小鼠骨髓漿細(xì)胞樣與髓樣樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)及對比研究

譚劍峰,李東方,郭權(quán)威,況 軍,張建華

(南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院胸外科,廣東 深圳 518000)

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是人體功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，在啟動、維持和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程中處于中心環(huán)節(jié)，被認(rèn)為是機(jī)體免疫的始動者。目前已知DC有兩個亞型，分別是漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells,pDC)和髓樣樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cells,mDC)[1]。其中mDC具備典型的樹突狀形態(tài)，膜表面中高度表達(dá)MHC-Ⅱ類分子及Toll 樣受體(Toll like receptor,TLR)2、3、4、5、6、8，能移行至淋巴器官和刺激初始型T細(xì)胞增殖活化，參與機(jī)體免疫應(yīng)答的啟動和調(diào)控，在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[2]。而pDC則是一類近年來被認(rèn)識并被證明在機(jī)體抵抗病毒感染以及在自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展方面發(fā)揮著重要調(diào)控作用的免疫細(xì)胞[3～5]。與mDC不同，pDC在形態(tài)上、分布上、TLR 受體表達(dá)上、表面標(biāo)記上均有其鮮明的特征。功能上pDC由于特征性地表達(dá)單鏈病毒RNA 配體TLR 7 和DNA病毒及CpG 寡聚脫氧核苷酸(CpG ODN)的配體TLR 9，使其能夠與mDC形成互補(bǔ)，在病毒、CpG ODN 刺激下可以迅速分泌大量的Ⅰ型干擾素，發(fā)揮強(qiáng)大的抗感染等生物學(xué)效應(yīng)[6]。關(guān)于mDC細(xì)胞亞群的體外培養(yǎng)及抗腫瘤生物學(xué)功能的研究已經(jīng)漸趨成熟，但有關(guān)pDC細(xì)胞亞群體外培養(yǎng)及抗腫瘤生物學(xué)功能研究較少，同時缺乏對pDC與mDC細(xì)胞亞群進(jìn)行系統(tǒng)性對比研究。為探討小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞亞群生物學(xué)功能的差異，我們對負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的小鼠骨髓漿細(xì)胞樣(pDC)與髓樣樹突狀細(xì)胞(mDC)亞群形態(tài)、免疫表型及細(xì)胞因子的分泌和促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖等功能方面上進(jìn)行對比實驗研究，為以DC細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物免疫治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1動物與材料:C57BL/6雄性小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)動物中心。小鼠Lewis肺癌細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫(美國)。非甲基化CpG基序的寡核苷酸(CpG ODN1826)，購自上海生工生物工程公司(中國)。IL-12 ELISA、TNF-α ELISA檢測試劑盒，購自BD公司(美國)。anti-CD11b分選磁珠及anti-mPDCA分選磁珠，購自Miltenyi Biotec公司(德國)。細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(cell conunting kit-8，CCK-8)，購自Dojido公司(日本)。重組小鼠fms樣酪氨酸激酶受體3配體(rmFlt3-Ligand)，anti-CD11c-PE mAb、anti-CD11b-APC mAb、anti-B220-FITC mAb、anti-MHC-II FITC mAb、anti-CD40 PE mAb、anti-CD80 PE mAb及anti-CD86 PE mAb，均購自eBioscience公司(美國)。

1.2實驗方法

1.2.1mDC與pDC的培養(yǎng)和分選：獲取C57BL/6小鼠的股骨骨髓細(xì)胞，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解后用RMPI-1640培養(yǎng)液(含rmFlt3-L 100ng/mL)重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度1×106/mL，并加入12孔板中培養(yǎng)，每4天時半換液，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至第15天，利用CCK-8法每2天檢測DC細(xì)胞的OD450值，然后利用流式細(xì)胞儀每4天檢測mDC及pDC的占比。后于培養(yǎng)的第8天利用磁珠分選出mDC及pDC，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度大于99%，分選得到的mDC及pDC用于后續(xù)實驗。

