基于PCR檢測技術鑒別羊肉摻假的研究進展

項愛麗，段曉然，梅汝蕃，湯思凝，鄭百芹*，王秋悅*

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心（唐山 063000）；2. 河北科技師范學院動物科技學院/河北省預防獸醫(yī)重點實驗室（秦皇島 066000）

隨著社會經濟的發(fā)展、人民生活水平的提高、食品工業(yè)的現代化及動物優(yōu)質食品生產的需求，肉類摻假問題逐漸受到社會各方面的廣泛關注。

鑒別肉類摻假的方法有很多種，有基于形態(tài)學檢測、代謝物檢測、蛋白質檢測[1-6]、核酸檢測等方法。感官鑒定在一定程度上會產生主觀差異，只能作為初步判別。組織學鑒定及顯微鏡檢查，僅能做出初步的定性檢測，不能做出定量判斷。光譜法、質譜法對實驗操作要求較高，操作繁瑣，因此其應用于肉制品摻假鑒定也日益減少。電子鼻、電子舌等技術可通過羊肉的組織結構及其特殊的氣味鑒別羊肉的真?zhèn)危矁H能做出定性鑒別，不能定量。色譜技術和電泳技術可以有效分離和鑒別肉類制品中的各種成分，在實踐中有參考價值，但操作繁瑣且相對昂貴、費時，不便日常樣品分析。免疫學方法由于蛋白質的熱穩(wěn)定性較弱，加熱過程中蛋白質會發(fā)生變性，導致免疫學方法在肉類摻假檢測方面也存在一定局限性。

基于核酸檢測技術的PCR檢測方法對摻假鑒定比較成熟，這種鑒別方法最為權威，具有靈敏度高、重現性好、穩(wěn)定性高、用時短等優(yōu)點，因而在羊肉摻假檢測方面得到廣泛應用。主要對基于核酸檢測技術的幾種常用的PCR檢測方法對羊肉制品摻假檢測進行介紹。

1 摻假羊肉及肉制品基于核酸檢測技術的PCR檢測方法

1.1 普通PCR

普通PCR技術在食品領域最早被用于有害微生物的檢測。郭鳳柳等[7]使用該方法對5種動物進行肉源成分的檢測，其中采集的羊肉樣品共56份，摻假率達75%，結果顯示檢測濃度可達到pg，甚至部分可達fg。Bhat等[8]針對線粒體cytB設計引物，采用多重PCR方法對羊肉中2種肉類（牛肉、水牛肉）摻假進行鑒別，設計多重PCR方法進行檢測，試驗中使用優(yōu)化好的反應條件以及反應體系進行PCR，得到了預期效果，熟羊肉的比例從20%降低到1%，其條帶亮度與純羊肉相似。在混合肉樣中，牛和水牛cyt B基因片段的條帶強度隨著其在熟羊肉Rista中的比例從20%下降到1%而呈進行性下降。但仍可以準確檢測，羊肉摻假鑒別檢測限低至1%（W/W）。Jia等[9]基于線粒體16S rRNA設計一對通用引物，采用多重PCR方法對羊肉摻假分子進行鑒定，成功鑒別出混合肉中的各種類肉成分，同時為了檢測混合比例對檢測結果的影響，進行不同比例混合肉的檢驗，均能準確地檢測出其肉源成分。Nagappa等[10]針對羊的線粒體D環(huán)的一個獨特靶區(qū)設計引物，采用高度種屬PCR的方法對羊肉進行摻假鑒別，對生的以及不同程度熱處理的羊肉進行PCR檢測，在不高于121 ℃的高溫下，均可在羊肉中提取出理想的DNA，此外，該方法的靈敏度為0.1%，綿羊DNA的檢測限低至1 pg。普通PCR靈敏度高，特異性強，但相對耗時較長，因反應不是在閉管內進行的，還存在一定的污染概率。

