線粒體DNA拷貝數(shù)變異機(jī)制及疾病預(yù)測(cè)價(jià)值分析

馮兆森，王華偉，方 育

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032)

線粒體通過(guò)氧化呼吸鏈產(chǎn)生高達(dá)90%的細(xì)胞能量，是重要的細(xì)胞器。線粒體除有氧氧化供能外，還參與其他關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，如維持鈣穩(wěn)態(tài)，觸發(fā)凋亡性細(xì)胞死亡以及調(diào)節(jié)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的代謝。上述線粒體功能的正常運(yùn)作依賴于正常的線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)，人類的mtDNA是個(gè)雙鏈DNA分子，兩條鏈分別稱為重鏈(H)和輕鏈(L)，結(jié)構(gòu)為閉合的環(huán)狀。MtDNA相對(duì)獨(dú)立于核基因組，參與編碼4種呼吸酶復(fù)合物。由于mtDNA沒(méi)有結(jié)合組蛋白、DNA修復(fù)系統(tǒng)效率低下，mtDNA容易受到致病因素?fù)p傷發(fā)生突變，影響線粒體的正常功能。線粒體功能的運(yùn)作不僅依賴于正常的mtDNA分子，還與細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)息息相關(guān)。MtDNA拷貝數(shù)即mtDNA分子的復(fù)制數(shù)量，不同的組織細(xì)胞根據(jù)各自的能耗需求，具有相適應(yīng)的拷貝數(shù)，與細(xì)胞能耗需求呈正比，在病理情況下拷貝數(shù)可能發(fā)生變化。目前研究發(fā)現(xiàn)部分病變組織mtDNA拷貝數(shù)發(fā)生了改變，且與疾病發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。另外，mtDNA拷貝數(shù)對(duì)于預(yù)測(cè)疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后具有價(jià)值。下面，本文將對(duì)mtDNA拷貝數(shù)變異機(jī)制及其影響疾病的機(jī)制進(jìn)行論述。

1 MtDNA的復(fù)制過(guò)程

哺乳動(dòng)物mtDNA通過(guò)線粒體中唯一的DNA聚合酶γ(polymerase γ，Polγ)進(jìn)行復(fù)制和修復(fù)。人類的Polγ全酶分為催化亞基和輔助亞基，二者組成二聚體。催化亞基具有DNA聚合酶、3'-5'核酸外切酶和5'脫氧核糖磷酸裂解酶活性；輔助亞基為Polγ與mtDNA緊密結(jié)合所必需。Polγ全酶與具有mtDNA解旋酶活性的Twinkle蛋白以及mtDNA單鏈結(jié)合蛋白(mtSSBP)結(jié)合，形成mtDNA復(fù)制體。另外，具有5'-3'核酸外切酶活性的線粒體基因組維持外切酶1(mitochondrial genome maintenance exonuclease 1，MGME1)亦參與mtDNA復(fù)制[1]。根據(jù)mtDNA復(fù)制的鏈置換模型，兩條鏈均以連續(xù)單向的方式異步復(fù)制。復(fù)制從兩條鏈各自的起點(diǎn)開(kāi)始的：重鏈(H)起點(diǎn)OriH和輕鏈(L)起點(diǎn)OriL，復(fù)制從OriH開(kāi)始合成先導(dǎo)H鏈。隨著新生的H鏈延長(zhǎng)，親代H鏈逐漸成為單鏈。復(fù)制大約11kb后，復(fù)制體到達(dá)OriL，L鏈以單鏈H鏈為模板并沿相反方向進(jìn)行合成。H和L鏈DNA合成不斷進(jìn)行，直到形成兩個(gè)完整的子分子。