1.2.2DC負(fù)載Lewis肺癌細(xì)胞裂解物與DC形態(tài)觀察：取對數(shù)期Lewis肺癌細(xì)胞，胰酶消化，用PBS洗滌2次，再用PBS按2×107/mL重懸Lewis肺癌細(xì)胞,然后在液氮及37℃中反復(fù)凍融3次，10000rmp 4℃離心15min，吸取上清液備用。分別往mDC(106)、pDC(106)兩組中加入等量的腫瘤細(xì)胞裂解液上清液(按DCs：腫瘤細(xì)胞=1∶1)，對照組則加入等量的培養(yǎng)液，然后加入終濃度為2μg/mL的CpG1826培養(yǎng)24h誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟，同時利用倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量、集落等生長情況。

1.2.3混合淋巴細(xì)胞增殖實驗:獲取小鼠脾臟，利用眼科剪將脾臟剪碎，置于70μm過濾網(wǎng)上，再用1mL注射器活栓尾部研磨，同時用PBS液沖洗，將收集到的脾臟細(xì)胞懸液放入離心管中，離心(1000rmp，6min)、棄上清。加入紅細(xì)胞裂解液裂解，待裂解結(jié)束后迅速加入培養(yǎng)液中止反應(yīng)，再次離心(1000rpm，6min)，反復(fù)洗滌3次，棄上清即得脾臟細(xì)胞。將負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的mDC與pDC兩組細(xì)胞按105/孔加入64孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，然后加入脾臟細(xì)胞106/孔(按DCs：脾臟細(xì)胞=1∶10)，共培養(yǎng)3d，未負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的各組DC細(xì)胞作為對照組，共4組。同時設(shè)調(diào)零孔(培養(yǎng)液)，單獨的脾臟細(xì)胞培養(yǎng)孔(脾臟細(xì)胞及培養(yǎng)液)，每個組設(shè)3個復(fù)孔。用CCK-8法檢測混合淋巴細(xì)胞的增殖情況。采用酶標(biāo)儀測定450nm波長吸光值(OD值)，以下述公式計算刺激指數(shù)SI，SI=(實驗組吸光度-調(diào)零孔吸光度)/(單獨的脾臟細(xì)胞培養(yǎng)孔-調(diào)零孔吸光度)。

1.2.4免疫表型及細(xì)胞因子的檢測：將實驗組和對照組細(xì)胞懸液分別標(biāo)記anti-mouse CD80 PE-Cy7，anti-mouse CD86 APC，anti-mouse CD40 PE，anti-mouse MHC Class II FITC，anti-CD11c-PE mAb,anti-CD11b-APC mAb，anti-B220-FITC mAb熒光抗體，置4℃避光條件下孵育標(biāo)記30min，同時以熒光標(biāo)記的同型IgG作為對照；反復(fù)洗滌2次，1000rpm 20℃離心6min，棄上清，用200μL含1%FBS的PBS緩沖液重懸后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，實驗重復(fù)3次。分析軟件為Flowjo 7.6.1，以CD11c陽性細(xì)胞設(shè)門，門內(nèi)標(biāo)記CD11b+B220-為髓樣樹突狀細(xì)胞mDC亞群，CD11b-B220+為漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞pDC亞群。利用ELISA法檢測實驗組和對照組細(xì)胞懸液各組IL-12、TNF-α的分泌情況，具體方法參照BD公司ELISA試劑盒說明書。

2 結(jié) 果

2.1mDC與pDC細(xì)胞的分選時間:在培養(yǎng)過程中，DC細(xì)胞的OD450值(表示細(xì)胞總數(shù))先下降，至第5天時最低(0.51±0.03)，然后又上升，第9天達(dá)高峰(0.82±0.05)，后逐漸下降。mDC與pDC的占比在第0天為2.28%、1.42%，第4天為16.00%、8.29%，第8天為35.9%、27.00%，第14天為12.60%、33.7%。DC細(xì)胞OD450值的最大值在第9天(圖1)，mDC培養(yǎng)過程中占比最大值在第8天，35.9%，而pDC培養(yǎng)過程的占比最大值在第12天，33.7%(圖2)。結(jié)合培養(yǎng)過程中的細(xì)胞總數(shù)變化及mDC與pDC占比的變化，DC亞型細(xì)胞的最佳分選時間在培養(yǎng)的第8～9天。

