEN污染及其脫毒研究提供參考。

1 中藥材中ZEN污染現(xiàn)狀

近年來，隨著國內(nèi)外對(duì)中藥材安全關(guān)注度的提高，中藥材中ZEN污染的報(bào)道也逐漸增多，不同藥用部位、不同基質(zhì)的中藥材中ZEN污染情況不盡相同，筆者歸納整理了已報(bào)道的不同藥用部位中藥材中ZEN污染情況(表1)。由表1可知，ZEN在根及根莖類、果實(shí)種子類中藥材中污染較為廣泛，在富含淀粉的根及根莖類藥材中ZEN被檢出的最大值為4.53 μg/kg，最小值為0.04 μg/kg，在富含油脂類的果實(shí)種子類中藥材中ZEN污染最為嚴(yán)重，被檢出的最大值為325.00 μg/kg；葉、全草類中藥材污染報(bào)道較少，ZEN被檢出值為0.06～29.98 μg/kg；花類藥材中尚未發(fā)現(xiàn)ZEN的污染。ZEN在薏苡仁中污染最為嚴(yán)重，申紅紅等檢測(cè)了薏苡仁、白術(shù)、板藍(lán)根等25個(gè)中藥材及人參健脾丸、黃連上清丸等5個(gè)中藥制劑中的ZEN，結(jié)果8個(gè)薏苡仁樣品均含有ZEN，且其中3個(gè)超過了60 μg/kg。毛丹等對(duì)薏苡仁、麥芽、綠豆3種中藥材共11批樣品中的ZEN進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果4批薏苡仁均檢出ZEN，結(jié)果分別為325、30、268和178 μg/kg。張曉飛等檢測(cè)了薏苡仁、山楂、神曲、麥芽等107個(gè)中藥樣品中的ZEN，有8個(gè)陽性樣品均為薏苡仁，ZEN的含量在37.1～229.2 μg/kg。

除此之外，Gray等在不同來源的人參、西洋參根的提取物中檢出ZEN，其中人參根提取物中最高檢出量為11.7 mg/kg，西洋參根的提取物中最高檢出量為2.6 mg/kg。陳重均在黃芪顆粒劑中檢測(cè)到1.63 μg/kg的ZEN。

2 ZEN的脫毒方法

ZEN污染廣、毒性強(qiáng)、危害大，如何有效地預(yù)防和清除ZEN污染是研究的熱點(diǎn)。

物理法主要包括高溫處理、輻照處理、物理吸附等。高溫處理是將受ZEN污染的糧食、谷物等在110～160 ℃的高溫下烘烤，使產(chǎn)生ZEN的菌被殺死。這種方法對(duì)ZEN的作用不大，且破壞營養(yǎng)價(jià)值，現(xiàn)在已經(jīng)不采用。輻照法是指用電離輻射線破壞物質(zhì)結(jié)構(gòu)，促使物質(zhì)發(fā)生一系列物理化學(xué)變化，輻照處理后產(chǎn)物的組成、性質(zhì)以及毒理等尚缺乏研究。物理吸附法是指采用蒙脫石、活性炭、葡聚糖等吸附劑，利用分子間作用力、化學(xué)鍵等作用，使吸附劑與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合在一起，達(dá)到去除的目的；該方法在吸附毒素的同時(shí)對(duì)營養(yǎng)成分的損失也很大，所以目前已很少采用。

表1 不同種類中藥材中ZEN污染情況Table 1 ZEN pollution in different types of Chinese medicinal materials

化學(xué)法是通過ZEN與堿、氧化劑等的作用，破壞毒素的活性基團(tuán)，使其轉(zhuǎn)化成其他無毒或低毒的物質(zhì)。主要包括臭氧處理、雙氧水處理、硫酸鈉浸泡、維生素E處理法等。Xu等研究發(fā)現(xiàn)，臭氧能去除玉米粉中ZEN，并預(yù)測(cè)了臭氧處理后ZEN的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化。但化學(xué)法可能造成營養(yǎng)成分的破壞或化學(xué)試劑殘留，甚至出現(xiàn)二次污染等不確定的危害，所以目前也很少采用化學(xué)法對(duì)ZEN進(jìn)行脫毒。

微生物吸附法。微生物吸附是指其菌體細(xì)胞或者提取的大分子化合物與毒素分子結(jié)合，產(chǎn)生吸附作用，從而減輕或消除ZEN的毒性。研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞壁能很好地吸附ZEN，榮迪發(fā)現(xiàn)從酵母細(xì)胞壁中提取的酵母β-D-葡聚糖及其酯化制劑可以吸附部分ZEN。Krifaton等研究顯示，釀酒酵母細(xì)胞壁中的β-D-葡聚糖類化合物在吸附ZEN時(shí)發(fā)揮主要作用。