2 MtDNA拷貝數(shù)變異與氧化應(yīng)激相關(guān)

目前研究普遍認(rèn)為病變組織中mtDNA拷貝數(shù)變異與ROS產(chǎn)生增多關(guān)系密切。與對(duì)照組相比，外周動(dòng)脈疾病患者外周血mtDNA拷貝數(shù)下降[2]；糖尿病患者外周血mtDNA拷貝數(shù)降低[3]；哮喘患者外周血mtDNA拷貝數(shù)升高[4]；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎受累雙胞胎及其未受累雙胞胎與對(duì)照組健康雙胞胎相比，外周血mtDNA拷貝數(shù)減少。這些疾病中mtDNA拷貝數(shù)變異均被認(rèn)為是疾病發(fā)生過(guò)程中致病因素引起ROS產(chǎn)生增加導(dǎo)致，如高血糖、空氣致敏原等破壞線粒體呼吸鏈復(fù)合物，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增多。哮喘患者血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性下降，無(wú)法有效代謝ROS，糖皮質(zhì)激素治療使SOD活性恢復(fù)至健康水平，并且糖皮質(zhì)激素的使用與哮喘患者mtDNA拷貝數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)[4]。由此有充分的理由相信mtDNA拷貝數(shù)的增加是由于ROS增多導(dǎo)致。

3 MtDNA拷貝數(shù)變異機(jī)制

ROS主要產(chǎn)生于線粒體內(nèi)膜，在正常情況下，線粒體產(chǎn)生的ROS能及時(shí)清除，當(dāng)暴露于致病因素超過(guò)臨界值，ROS大量產(chǎn)生，導(dǎo)致mtDNA受到氧化損傷。MtDNA的控制區(qū)域稱為D環(huán)區(qū)(displacement loop，D-Loop)，與mtDNA的其他區(qū)域相比，D-Loop對(duì)氧化損傷高度敏感。其中位于303和315核苷酸之間的多胞嘧啶區(qū)稱為D310區(qū)，D310區(qū)的第一個(gè)多胞嘧啶重復(fù)序列(Poly-C鏈)，在健康人群中其C殘基數(shù)量分布范圍為7C-9C，Poly-C鏈中C殘基數(shù)量的改變影響Polγ與其他反式作用元件的結(jié)合，影響mtDNA復(fù)制，目前已在多種惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)D310區(qū)突變，并且是惡性腫瘤mtDNA中最常見(jiàn)的突變。Polγ對(duì)氧化損傷較mtDNA更為敏感，ROS會(huì)抑制該酶活性并降低其與mtDNA親和力，并使其復(fù)制效率下降、復(fù)制過(guò)程容易出錯(cuò)，導(dǎo)致mtDNA容易發(fā)生突變，D310區(qū)C殘基數(shù)目發(fā)生改變[5]。即氧化損傷使mtDNA損傷進(jìn)入惡性循環(huán)，一方面使Polγ復(fù)制mtDNA時(shí)容易發(fā)生突變，另一方面，突變的mtDNA與Polγ親和力下降，效率降低，但在正常情況下，輕度損傷的mtDNA可通過(guò)mtDNA修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)。

線粒體已被證明可通過(guò)復(fù)制mtDNA增加其拷貝數(shù)來(lái)代償損害和功能障礙：輕度氧化損傷時(shí)，為了代償減弱的氧化磷酸化及其他線粒體功能，mtDNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)活性增加，加強(qiáng)mtDNA的復(fù)制引起拷貝數(shù)增加。在此過(guò)程中抑癌基因TP53有著重要作用：TP53通過(guò)下游基因P53R2調(diào)節(jié)線粒體生物合成功能，TP53誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)減少ROS的產(chǎn)生，對(duì)mtDNA形成保護(hù)作用[6]。ROS含量增加時(shí)，P53蛋白能定位、轉(zhuǎn)移到線粒體，與Polγ相互作用，增強(qiáng) Polγ的合成功能，增加mtDNA拷貝數(shù)以代償損傷的線粒體功能[7]。因此輕度氧化應(yīng)激導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)代償性增加，而當(dāng)氧化損傷超過(guò)mtDNA損傷修復(fù)系統(tǒng)代償能力時(shí)，mtDNA嚴(yán)重?fù)p傷，發(fā)生廣泛突變，觸發(fā)線粒體自噬機(jī)制[8]，清除功能障礙的線粒體，引起mtDNA拷貝數(shù)下降。