圖1 不同時間DC細(xì)胞的OD450值

圖2 不同時間分選的mDC與pDC細(xì)胞亞型占比

2.2負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的mDC組細(xì)胞較pDC組分泌更多的細(xì)胞因子:在負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物條件下，mDC組分泌的IL-12及TNF-α分別為(2119.58±118.06)pg/mL及(590.56±125.09)pg/mL，pDC組分泌的IL-12及TNF-α(671.24±41.59)pg/mL及(298.56±50.72)pg/m，mDC組細(xì)胞分泌的IL-12及TNF-α均高于相同細(xì)胞數(shù)量的pDC組(P<0.05)；且負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的mDC組與pDC組細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-12及TNF-α均高于未負(fù)載腫瘤細(xì)胞組(P<0.05)，見圖3及圖4。

2.3負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的mDC組細(xì)胞刺激淋巴細(xì)胞增殖能力較pDC組高:負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的mDC組刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力(8.55±0.59)高于相同細(xì)胞數(shù)量下pDC組(6.93±0.40，P<0.05)；且負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的mDC組與pDC組細(xì)胞刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力高于未負(fù)載腫瘤細(xì)胞組(P<0.05)，見圖5。

圖3 不同條件各組DC細(xì)胞亞群分泌細(xì)胞因子IL-12的情況

圖4 不同條件各組DC細(xì)胞亞群分泌細(xì)胞因子TNF-α的情況(*表示P<0.05，**表示P<0.005)

圖5 不同刺激條件下各組DCs細(xì)胞刺激淋巴細(xì)胞增殖的情況(SI表示刺激指數(shù)，*表示P<0.05，**表示P<0.005)

2.4負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物mDC與pDC的鏡下形態(tài):將負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的mDC及pDC亞群進(jìn)行單獨培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察可見mDC體積較大，細(xì)胞核不規(guī)則，且細(xì)胞周邊見較多的“突起”(圖6)；而pDC體積較小，呈類圓形，大部分細(xì)胞表面無“突起”(圖7)。

圖6 DC(倒置相差顯微鏡×400)

圖7 pDC(倒置相差顯微鏡×400)

2.5負(fù)載細(xì)胞裂解物的mDC與pDC組的免疫表型表達(dá)上調(diào):結(jié)果顯示，負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的mDC組表面CD80、CD86、CD40及MHC-Ⅱ類分子平均熒光強(qiáng)度值高于相同細(xì)胞數(shù)量的pDC組，且負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的pDC與mDC組細(xì)胞表面CD80、CD86、CD40及MHC-Ⅱ類分子的平均熒光強(qiáng)度值均高于未負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物組。(圖8及圖9)。

圖8 負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物前后的mDC亞群表面CD80、CD86、CD40及MHC-II類的表達(dá)變化

圖9 負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物前后的pDC亞群表面CD80、CD86、CD40及MHC-II類的表達(dá)變化

3 討 論

在腫瘤的生物免疫治療研究中，樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)疫苗為目前研究最多、臨床應(yīng)用開展最廣泛的免疫治療方法之一。現(xiàn)研究表明，DC 是由數(shù)種亞群所組成的一個具有異質(zhì)性和多樣性的復(fù)雜生物系統(tǒng)，該系統(tǒng)中每一個DC 亞群在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著獨特的作用，共同參與對機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)[7]。從來源上DC為mDC和pDC兩大類，其中mDC是研究最早和體內(nèi)分布最廣泛的一類樹突狀細(xì)胞，也稱常規(guī)樹突狀細(xì)胞(Conventional Dendritic Cells，cDCs)，其與粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞均由骨髓中的髓系祖細(xì)胞(Common Myeloid Progenitor，CMP)分化而來。mDC有典型的樹突狀形態(tài)，高度表達(dá)MHC-Ⅱ類分子及Toll 樣受體(Toll like receptor,TLR)，提呈抗原并刺激初始型T細(xì)胞增殖活化，參與機(jī)體免疫應(yīng)答的啟動和調(diào)控。而pDC則是一類在自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及在機(jī)體抵抗病毒感染方面發(fā)揮著重要調(diào)控作用的免疫細(xì)胞，主要由骨髓中的淋巴系祖細(xì)胞(Common Lymphoid Progenitor，CLP)及髓系祖細(xì)胞(Common myeloid Progenitor，CMP)分化而來。由此可見，mDC與pDC細(xì)胞亞群在形態(tài)、免疫表型及生物學(xué)功能方面存在一定的差異。

