仿制托吡司他片的制備及與原研藥的溶出度一致性評價

劉元芬

江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院，南京 211800

痛風是一種因體內(nèi)嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄減少所引起的晶體性關節(jié)炎，臨床表現(xiàn)為高尿酸血癥和尿酸鹽結(jié)晶沉積所致的特征性急性關節(jié)炎［1］。高尿酸血癥與痛風密不可分，高尿酸血癥是痛風主要的生化基礎［2］。托吡司他（topiroxostat）化學名為5-（2-氰基-4-吡啶基）-3-（4-吡啶基）-1，2，4-三唑，于2013年6月在日本批準上市［3］。該藥與目前其他黃嘌呤氧化酶（XOR）抑制劑藥物如別嘌呤醇和非布司他機制不同，托吡司他具有非嘌呤結(jié)構(gòu)，通過與XOR 溶劑通道的氨基酸殘基相互作用并形成共價鍵，抑制形成尿酸前嘌呤分解代謝的最后2個反應，減少尿酸的生成，對氧化型和還原型的氧化酶抑制劑均有抑制作用［4-6］，因此具有降低尿酸作用強、不良反應少、安全性好等優(yōu)點。

目前托吡司他片尚未在我國上市銷售，按照《藥品注冊管理辦法》分類，屬新藥3.1類，托吡司他含量測定方法、溶出度一致性的研究對其上市進行臨床試驗非常重要［7］。因此本研究仿照原研制劑自制托吡司他片，并采用高效液相色譜（HPLC）法測定自制仿制片與原研片中托吡司他的含量，同時建立托吡司他溶出度測定方法學，比較原研藥和自制片劑在50 g·L－1十 二 烷 基 硫 酸 鈉（SDS）水 溶 液、0.1 mol·L－1鹽酸 溶液、10 g·L－1SDS 醋酸溶 液（p H4.0）以及p H6.8磷酸鹽緩沖液（PBS）4種溶出介質(zhì)中的溶出度，采用相似因子（f2）評價原研藥片和自制仿制藥片的溶出曲線相似度，為后續(xù)的質(zhì)量控制及體內(nèi)研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

20AD 高效液相色譜儀，島津SPD-20A 檢測器和UV-1780紫外分光光度計，均購自日本島津公司；AE-240電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒公司）；ZRS-8智能溶出儀（天津大學無線電廠）。

1.2 試藥

乳糖（上海華茂藥業(yè)有限公司）；微晶纖維素，羥丙基纖維素，硬脂酸鎂和交聯(lián)羧甲基纖維素鈉，均購自安徽山河藥用輔料股份有限公司；乙腈為色譜純，購自美國Fisher公司；磷酸、氫氧化鈉等試劑均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 托吡司他片的制備

參照原研藥品說明書［8］，將乳糖30 g、微晶纖維素15 g、羥丙基纖維素0.7 g和交聯(lián)羧甲基纖維素鈉1.75 g過80目篩備用；稱取托吡司他20 g，用氣流粉碎機粉碎。按照處方量稱取粉碎好的托吡司他，乳糖、微晶纖維素、羥丙基纖維素和交聯(lián)羧甲基纖維素鈉（內(nèi)加）置濕法混合顆粒機中混合，攪拌速度為100 r·min－1，切碎速度設為低速，混合時間為5～10 min；加純化水適量，混合攪拌5～10 min，前2 min攪拌速度為100 r·min－1，切碎速度設為低速，后3～10 min攪拌速度為200 r·min－1，切碎速度設為高速，出料。將所制軟材經(jīng)多功能整粒機（20目）制濕顆粒，60℃干燥，（24目）進行整粒。將顆粒與交聯(lián)羧甲基纖維素鈉1.75 g（外加）和潤滑劑硬脂酸鎂0.35 g加入，壓片即得。共制得仿制的托吡司他片1 000片（規(guī)格：20 mg）。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為10 g·L－1磷酸溶液（用氫氧化鈉調(diào)節(jié)p H 值至3.0）-乙腈（75∶25）；檢測波長為275 nm［8］；理論塔板數(shù)按托吡司他峰計算應不低于3 000。

2.2.2 測定法 取本品20片，研細，稱取適量，精密稱定，加0.1 mol·L－1鹽酸溶液2 m L，再加甲醇適量超聲溶解，并用甲醇定量稀釋制成每1 m L 中約含托吡司他0.05 mg的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，精密量取20μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取托吡司他對照品，精密稱定，同法測定，按外標法以峰面積計算，即得自制托吡司他片中的藥物含量。共測定6批托吡司他片中的藥物含量，每批平行測定3 次。經(jīng)計算得6 批樣品的平均藥品含量為100.32%±0.40%。見表1。

表1 6批仿制托吡司他片樣品含量測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab.1 Content determination results of 6 batches of self-made Topiroxostat Tablets samples（±s，n＝3）

表1 6批仿制托吡司他片樣品含量測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab.1 Content determination results of 6 batches of self-made Topiroxostat Tablets samples（±s，n＝3）