MtDNA拷貝數(shù)變異除與ROS損傷有關(guān)外，還與基因突變高度相關(guān)，mtDNA的合成一定程度上受到核基因的控制，核基因的突變同樣影響mtDNA拷貝數(shù)。以mtDNA拷貝數(shù)嚴(yán)重減少為特征的一組疾病mtDNA耗竭綜合征(mitochondrial DNA depletion syndrome，MDS)便是由核基因突變引起，這些突變基因包括：TK2、SUCLA2、SUCLG1、C10orf2、TYMP(詳見(jiàn)表1)[9]。這些基因的產(chǎn)物參與核苷酸合成以及mtDNA復(fù)制，突變后導(dǎo)致mtDNA合成發(fā)生障礙，mtDNA拷貝數(shù)減少。前文已經(jīng)敘述了野生型TP53基因在維持mtDNA穩(wěn)定上具有重要價(jià)值，而TP53發(fā)生突變則會(huì)導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)下降。對(duì)食管鱗癌研究發(fā)現(xiàn)：P53蛋白傾向于在mtDNA拷貝數(shù)降低的組織中表達(dá)。由于野生型P53半衰期短，降解迅速，難以檢出，所以組織中陽(yáng)性表達(dá)的P53蛋白通常為而半衰期延長(zhǎng)的突變型蛋白，由此提示mtDNA拷貝數(shù)減少與突變型P53蛋白的表達(dá)關(guān)系密切。其原因可能如前文所述，突變型P53蛋白無(wú)法通過(guò)P53R2、TIGAR等通路調(diào)控ROS穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致mtDNA廣泛損傷；無(wú)法與Polγ等因子相互作用，導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)復(fù)制效率下降、容易出錯(cuò)，并最終觸發(fā)線粒體自噬機(jī)制導(dǎo)致拷貝數(shù)減少。

表1 MDS中引起mtDNA拷貝數(shù)減少的常見(jiàn)突變位點(diǎn)

4 MtDNA拷貝數(shù)影響疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后機(jī)制分析

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)mtDNA拷貝數(shù)變異與多種常見(jiàn)臨床疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)以及預(yù)后具有相關(guān)性。較高的外周血mtDNA拷貝數(shù)人群具有較低的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)以及較低的糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和較晚的發(fā)病時(shí)間[10]。預(yù)后方面，周圍動(dòng)脈疾病患者全因死亡率、心腦血管事件的風(fēng)險(xiǎn)隨mtDNA拷貝數(shù)降低而增高；糖尿病患者外周血mtDNA拷貝數(shù)隨并發(fā)癥嚴(yán)重程度下降。對(duì)腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)：外周血mtDNA拷貝數(shù)升高，患癌風(fēng)險(xiǎn)增加[11]；外周血mtDNA拷貝數(shù)升高患者預(yù)后不良[12]?？傮w看來(lái)，外周血mtDNA拷貝數(shù)上升患癌風(fēng)險(xiǎn)增加、預(yù)后變差。

外周血mtDNA主要來(lái)源于白細(xì)胞，外周血mtDNA拷貝數(shù)可能影響著免疫細(xì)胞的狀態(tài)。對(duì)腫瘤患者的研究表明，外周血mtDNA拷貝數(shù)增加的患者表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫抑制，血液中較高的CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，白介素-2(interleukin 2，IL-2)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)濃度升高，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)濃度下降[13]。表明免疫細(xì)胞受到致病因素影響，mtDNA拷貝數(shù)升高，免疫系統(tǒng)受到抑制。而外周血mtDNA拷貝數(shù)降低的健康人群，血漿超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、白介素6(Interleukin 6，IL-6)、纖維蛋白原和白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高，說(shuō)明外周血mtDNA拷貝數(shù)降低時(shí)機(jī)體處于輕度炎癥狀態(tài)[14]。我們已經(jīng)熟知免疫損傷機(jī)制在糖尿病、外周動(dòng)脈疾病(動(dòng)脈粥樣硬化引起)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的病理生理學(xué)過(guò)程中起著重要作用，如1型糖尿病胰島B細(xì)胞遭到自身免疫攻擊破壞；2型糖尿病胰島素抵抗等與免疫損傷密切相關(guān)；動(dòng)脈粥樣硬化中巨噬細(xì)胞入侵血管內(nèi)膜組織被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵始動(dòng)因素；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎則是典型的自身免疫性疾病。因此，我們認(rèn)為外周血mtDNA拷貝數(shù)下降越多，免疫系統(tǒng)將處于更高的激活狀態(tài)，導(dǎo)致這類疾病病變組織遭受更嚴(yán)重的免疫損傷。在惡性腫瘤中，外周血mtDNA拷貝數(shù)升高，免疫系統(tǒng)活性下降可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)法及時(shí)識(shí)別、清除，從而使患癌及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增高。