研究表明，利用細(xì)胞因子Flt3-Ligand 在體外成功誘導(dǎo)出小鼠骨髓源性的pDC與mDC亞群，并對 pDC與mDC進(jìn)行了初步的對比研究，但不能確定pDC 與mDC的分選時間，尚未對負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的pDC 與mDC分泌細(xì)胞因子、抗原提呈及刺激淋巴細(xì)胞增殖等生物學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)研究[8]。本研究利用rmFlt3-L的體外刺激誘導(dǎo)DC細(xì)胞分化成mDC與pDC細(xì)胞,然后將分選后的mDC及pDC細(xì)胞負(fù)載Lewis肺癌細(xì)胞裂解物，以比較各組細(xì)胞形態(tài)、免疫表型CD80、CD86、CD40 及MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)變化、細(xì)胞因子IL-12及TNF-α的分泌情況及刺激淋巴細(xì)胞的增殖情況，以解決前期研究者的不足。我們在研究過程中選擇腫瘤細(xì)胞裂解物全抗原，是因為腫瘤細(xì)胞裂解物包含了全部潛在相關(guān)的抗原，從而避免了MHC限制及不需要特異性抗原表位，能降低免疫逃逸的風(fēng)險。結(jié)果表明，在rmFlt3-L的體外刺激誘導(dǎo)下，小鼠骨髓細(xì)胞可分化成pDC與mDC細(xì)胞亞群，結(jié)合培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目及mDC與pDC的占比情況，從而確定了最佳分選時間為培養(yǎng)的第8～9d。負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的mDC與pDC均能分泌細(xì)胞因子和刺激淋巴細(xì)胞增殖，且mDC細(xì)胞的生物學(xué)功能強(qiáng)于pDC細(xì)胞。為了進(jìn)一步明確mDC細(xì)胞的生物學(xué)功能強(qiáng)于pDC細(xì)胞的原因，后面我們對pDC及mDC細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)兩者各具特點，其中pDC更類似于漿細(xì)胞或單核細(xì)胞，多數(shù)為圓形，表面突起較少，而mDC形態(tài)上則與單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞類似，體積稍大，多為不規(guī)則形或圓形，胞膜可見較多突起，mDC細(xì)胞的形態(tài)較pDC成熟。同時負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的pDC與mDC組細(xì)胞表面CD80、CD86、CD40及MHC-Ⅱ類分子的平均熒光強(qiáng)度值均高于相同細(xì)胞數(shù)量的未負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物組，且在負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的條件下，mDC組表面CD80、CD86、CD40及MHC-Ⅱ類分子平均熒光強(qiáng)度值高于相同細(xì)胞數(shù)量的pDC組。由此可見，負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的pDC也具有抗腫瘤的生物學(xué)功能，這與相關(guān)文獻(xiàn)一致的[9]，但mDC細(xì)胞的生物學(xué)功能強(qiáng)于pDC細(xì)胞，這與mDC細(xì)胞的形態(tài)成熟及共刺激分子表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

綜上所述，在rmFlt3-L的體外刺激誘導(dǎo)下，小鼠骨髓細(xì)胞可分化成形態(tài)與功能不同的pDC與mDC細(xì)胞亞群，最佳的分選時間為培養(yǎng)的第8～9天。負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的pDC與mDC細(xì)胞亞群均具有分泌細(xì)胞因子及促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的生物學(xué)功能，且mDC細(xì)胞的生物學(xué)功能強(qiáng)于pDC細(xì)胞，這可能與mDC細(xì)胞的形態(tài)成熟與共刺激分子表達(dá)上調(diào)有關(guān)，為以DC細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療提供一定的理論基礎(chǔ)。