批號 含量1 2 3平均含量2020082101 100.35% 100.12% 99.87% 100.11%2020082201 99.96% 99.82% 100.01% 99.93%2020082202 100.60% 100.39% 99.76% 100.25%2020082301 99.81% 99.83% 100.40% 100.01%2020082302 101.06% 101.02% 100.67% 100.92%2020082303 100.56% 100.57% 100.98% 100.70%平均含量 100.39%±0.46% 100.29%±0.47% 100.28%±0.48%100.32%±0.40%

2.3 溶解度試驗

參照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版二部凡例實驗［9］。將托吡司他原料藥研細，稱取本品細粉適量，置于具塞錐瓶中，分別加相應溶液溶解，置于20℃±5℃環(huán)境中，每隔5 min振搖30 s，在30 min內(nèi)觀察溶解情況，以在溶液中看不到沉淀時，即認為完全溶解，最小漏槽體積按最高劑量溶解體積的3倍計算，結(jié)果見表2。

表2 托吡司他原料藥在不同p H 值緩沖液中的溶解度Tab.2 Solubility of topiroxostat API in different p H buffers

從實驗結(jié)果可知，托吡司他原料藥的溶解度受p H 值影響很大。

2.4 溶出度測定方法的建立

2.4.1 檢測波長的選擇 取托吡司他對照品適量，用適量的0.1 mol·L－1鹽酸溶液溶解后，再用各溶出介質(zhì)稀釋成含托吡司他6μg·m L－1的溶液，按照紫外-可見分光光度法進行掃描，50 g·L－1SDS水溶液、0.1 mol·L－1鹽酸溶液、p H4.0 醋 酸鹽緩沖 液（含10 g·L－1SDS）和p H6.8 PBS中藥物的最大吸收波長分別為284、279、275、276 nm。測得的最大吸收波長將作為后續(xù)檢測波長。

2.4.2 藥物在各溶出介質(zhì)中的工作曲線 精密稱取托吡司他對照品20 mg，置于100 m L 量瓶中，加0.1 mol·L－1鹽酸溶液及甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標準溶液母液。分別精密量取母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 m L，置于100 m L 量瓶中，用各溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，分別制成含托吡司他 2、4、6、8、10μg·m L－1的系列質(zhì)量濃度溶液。

取上述溶液，以各溶出介質(zhì)為空白，照紫外-可見分光光度法（參考《中國藥典》四部）在各溶出介質(zhì)的最大吸收波長處分別測定其吸光度值A，以吸光度值A為縱坐標，質(zhì)量濃度C為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。見表3。

表3 托吡司他在各溶出介質(zhì)中的標準曲線Tab.3 Standard curves of topiroxostat in different dissolution media

2.4.3 各溶出介質(zhì)中的藥物穩(wěn)定性 精密稱取托吡司他對照品適量，用0.1 mol·L－1鹽酸溶液溶解，再用各溶出介質(zhì)定量稀釋成質(zhì)量濃度約為6μg·m L－1的樣品溶液。按照紫外-可見分光光度法，分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h，在各溶出介質(zhì)最大吸收波長處測定其吸光度值A。結(jié)果顯示，托吡司他在各溶出介質(zhì)中放置8 h均穩(wěn)定。見表4。

表4 托吡司他在各溶出介質(zhì)中不同時間的吸光度值ATab.4 The absorbance value of topiroxostat at different times in different dissolution media

2.4.4 溶出精密度實驗 取本品2個批次的片劑各1片（批號：20200818、20200816），按照“溶出度”項下的測定方法操作，45 min 時，取溶出液，經(jīng)0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液4 m L，置于10 m L 量瓶中，用溶出介質(zhì)50 g·L－1SDS水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液，各平行配制6份。按照紫外-可見分光光度法，分別在284 nm 波長處測定吸光度值A。結(jié)果表明，該溶出度測定法精密度良好，RSD 值為0.28%。

2.4.5 濾膜吸附實驗 取“溶出精密度實驗”項下20200816批樣品的溶出液適量，采用高速離心法，取上清液2.5 m L，置于20 m L 量瓶中，用溶出介質(zhì)50 g·L－1SDS水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液1；另取“溶出精密度實驗”項下20200816 批的溶出液適量，分別經(jīng)0.45μm 的微孔濾膜（水系和有機系）過濾，取續(xù)濾液2.5 m L，置于20 m L 量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻，作為供試品溶液2和3。

分別取供試品溶液1、2、3，按照紫外-可見分光光度法，在284 nm 波長處分別測定吸光度值A。測得平均吸光度值為0.616，RSD 值為0.001 4。結(jié)果表明，與離心處理的樣品相比，水系和有機系濾膜過濾的樣品的吸光值A基本無差異，由此可見，濾膜過濾對樣品溶液無吸附作用，采用濾膜過濾不會影響溶出度的測定。

