N-乙酰神經(jīng)氨酸的研究現(xiàn)狀

趙紅宇，李學(xué)琳，周盛華，關(guān)文鳳，景志剛，王春柳

黑龍江康普生物科技有限公司（哈爾濱 150025）

N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）又稱為唾液酸，是酸性糖神經(jīng)氨酸的乙?；苌颷1]?；瘜W(xué)命名5-氨基-3, 5-二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖（圖1）[2]。

圖1 N-乙酰神經(jīng)氨酸

Neu5Ac廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中，是黏蛋白、糖蛋白和糖脂的低聚糖鏈的組成部分，占據(jù)復(fù)雜碳水化合物低聚糖鏈的末端非還原位置，以各種方式連接在細(xì)胞膜內(nèi)外表面，具有重要的生理功能[3]。人體中中樞神經(jīng)系統(tǒng)和母乳中Neu5Ac含量較為豐富，母乳中Neu5Ac水平為0.25～1.50 g/L[4]，以與低聚糖結(jié)合的形式為主，是富含Neu5Ac的天然食品。除母乳外，Neu5Ac還存在于燕窩、酪蛋白、牛奶和雞蛋中，燕窩是NeuAc含量最高的天然物質(zhì)，含有7%～12%的Neu5Ac，約為蛋黃（0.19%）的50倍[5]。

NeuAc在生物識(shí)別、細(xì)胞免疫和疾病方面具有重要作用，是唾液酸化人乳低聚糖（唾液酸化HMOs或唾液酸乳糖）的最重要單體之一，對(duì)改善嬰兒發(fā)育至關(guān)重要[6]。特別是，2017年我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布第7號(hào)公告，批準(zhǔn)Neu5Ac為新食品原料。2016年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)Neu5Ac二水合物可用于普通食品和嬰兒食品，2017年，歐盟委員會(huì)批準(zhǔn)Neu5Ac和Neu5Ac二水合物作為新食品成分使用。

1 N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成與代謝

人體可通過食物攝入和自身合成Neu5Ac。肝臟是Neu5Ac主要的合成器官，在細(xì)胞漿內(nèi)，從葡萄糖開始經(jīng)過很長(zhǎng)的途徑產(chǎn)生Neu5Ac（圖2）[7]。唾液酸化發(fā)生在胞質(zhì)內(nèi)，有多種分子參與其中，游離的Neu5Ac殘基被活化（磷酸化），以CMP-Neu5Ac形式經(jīng)由反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白泵入高爾基體腔，通過幾種合成后修飾，如甲基化、硫酸鹽化、乳糖化、乙?；蛢?nèi)酯化，繼而通過唾液酸轉(zhuǎn)移酶連接到糖鏈上，形成具有不同功能的唾液酸復(fù)合物，這一過程被稱為“唾液酸化”，形成唾液糖蛋白和唾液糖脂等，如神經(jīng)節(jié)苷脂等[8]。糖鏈上的Neu5Ac最終由體內(nèi)或溶酶體中的唾液酸酶移除[9]，再次形成游離的Neu5Ac，從而達(dá)到循環(huán)利用的目的。

圖2 N-乙酰神經(jīng)氨酸在體內(nèi)的新陳代謝途徑

攝入的Neu5Ac，無論是作為游離Neu5Ac還是唾液酸基低聚糖，很容易在腸道被吸收，并在6 h內(nèi)進(jìn)入血液和組織。Neu5Ac攝取到組織后可能會(huì)被唾液酸裂解酶裂解，轉(zhuǎn)化為N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸。N-乙酰甘露糖胺隨后被用于再合成唾液酸復(fù)合物[10]。大鼠腸道細(xì)胞壁對(duì)游離Neu5Ac具有高度的滲透性。經(jīng)放射性標(biāo)記的Neu5Ac和Neu5Ac乳糖被大鼠幼崽吸收良好（約90%），30%留在體內(nèi)，6 h后3%～4%留在大腦中。

2 N-乙酰神經(jīng)氨酸的功能

2.1 Neu5Ac與神經(jīng)系統(tǒng)和大腦發(fā)育

關(guān)于Neu5Ac及其生物學(xué)作用已經(jīng)有了廣泛的研究。Neu5Ac對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能至關(guān)重要。它參與調(diào)節(jié)突觸發(fā)生、神經(jīng)發(fā)生、細(xì)胞增殖和遷移、細(xì)胞粘附和軸突引導(dǎo)，并調(diào)節(jié)先天免疫功能[11]，特別是Neu5Ac在學(xué)習(xí)和記憶中扮演著重要的角色[12]。然而，牛奶中的Neu5Ac含量非常低（8～25 mg/L），遠(yuǎn)低于母乳中的Neu5Ac含量[13]。通過膳食補(bǔ)充Neu5Ac可以提高大腦中的Neu5Ac含量，以改善學(xué)習(xí)和記憶。研究表明，在飲食中補(bǔ)充Neu5Ac有利于嬰兒骨骼生長(zhǎng)、大腦發(fā)育和老年人大腦功能的維持[7]，在老年癡呆和精神分裂癥患者大腦中的Neu5Ac含量減少，經(jīng)Neu5Ac藥物治療后，Neu5Ac含量恢復(fù)正常，表明Neu5Ac參與了神經(jīng)組織活動(dòng)[14]。