1.2 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR技術實際是對核酸的定量，實時熒光定量PCR主要包括Taq和SYBR Green兩大類。通過向反應體系中加入熒光基團，在PCR指數擴增過程中連續(xù)監(jiān)測熒光信號，實時監(jiān)測特異性產物的數量，通過目的基因的標準曲線進行定量分析[11]。凌睿等[12]以MY為通用引物，利用SYBR Green實時PCR方法對市場中常見的肉類（豬、牛、山羊、綿羊、鴨、雞）進行DNA提取檢測，成功地檢測出各肉類DNA，并對含1%豬肉的模擬樣品摻假羊肉類進行檢測，豬肉的檢出限為0.1 ng，對含有0.1%羊肉的模擬樣品摻假豬肉進行檢測，亦可檢出羊肉成分，其檢出限為0.01 ng。顧文佳等[13]以羊的線粒體細胞色素B基因為特異性基因，以12S rRNA為內摻基因，采用熒光定量PCR檢測冷凍羊肉卷中羊肉的相對含量，同時與稱重法進行了比較。徐瑗聰等[14]以線粒體細胞色素B基因為靶基因，采用實時熒光定量PCR對豬、牛、羊肉的摻假情況進行檢測，成功檢測出火腿腸、牛肉粒、綿羊肉泡饃中的豬肉、牛肉、羊肉成分，對豬、牛、羊3種肉類的最低檢出限分別為5，5和50 pg，其對應的拷貝數分別約1.69，1.52和17.5。劉國強等[15]通過探針法對鴨源性摻假進行檢測，可檢出含1%的鴨肉與羊肉混合物中的鴨源成分，對鴨源成分檢測限可達10 fg。熒光定量PCR，自動化程度高，特異性強，靈敏度高，具有實時性及高定性、定量判斷[16]。但實時熒光定量操作要求嚴格，價格相較普通PCR昂貴。

1.3 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）方法是一種在等溫溫度下擴增靶DNA的新方法。該方法依賴于4個特異性引物——內引物（FIP和BIP）和外引物（F3和B3），識別靶DNA的6個不同區(qū)域[17]。也可以通過向反應混合物中加入SYBR Green I染料目視測定LAMP反應，在存在LAMP擴增子的情況下，溶液的顏色變?yōu)榫G色，但在無擴增的混合物中保持橙色[18]。目前LAMP已被用于檢測細菌、病毒、寄生蟲和轉基因生物等研究中。陳珍金等[19]以大鼠線粒體COX基因KP244683.1及小鼠16S rRNA 基因KY018919.1為靶基因設計相應的特異性引物，首次通過LAMP法進行羊肉制品中鼠源性成分鑒定檢測，成功檢測出羊肉串、羊肉卷中的鼠源性成分，檢出率達100%，并對檢出限進行檢測，大鼠檢出限達0.1%（W/W），小鼠檢出限達0.5%（W/W）。邵長春等[20]以豬ND1、牛COXI、羊cytB為靶基因設計特異性引物，通過LAMP檢測豬牛羊源性成分，結果表明豬、羊、牛源性成分的檢出限為0.01%（W/W），豬、羊源性成分檢測靈敏度為10 pg，牛源性成分檢測靈敏度為1 pg。柳海賓等[21]以鴨cytB為靶基因設計特異性引物，將LAMP與免疫層析試紙條（ICTS）技術相結合，檢出限為0.01%（W/W），用LAMP-ICTS方法檢測的市售樣品羊肉中鴨源性成分的結果與行業(yè)標準方法檢測出的結果一致，且LAMPICTS檢測方法可在40 min內檢測出結果。LAMP方法有顯著的靈敏度高、特異性、快速和易于操作的優(yōu)點，使DNA在等溫條件下有效擴增，無需復雜、昂貴的熱循環(huán)儀和信號檢測的后擴增程序[22]，檢測限可達到幾個拷貝。但環(huán)節(jié)等溫擴增技術需要設計較多的引物，操作相對復雜。

1.4 數字PCR技術

數字PCR（digital PCR，dPCR）是近20年興起的第3代PCR技術。它是根據傳統PCR原理與泊松統計分布（Poisson distribution）設計的新型PCR技術[23]。陳傳君等[24]以羊、牛單烤貝生長激素基因GH為特異性基因設計特異性引物和探針，采用微滴式數字PCR方法檢測羊等肉制品中的鴨源性成分，通過向樣品中添加牛肉作為內標，通過DNA拷貝數與質量間的線性關系，實現拷貝數與質量間的轉換。羊肉成分為0.01時，拷貝數可達0.12 copies/μL。能夠檢測出樣品中含有5%以上的羊源性成分。陳晨等[25]根據羊和豬的單烤貝基因設計引物與探針，驗證肉的質量與DNA濃度及DNA拷貝數之間的線性關系，建立檢測肉制品中豬源及羊源性成分含量的鑒別方法，通過檢測肉制品中羊肉以及豬肉的拷貝數即可推斷出肉的質量。王珊等[26]通過3份羊肉制品檢測對比微滴式數字PCR與熒光定量PCR的檢測方法的優(yōu)缺點，熒光定量方法通過Ct值來粗略判斷DNA的含量，微滴式數字PCR方法通過檢測出的拷貝數計算出羊源及豬源性成分含量。數字PCR特異性強、靈敏度高、耗時短，檢測限可達到拷貝數級別。但操作復雜，且需要昂貴的儀器及探針。