微生物降解法。微生物降解法是利用微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物或者酶來破壞毒素分子，降解成無毒的產(chǎn)物。目前，關(guān)于ZEN生物降解已取得了一定的成果，發(fā)現(xiàn)了一些能降解ZEN的細(xì)菌、真菌及降解酶(表2)。潘麗婷等從麥粒中篩選出一株解淀粉芽孢桿菌對(duì)ZEN的降解能力高達(dá)95%。楊凡等從豬糞便中篩選出枯草芽孢桿菌，其ZEN分解率達(dá)95%。Molnar等從白蟻的尾腸里分離到了一株酵母菌可以將ZEN降解為無毒的產(chǎn)物。Takahashi-Ando等從粉紅黏帚霉中分離純化出一種水解酶ZHD101，可以將ZEN轉(zhuǎn)化為無雌激素活性的產(chǎn)物。Yu等從不動(dòng)桿菌SM04中克隆了一個(gè)過氧化物酶(Prx)基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行過表達(dá)，該酶在過氧化氫存在下能很好地消除ZEN的毒性。

通過NCBI可以下載到24種能降解ZEN的核酸序列，用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)，結(jié)果顯示：芽孢桿菌屬被報(bào)道較多的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌均是能高效降解ZEN的益生菌。

表2 ZEN生物脫毒法Table 2 ZEN biological detoxification method

圖1 ZEN降解菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of ZEN-degrading bacteria

3 ZEN的生物降解機(jī)制

ZEN主要通過4個(gè)途徑進(jìn)行降解，包括C-6′-酮羰基的還原、C-2/C-4-OH的衍生化、內(nèi)酯環(huán)的裂解以及二羥基苯環(huán)的裂解等。

ZEN內(nèi)酯環(huán)C-6′-酮羰基位置上加氫生成玉米赤霉烯醇(zearalenol，ZEL)，包括α-ZEL和β-ZEL兩個(gè)異構(gòu)體(圖2)。研究發(fā)現(xiàn)，灰色鏈霉菌、和班尼毛霉、根霉及酵母等菌株可將ZEN轉(zhuǎn)化為α-ZEL與β-ZEL。但α-ZEL與β-ZEL均具有雌激素毒性，且α-ZEL的雌激素毒性比ZEN要大很多，因此視為無效脫毒。

(圖3) Brodehl等研究發(fā)現(xiàn)，米曲霉和根霉能將ZEN轉(zhuǎn)化為各種代謝物，包括ZEN-4-β-D-葡萄糖苷、ZEN-4-硫酸鹽等霉菌毒素綴合物。但有研究發(fā)現(xiàn)，ZEN的C-2/C-4-OH衍生化的產(chǎn)物攝入體內(nèi)后，由于體內(nèi)的水解酶作用，有可能脫去衍生基團(tuán)，從而釋放出原型ZEN，具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。

ZEN分子中的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，裂解有3種方式(圖4)。Takahashi-Ando等成功將分離純化出的堿性水解酶ZHD101克隆到異源宿主(裂殖酵母和大腸桿菌)中，含有該基因的大腸桿菌可在24 h內(nèi)將ZEN、α-ZEL和β-ZEL降解為無毒產(chǎn)物。其脫毒方式為先斷裂ZEN的內(nèi)酯鍵，使其環(huán)型結(jié)構(gòu)打開，然后自發(fā)脫羧形成代謝產(chǎn)物1-(3，5-二羥苯基)-10′-羥基-1′反式-十一碳烯-6′-酮，代謝途徑如圖4中a所示。Vekiru等通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和核磁共振等手段證明了毛孢酵母菌將ZEN降解為一種含羧基和羥基的新型降解產(chǎn)物，其代謝路徑如圖4中b所示，C-6′-酮羰基加一個(gè)氧原子形成一個(gè)新的內(nèi)酯，然后在水解酶的作用下水解生成無毒降解產(chǎn)物。黃哲篩選出一株枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的酶作用于ZEN上C-6′-酮羰基后，使其脫去一分子碳和一分子氧，從而形成開環(huán)的降解產(chǎn)物(圖4中c所示)。破壞ZEN內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的降解產(chǎn)物沒有類雌激素效應(yīng)與生殖毒性，因此內(nèi)酯環(huán)裂解是目前研究的較為有效的脫毒方式。