2.2 Neu5Ac與生殖和免疫

在人體生殖系統(tǒng)中，Neu5Ac在精子和卵細(xì)胞成熟、受精、精子與卵子接觸[15]，精子到達(dá)卵子之前與雌性生殖道的各種液體和表面的相互作用期間[16]均發(fā)揮重要的生理功能。唾液酸化對(duì)于保護(hù)胎兒的胚外組織免受母體補(bǔ)體攻擊至關(guān)重要[17]。完全唾液化的糖蛋白和細(xì)胞的行為被稱為“自我”，它們是完整的，并被生物體耐受。一旦Neu5Ac失去，分子和細(xì)胞就變成“非自身”，不再適應(yīng)正常“行為”所需的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此，它們被生物體的防御系統(tǒng)識(shí)別，并最終被摧毀[18]。這個(gè)防御系統(tǒng)是免疫系統(tǒng)的一部分，因此“自我/非自我”雙重系統(tǒng)在免疫學(xué)中起著至關(guān)重要的作用[19]。許多生物治療產(chǎn)品（抗體、細(xì)胞因子和激素）都是糖蛋白，糖蛋白上的唾液化程度（通常稱為“蓋帽”）決定產(chǎn)品的利用程度，任何主要成分的低唾液化都會(huì)導(dǎo)致分子被快速清除，因此，大多數(shù)生物治療產(chǎn)品都需要進(jìn)行末端唾液化測(cè)試，這也通常是美國(guó)食品和藥物管理局的要求。

2.3 Neu5Ac與腫瘤

在腫瘤細(xì)胞中，Neu5Ac的掩蔽作用也具有重要意義[1]。腫瘤細(xì)胞表面被NeuAc高度包被[20]。這種高唾液酸化常導(dǎo)致癌癥進(jìn)展加速，促進(jìn)免疫逃逸，增強(qiáng)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，幫助腫瘤血管生成，并幫助抵抗凋亡和癌癥的治療[21]，細(xì)胞表面的NeuAc改變，是由唾液酸轉(zhuǎn)移酶引起的，Neu5Ac的尿苷和次黃嘌呤衍生物可以抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，因?yàn)樗峭僖核徂D(zhuǎn)移酶的強(qiáng)抑制劑[22]。

2.4 Neu5Ac與自由基

Neu5Ac的活性羥基可提供活潑氫與超氧陰離子自由基（O2-）、羥自由基（-OH）結(jié)合，起抗自由基氧化的作用，只有游離狀態(tài)的Neu5Ac能起到作用。另外，羥基還可與金屬離子絡(luò)合，減少自由基的產(chǎn)生。體外試驗(yàn)研究表明，燕窩中的Neu5Ac能有效抑制酪氨酸羥基酶的活性，減少多巴色胺的產(chǎn)生，防止黑色素的生成，具有一定的美白成效[23]。

2.5 Neu5Ac的其他功能

Neu5Ac還能增強(qiáng)腸道對(duì)礦物質(zhì)和維生素的吸收，促進(jìn)骨骼發(fā)育。Neu5Ac多肽可防止腸道毒素和致病菌與腸道黏膜細(xì)胞結(jié)合，從而提高腸道的抗菌、解毒和抗病毒能力[24]。Neu5Ac粘附在紅細(xì)胞表面，保護(hù)紅細(xì)胞，防止血液循環(huán)中細(xì)胞不必要的相互作用，Neu5Ac在調(diào)節(jié)這些血液成分的壽命和維持體內(nèi)平衡方面是至關(guān)重要的。此外，它可以用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，細(xì)胞表面的Neu5Ac可以有效地防止白細(xì)胞過度聚集，起到抗炎的作用[1,25]。

3 N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)工藝

目前食品工業(yè)生產(chǎn)的NeuAc國(guó)內(nèi)和國(guó)外工藝明顯不同。國(guó)內(nèi)新食品原料批準(zhǔn)的生產(chǎn)工藝是以食品級(jí)葡萄糖和玉米漿為原料，經(jīng)大腸埃希氏菌（菌株號(hào)SA-8）發(fā)酵、過濾、滅菌、水解、提純等工藝制成的無水Neu5Ac。