1.5 限制性片段長度多態(tài)性方法

限制性片段長度多態(tài)性-PCR（PCR-RFLP）是一種用特異性內切酶將PCR擴增產物切割成不同大小的片段，得到解析圖譜的鑒定方法。PCR-RFLP在成本、檢測能力、適用性等方面被視為最高效的方法之一。Kumar等[27]以cytB為目的基因設計一對特異性正反向引物，使用PCR-RFLP檢測法，鑒別5種常見食用動物的肉類。用AluI和TaqI限制性內切酶消化擴增的目的片段，鑒定樣品中的水牛肉、牛肉、綿羊肉、山羊肉和豬肉成分，限制性內切酶AluI在綿羊中得到大小為259和350 bp的2個片段，但不能裂解山羊PCR產物。TaqI限制性內切酶在山羊中得到大小為43，131，163和272 bp的4個片段，且每個種屬的AluI和TaqI獨特限制性酶切模式都可很好地鑒定所有5種食用動物種屬，但其耗時較長，幾乎需要24 h。Mahajan等[28]根據MT 12S rRNA基因作為靶標設計通用引物，對不同混合比例的水牛、牛、綿羊、山羊肉進行檢測，僅用AluI限制性內切酶消化無法區(qū)分綿羊和山羊，同時使用BspTI和ApoI這2種限制性內切酶消化產物可以區(qū)分綿羊肉和山羊肉。在BspTI酶消化物中，在山羊樣品中觀察到323和133 bp的2個片段，在綿羊樣品中未觀察到切割，當所有組合中混合物比例為75∶25時，該技術仍可區(qū)分動物種屬。PCR-RFLP檢測是區(qū)分密切相關種屬（如牛/水牛和綿羊/山羊）的有效方法，該方法具有較高的精密度和專屬性，且花費較少。但該方法耗時較長，不適用于現場肉類摻假檢測。

2 討論

近年來，肉類摻假檢測技術發(fā)展越來越迅速。在試驗過程中，研究人員使用多種技術對肉類摻假進行檢測，每種技術都有其各自的優(yōu)缺點?；贒NA的物種鑒定技術逐漸取代其他傳統技術，這是因為DNA分子存在于個體的任何組織中，其結構穩(wěn)定、較耐高溫，在不高于121 ℃的情況下穩(wěn)定性也較強。因此，使用基于DNA的方法提高了檢測的特異性及靈敏度。普通PCR方法操作簡單，特異性強，可以檢測到微量的摻假數量，但檢測數量不能精確到具體的拷貝數量，且存在一定的感染可能性；實時熒光定量PCR由于是在閉管中進行檢測的，降低了污染的可能性，可檢測出肉類摻假物種及數量，但其需要昂貴的儀器，對實驗環(huán)境要求較嚴格；環(huán)介導等溫擴增技術無需昂貴的儀器，僅需一個水浴鍋，在40 min左右即可完成檢測，耗時短，且對實驗環(huán)境及儀器沒有嚴格要求，也可通過向反應混合物中加入SYBR Green I染料目視測定LAMP反應，但沉淀物可視化的難度高，尤其是在較低的目標DNA濃度和交叉污染的高風險下，可能限制LAMP檢測的有用性，且其引物設計及篩選工作量較大、較繁瑣；數字PCR根據質量與DNA拷貝數之間的線性關系，即可精確檢測出肉制品的摻假的拷貝數，特異性強，靈敏度高，耗時短，但對實驗操作要求較高，操作繁瑣；限制性片段長度多態(tài)性方法，可同時檢測多個物種，其靈敏度高，專屬性強，花費少，但其耗時較長。隨著技術的發(fā)展，建立一種耗時短、花費少、靈敏度高的檢測方法是肉類產假行業(yè)的必然之事，隨著肉制品摻假檢測技術的逐步成熟，肉制品摻假必將寸步難行。

3 結語

PCR法在肉類科學領域的應用研究越來越多，因為該技術具有應用迅速而無需進一步樣品制備的優(yōu)點。許多研究表明，分子生物學PCR法是一種強大的分析工具，可以通過確認種屬的真實性，在增加消費者對肉類和最終肉制品的信心中發(fā)揮作用，特別適用于定性及定量檢測。因此，可能在肉類摻假檢測中替代基于形態(tài)學檢測方法、基于代謝物檢測方法、基于蛋白質檢測方法。但該方法目前主要是用于定性檢測，對于定量檢測還不普遍。隨著科學的飛速發(fā)展，相信PCR法與其他方法進行有機的結合使用也是指日可待的，肉類摻假檢測方法將會有更大的發(fā)展空間。