實(shí)體組織mtDNA拷貝數(shù)變異同樣值得關(guān)注，實(shí)體組織mtDNA拷貝數(shù)變化與癌癥預(yù)后的關(guān)系較復(fù)雜，目前沒(méi)有確切的結(jié)論。食管鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織mtDNA拷貝數(shù)降低者預(yù)后差，而喉癌預(yù)后不良的患者癌組織mtDNA拷貝數(shù)卻明顯升高[15]。如前文所述，mtDNA拷貝數(shù)升高代表著mtDNA損傷、線粒體功能障礙，這與癌癥發(fā)生有關(guān)。MtDNA拷貝數(shù)變化與腫瘤預(yù)后關(guān)系不一致，可能是由于不同細(xì)胞具有不同的基礎(chǔ)拷貝數(shù)，這種差異導(dǎo)致不同細(xì)胞mtDNA發(fā)生損傷至發(fā)生拷貝數(shù)下降的臨界點(diǎn)不同，于是表現(xiàn)為不同類型的腫瘤中mtDNA拷貝數(shù)與腫瘤預(yù)后關(guān)系不一致的現(xiàn)象，但目前沒(méi)有明確的結(jié)論，其中具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

近年來(lái)，多種病變組織中mtDNA拷貝數(shù)被發(fā)現(xiàn)發(fā)生變異，mtDNA拷貝數(shù)變異機(jī)制的研究逐漸成為研究疾病發(fā)生發(fā)展的熱點(diǎn)。MtDNA拷貝數(shù)的變異機(jī)制對(duì)于解釋致病因子對(duì)細(xì)胞的損傷機(jī)制提供了新的方向，對(duì)多種疾病的發(fā)病、進(jìn)展機(jī)制進(jìn)行了補(bǔ)充，給疾病的預(yù)防、治療提供了新思路。目前研究認(rèn)為mtDNA拷貝數(shù)變異與致病因素導(dǎo)致的氧化損傷高度相關(guān)，反映了細(xì)胞及mtDNA損傷程度。MtDNA受到輕度氧化損傷將導(dǎo)致拷貝數(shù)代償性增加，過(guò)度的氧化損傷則發(fā)生拷貝數(shù)減少，核基因TP53和其他基因參與到mtDNA的修復(fù)和拷貝數(shù)的調(diào)控中。目前mtDNA拷貝數(shù)變異機(jī)制仍有尚未明確之處，例如不同組織拷貝數(shù)變異情況不同，不同種類惡性腫瘤拷貝數(shù)變異情況更是差異巨大，這種差異可能與組織器官自身能耗需求有關(guān)，但沒(méi)有確切的結(jié)論，仍需繼續(xù)研究。目前多項(xiàng)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mtDNA拷貝數(shù)與多種疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后之間具有相關(guān)性，有望成為疾病預(yù)防的新靶點(diǎn)及預(yù)測(cè)預(yù)后的新指標(biāo)，同時(shí)鑒于mtDNA拷貝數(shù)測(cè)量簡(jiǎn)便，具有良好的應(yīng)用前景，可為患者帶來(lái)福音。