3.1 國(guó)內(nèi)Neu5Ac的生產(chǎn)工藝

大腸桿菌發(fā)酵合成聚唾液酸，然后將其水解制備Neu5Ac是目前國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)Neu5Ac生產(chǎn)的唯一方法。自然界中少數(shù)幾種細(xì)菌細(xì)胞可以生產(chǎn)聚唾液酸，大腸桿菌是其中的一種，通常選用E.coliK1和E.coliK235，以山梨醇、葡萄糖或木糖為底物生產(chǎn)[26]。用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細(xì)菌時(shí)，聚唾液酸以黏液的形式釋放到發(fā)酵液中。郭良棟等[27]經(jīng)過篩選，得到一株高產(chǎn)聚唾液酸菌株E.coliC8，聚唾液酸產(chǎn)量為1.2 g/L。

Zhan等[28]通過控制E.coliK235發(fā)酵過程中的pH和補(bǔ)料，聚唾液酸產(chǎn)量為3.5 g/L。劉金龍等[29]通過pH控制并對(duì)菌株培養(yǎng)模式進(jìn)行優(yōu)化，將聚唾液酸的產(chǎn)量提高至4.8 g/L。Zhang等[30]通過兩階段 pH 控制和補(bǔ)料分批發(fā)酵，聚唾液酸的產(chǎn)量提高到5.65 g/L。郭亭等[31]以大腸桿菌突變株GX124為聚唾液酸發(fā)酵菌株，不同碳源、氮源以及磷酸鹽濃度，發(fā)酵48 h，聚唾液酸產(chǎn)量高達(dá)15 g/L，同時(shí)基于陶瓷膜截留聚唾液酸，建立了一種高效制備聚唾液酸的半連續(xù)發(fā)酵工藝。在發(fā)酵過程中，當(dāng)聚唾液酸濃度達(dá)到一定程度（約8 g/L）時(shí)，離心回收菌體，通過陶瓷膜截留聚唾液酸實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物分離，濾液與菌體混勻繼續(xù)發(fā)酵，重復(fù)5個(gè)批次，發(fā)酵90 h，唾液酸總產(chǎn)量達(dá)40.1 g/L。

3.2 國(guó)外Neu5Ac的生產(chǎn)工藝

美國(guó)批準(zhǔn)的Neu5Ac生產(chǎn)是經(jīng)酶法催化制成的Neu5Ac二水合物，歐盟Neu5Ac采用同樣工藝制成Neu5Ac二水合物和無水Neu5Ac，值得一提的是美國(guó)和歐盟批準(zhǔn)的Neu5Ac均是由全球知名的HMO供應(yīng)商丹麥Glycom A/S公司申報(bào)的，Glycom A/S公司于2020年被荷蘭皇家帝斯曼集團(tuán)收購。Glycom A/S公司生產(chǎn)的Neu5Ac是由N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸鈉作為直接前體，采用N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶（NAL CAS：9027-60-5；E.C.：4.1.3.3）直接催化合成的，經(jīng)過結(jié)晶提取成無水的Neu5Ac，再復(fù)溶后經(jīng)異丙醇重結(jié)，過濾烘干后即為Neu5Ac二水合物。

N-乙酰甘露糖胺價(jià)格非常高，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)可以通過N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構(gòu)酶（AGE）異構(gòu)化N-乙酰葡萄糖胺得到N-乙酰甘露糖胺[32-33]，然而AGE酶不易獲得且催化過程復(fù)雜，如對(duì)ATP有強(qiáng)烈的依賴性和丙酮酸抑制AGE酶活性，限制了Neu5Ac的酶法工業(yè)化生產(chǎn)[34]。Klermund等[34]從多變魚腥藻（ATCC 29413）中鑒定了一個(gè)新的AGE酶，其在高底物濃度和不添加ATP的情況下，活性為有ATP時(shí)的32%。當(dāng)使用可溶性酶時(shí)，上述兩步酶法也存在一些缺點(diǎn)，包括轉(zhuǎn)化率低和反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)。為了在兩步酶法中使平衡向Neu5Ac方向轉(zhuǎn)變，添加了大量的丙酮酸。同時(shí)，開發(fā)出固定化酶法，增加酶的使用次數(shù)成為研究的重點(diǎn)。Hu等[35]在大腸桿菌中同時(shí)表達(dá)NAL和AGE，并將它們固定在環(huán)氧樹脂上，在單個(gè)反應(yīng)器中將N-乙酰氨基葡萄糖胺轉(zhuǎn)化為Neu5Ac，該體系的轉(zhuǎn)化率可達(dá)73%以上，反應(yīng)次數(shù)在5次以上。Wang等[36]表達(dá)了雙標(biāo)記的AGE和NAL酶融合，通過離子標(biāo)記在離子交換樹脂上固定化，從200 mmol/LN-乙酰氨基葡萄糖胺和100 mmol/L丙酮酸，10 mmol/L ATP和10 mmol/L MgCl2中獲得了135 mmol/L Neu5Ac。Bloemendal等[37]設(shè)計(jì)了高效連續(xù)流反應(yīng)器，用Immobead 150P固定載體固體NAL酶。連續(xù)流反應(yīng)器中NAL酶活性與天然酶相比沒有降低，在丙酮酸（100 mmol/L）、N-乙酰氨基甘露糖胺（500 mmol/L）和0.05 mL/min的連續(xù)流速下，N-乙酰氨基甘露糖胺的轉(zhuǎn)化率達(dá)到82%。總的來說，酶法固定具有反應(yīng)速度快、反應(yīng)條件溫和易控、底物轉(zhuǎn)化率高、容易獲得且價(jià)格便宜、固定化酶可反復(fù)多次利用、提取方便、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)。