2.4.6 回收率試驗 分別精密稱取托吡司他對照品約0.10（50%）、0.16（80%）、0.22 g（110%），置于①、②和③號研缽中，再取專屬性項下的混合空白輔料，分別精密稱取空白輔料約0.5 g（約相當于20 mg片劑的10片輔料量），置于3個研缽中，研勻。從①號研缽中精密稱取細粉3份（約含托吡司他10.0 mg）；從②號研缽中精密稱取細粉3 份（約含托吡司他16.0 mg）；從③號研缽中精密稱取細粉3份（約含托吡司他22.0 mg）。將上述9 份細粉分別置于100 m L量瓶中，加溶出介質(zhì)50 g·L－1SDS水溶液適量，超聲15 min，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻；取上述樣品溶液，經(jīng)0.45μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液2 m L，置于50 m L量瓶中，加溶出介質(zhì)定量稀釋至刻度，即得樣品溶液。

另取托吡司他對照品適量，精密稱定，加0.1 mol·L－1鹽 酸 溶 液 適 量 溶 解，用 溶 出 介 質(zhì)50 g·L－1SDS水溶液定量稀釋制成每1 m L 約含托吡司他8μg·m L－1的對照品溶液。按照紫外-可見分光光度法，在284 nm 波長處分別測定吸光度值A。計算回收率與相對標準偏差，實驗結(jié)果見表5。結(jié)果表明，分別加入相當于藥物制劑含量50%、80%、110%時，托吡司他的回收率為98.3%～101.6%，相對標準偏差為1.30%，符合測定要求，說明本方法可以準確地測出溶出液中托吡司他的含量。

表5 托吡司他藥物回收率實驗結(jié)果Tab.5 Results of topiroxostat recovery test

2.4.7 溶出轉(zhuǎn)速的選擇 將溶出轉(zhuǎn)速分別設置為槳法50 r·min－1和75 r·min－1，其余溶出條件不變，將原研藥品分別置于水溶液、含50 g·L－1SDS水溶液、p H4.0醋酸鹽緩沖液和p H6.8PBS 中觀察溶出行為。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)速對托吡司他片溶出行為影響不大。因此選擇50 r·min－1槳法作為溶出轉(zhuǎn)速。見表6。

表6 不同轉(zhuǎn)速下原研藥片藥物的溶出度Tab.6 The drug dissolution of the original Topiroxostat Tablets at different speeds

2.5 溶出一致性評價

2.5.1 溶出度的測定 取本品，按照溶出度測定法（《中國藥典》2020年版四部），以900 m L各種溶液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r·min－1，依法操作，45 min時，取續(xù)濾液4 m L，置于量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液；按照紫外-可見分光光度法，在最大吸收波長處分別測定吸光度值A。另取托吡司他對照品適量，精密稱定，加0.1 mol·L－1鹽酸溶液及甲醇適量溶解，再用各溶出介質(zhì)定量稀釋制成每1 m L 約含托吡司他8μg·m L－1的對照品溶液，同法測定，計算每片不同時間藥物累積溶出百分率。見表7。

表7 不同溶出介質(zhì)中仿制片和原研片的溶出度比較Tab.7 Comparison of the dissolution profiles of self-made tablets and original tablets in different dissolution media

2.5.2 相似度計算 利用公式計算并比較仿制藥和原研藥溶出曲線相似度［10-12］。

公式中T和R分別為仿制藥和原研藥的各取樣點的平均溶出度，n為取樣點個數(shù)，當f2因子數(shù)值計算結(jié)果大于50，可以認為兩者在溶出介質(zhì)水中溶出度曲線相似。在50 g·L－1SDS水溶液、0.1 mol·L－1鹽酸溶液、p H4.0醋酸鹽緩沖液（含10 g·L－1SDS）和p H6.8PBS的相似因子結(jié)果分別為76.16、90.54、68.18、58.07。但由于在0.1 mol·L－1鹽酸溶液中，藥物釋放太快，因此綜合考慮選擇50 g·L－1SDS水溶液作為托吡司他仿制藥質(zhì)量控制的溶出介質(zhì)。

3 結(jié)論

托吡司他仿制片目前在我國并未上市，文獻多報道合成方法［13-14］和雜質(zhì)的檢測方法［15-16］，目前溶出度一致性評價并未見報道，但是一致性評價對仿制藥的開發(fā)非常重要。本研究首先按照原研藥的相關資料制備了托吡司他片，并建立了托吡司他溶出度測定方法。最后選擇4種溶出介質(zhì)對自制片和原研藥溶出相似度進行比較，結(jié)果顯示，自制仿制藥片和原研藥在4種溶出介質(zhì)中的溶出度曲線相似因子均高于50，進一步證明了自制托吡司他仿制片與原研藥在體外溶出實驗中，質(zhì)量近似。綜合考慮取樣點數(shù)量和相似因子，最終選擇50 g·L－1SDS水溶液作為質(zhì)量標準中的溶出介質(zhì)。綜上所述，托吡司他溶出度測定方法精密度、準確度和靈敏度高；經(jīng)檢測自制托吡司他片與原研藥溶出行為一致，這些結(jié)果為托吡司他仿制藥的進一步研究和開發(fā)奠定了基礎。