(圖5) 二羥基苯環(huán)的裂解目前還處于研究階段，Yu等篩選出不動(dòng)桿菌SM04的氧化酶組分和過氧化物酶組分可高效降解ZEN，得到無苯環(huán)、含羧基結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物ZEN-1、ZEN-2。Sun等從發(fā)酵大豆中分離的黑曲霉菌株FS10可高效降解ZEN，并推測(cè)ZEN的苯環(huán)結(jié)構(gòu)可能被破壞。破壞ZEN的二羥基苯環(huán)，使其降解成小分子物質(zhì)，無論是從揭示新降解途徑還是發(fā)現(xiàn)新ZEN降解酶方面，都為ZEN的生物脫毒提供了新的方向。

注：a=Candida tropicalis、Rhizopus stolonifer、Strephtomyces、Mucor bainieri圖2 C-6′-酮羰基的還原Fig.2 C-6′-keto carbonyl reduction

注：a=Thamnidium elegans、Mucor bainieri、Rhizopus spp.、Aspergillus spp.圖3 C-2/C-4-OH衍生化Fig.3 C-2/C-4-OH derivatization

注：a=Clonostachysor;b=Trichosporon;c=Bacillus圖4 內(nèi)酯環(huán)裂解Fig.4 Lactone ring cleavage

圖5 ZEN二羥基苯環(huán)的裂解Fig.5 Cleavage of ZEN dihydroxybenzene ring

4 總結(jié)與展望

玉米赤霉烯酮(ZEN)類真菌毒素污染廣泛，是人們身體健康的潛在威脅。如何有效預(yù)防和清除ZEN，已經(jīng)受到重視，并取得了一定的效果和成績(jī)。傳統(tǒng)的物理、化學(xué)脫毒法均有其不足，生物脫毒法成為了研究的熱點(diǎn)，針對(duì)ZEN，已篩選出了一些細(xì)菌、真菌及降解酶，并對(duì)ZEN的生物降解途徑有了初步的認(rèn)識(shí)，其中以裂解ZEN的內(nèi)酯環(huán)和二羥基苯環(huán)途徑最為有效，顯示出利用生物降解ZEN的巨大潛力，為探索預(yù)防和清除真菌毒素污染提供了方向和范式。但是，真正能夠應(yīng)用于中藥材脫毒的微生物或者酶仍然很有限，部分微生物存在降解能力不穩(wěn)定、易退化、本身具有毒副作用等問題。

基于文獻(xiàn)報(bào)道，筆者認(rèn)為應(yīng)該從以下方面進(jìn)行深入研究：①需要加大分離、篩選具有ZEN降解能力益生菌的力度，發(fā)現(xiàn)篩選益生菌的規(guī)律。②深入研究ZEN降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及降解機(jī)理，并結(jié)合分子生物學(xué)、組學(xué)原理，探索ZEN降解的生物途徑、關(guān)鍵酶及其基因，為后續(xù)利用生物技術(shù)清除ZEN的污染做好準(zhǔn)備。目前，對(duì)降解產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及降解機(jī)理研究還不夠深入，有些降解產(chǎn)物如α-ZEL、β-ZEL等仍具有雌激素毒性作用，有些降解方法如C-2/C-4-OH衍生化存在脫去衍生基團(tuán)釋放出原型ZEN的風(fēng)險(xiǎn)；目前真正有ZEN降解活性的酶就只有ZHD101及其同源性95%以上的同源物，除此之外，ZEN降解酶還存在分離純化過程繁雜、產(chǎn)酶量低、酶活不穩(wěn)定、酶作用條件苛刻等問題。③進(jìn)一步了解中藥材污染的途徑和污染類型，以及中藥材提取物中ZEN污染的情況；加強(qiáng)ZEN等毒素的檢測(cè)方法研究，提高檢測(cè)方法的適應(yīng)性和降低檢測(cè)成本，制定根及根莖類、果實(shí)種子類中藥材中ZEN的檢測(cè)方法和限度，提升中藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。④結(jié)合中藥材的貯藏等環(huán)節(jié)，研制清除ZEN污染的制劑，減少ZEN等污染造成的損失。

總之，一方面中藥材的真菌毒素污染廣泛存在，是影響中藥材質(zhì)量和應(yīng)用的巨大隱患，另一方面預(yù)防和清除真菌毒素污染蘊(yùn)含有許多的科學(xué)問題和巨大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)價(jià)值，值得投入更多的精力研究。