3.3 Neu5Ac的分離純化

Neu5Ac的分離純化方法在不同原料中有所不同。發(fā)酵法一般經(jīng)過除菌、除蛋白、水解、脫色、除鹽、結(jié)晶等工藝流程，獲得高純度Neu5Ac。發(fā)酵液首先經(jīng)過加熱預(yù)處理，然后離心去除菌體或直接過陶瓷膜取上清液除菌體，然后通過超濾膜后再過離子交換柱（堿性陰離子交換樹脂變?yōu)榫弁僖核徕c）或直接加乙醇或絡(luò)合劑去除蛋白再加水復(fù)溶，同時(shí)起到了濃縮的作用，除蛋白后加熱強(qiáng)酸水解或微波水解，Neu5Ac單體經(jīng)活性炭過濾得到脫色液，再濃縮至溶液中，唾液酸鈉的質(zhì)量濃度為300～500 g/L，濃縮液中加入冰乙酸低溫結(jié)晶[38]。此種方法加入冰乙酸析出的晶體均為Neu5Ac無水物，同時(shí)結(jié)晶還可以采用乙酸乙酯等。袁麗霞等[39]通過向Neu5Ac濃縮液中加入酸溶液，調(diào)節(jié)溶液體系的氫離子濃度，即pH，制備高純度的Neu5Ac二水合物，采用離心過濾或者板框過濾的方式得到結(jié)晶，經(jīng)冷凍干燥、真空干燥或者微波干燥，得到Neu5Ac成品。

酶法生產(chǎn)的Neu5Ac提取相對(duì)簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化液直接脫色濃縮后結(jié)晶，結(jié)晶過濾烘干后得到成品。朱薇薇[40]采用500 Da超濾膜的方式去除丙酮酸鈉，再用離子樹脂吸附去除N-乙酰葡萄糖胺，最后得到較為純凈的Neu5Ac轉(zhuǎn)化液，直接利用異丙醇結(jié)晶，即可得到高純度（純度≥99.5%）的二水合物，丙酮酸鈉和N-乙酰葡萄糖胺再次進(jìn)入轉(zhuǎn)化循環(huán)利用。

4 結(jié)語與展望

目前食品工業(yè)生產(chǎn)獲批的聚唾液酸發(fā)酵法和酶催化合成，聚唾液酸水解生成Neu5Ac，其產(chǎn)率低，不足以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，酶催化法底物價(jià)格昂貴[41]，使得Neu5Ac價(jià)格居高不下，限制了Neu5Ac在食品、化妝品及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。隨著代謝工程和蛋白質(zhì)工程的發(fā)展，聚唾液酸發(fā)酵生產(chǎn)Neu5Ac工藝不斷改進(jìn)，Neu5Ac產(chǎn)量不斷提高。研究學(xué)者還開發(fā)出了全細(xì)胞催化法和微生物直接生產(chǎn)法。全細(xì)胞生產(chǎn)法與酶催化法相比不需要輔酶[42]，但在全細(xì)胞催化過程中，底物和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移通常受到細(xì)胞膜的抑制，通過基因工程手段可以提高細(xì)胞膜的通透性[43]，從而提高全細(xì)胞催化過程中的反應(yīng)速率和產(chǎn)物收率[44]。通過微生物發(fā)酵重頭合成Neu5Ac可以利用葡萄糖或甘油等來滿足工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的需求，增強(qiáng)主要代謝途徑、突變反饋抑制、消除競(jìng)爭(zhēng)途徑等已被用于提高Neu5Ac的產(chǎn)量[14,45-46]，這很可能成為未來Neu5Ac生產(chǎn)的主要方法。