線粒體DNA拷貝數(shù)的研究新進(jìn)展

張素素(綜述)，孫 嘉(審校)

(1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，廣州 510282； 2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣州 510282)

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是唯一存在于細(xì)胞器中且相對(duì)獨(dú)立的基因組，可控制和編碼部分蛋白質(zhì)，其在基因組中的個(gè)數(shù)稱為mtDNA拷貝數(shù)。近年來，mtDNA拷貝數(shù)是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。mtDNA拷貝數(shù)的變化可能在腫瘤及多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。與核基因組相比,mtDNA缺乏有效的損傷修復(fù)系統(tǒng)，更易受環(huán)境、遺傳等因素影響，造成復(fù)制、轉(zhuǎn)錄水平及拷貝數(shù)發(fā)生變化，但其變化的具體機(jī)制尚不明確，對(duì)mtDNA拷貝數(shù)進(jìn)行研究是不斷深入了解線粒體的重要途徑之一。

1 mtDNA拷貝數(shù)的定義

mtDNA拷貝數(shù)是mtDNA在線粒體基因組中的個(gè)數(shù)，每個(gè)線粒體含有2～10個(gè)mtDNA拷貝數(shù)。正常人每個(gè)體細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)為103～104，在不同類型的組織中具有一定特異性，每個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元中分別為223～854、1075～2794、1200～10 800[1]。

2 mtDNA拷貝數(shù)的調(diào)控

有學(xué)者認(rèn)為，可能存在一個(gè)較低的mtDNA拷貝數(shù)閾值，mtDNA拷貝數(shù)低于該值會(huì)觸發(fā)激活mtDNA復(fù)制，以提高mtDNA拷貝數(shù)；而當(dāng)mtDNA拷貝數(shù)升高超過另一閾值時(shí)，會(huì)激活mtDNA的降解機(jī)制，降低mtDNA拷貝數(shù)[2]。目前存在幾種mtDNA拷貝數(shù)調(diào)控模式假說：ATP的需要量決定mtDNA的含量，但目前并無證據(jù)支持這一說法；核苷酸的利用率決定mtDNA的復(fù)制；mtDNA拷貝數(shù)受到多個(gè)復(fù)制起源的調(diào)控；線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)通過影響mtDNA復(fù)制改變其拷貝數(shù)[2]。

2.1TFAM與mtDNA拷貝數(shù) TFAM是第一個(gè)被確定的mtDNA轉(zhuǎn)錄因子，由核染色體10q21編碼,含2個(gè)高遷移率蛋白結(jié)構(gòu)域。人類細(xì)胞中約10 bp的mtDNA對(duì)應(yīng)1分子TFAM蛋白，每個(gè)mtDNA約結(jié)合1000個(gè)TFAM分子[3]。根據(jù)鏈置換模型，哺乳動(dòng)物mtDNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)在一起，TFAM介導(dǎo)mtDNA含量增加的可能機(jī)制有兩種：TFAM較高頻率地結(jié)合于輕鏈啟動(dòng)子，提升轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的復(fù)制啟始；TFAM結(jié)合全基因組，可能通過降低DNA的更新速率以穩(wěn)定mtDNA的穩(wěn)態(tài)水平[4]。亦有學(xué)者認(rèn)為，上述兩種機(jī)制并非相互排斥，主張一種通過調(diào)節(jié)TFAM活動(dòng)的多元模式控制mtDNA拷貝數(shù)的變化；除了調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始，TFAM大量且非特異地結(jié)合線粒體基因組，形成DNA環(huán)，引起超螺旋化，散在分布的點(diǎn)狀蛋白-DNA結(jié)構(gòu)形成類核[4]。類核是線粒體基因組的功能單位，保證mtDNA免受多種損害。研究發(fā)現(xiàn)，TFAM結(jié)合mtDNA，可對(duì)抗人β淀粉樣蛋白1-42對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞氧化呼吸鏈的損傷，其機(jī)制可能是TFAM過表達(dá)可維護(hù)線粒體類核結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)mtDNA拷貝數(shù)，從而改變細(xì)胞生存能力，降低細(xì)胞凋亡率[5]，可見TFAM可能與通過類核結(jié)構(gòu)保護(hù)mtDNA免受氧化損傷有關(guān)，從而調(diào)控mtDNA拷貝數(shù)。

2.2同源重組修復(fù)蛋白R(shí)ad51與mtDNA拷貝數(shù) 同源重組修復(fù)蛋白R(shí)ad51是真核細(xì)胞染色體同源重組的重要催化劑，主要存在于線粒體內(nèi)膜基質(zhì)，參與mtDNA水平的維護(hù)。Sage等[6]發(fā)現(xiàn)，Rad51重組酶以及Rad51c和Xrcc3旁系同源蛋白的協(xié)同作用可調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物受損染色體DNA的復(fù)制叉進(jìn)程，三者減少會(huì)導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)減少。無復(fù)制抑制因素存在時(shí)，Rad51缺乏可導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)整體下降45%～50%，提示mtDNA的成功復(fù)制需要Rad51[7]。可見，Rad51對(duì)mtDNA拷貝數(shù)的調(diào)控作用可能是當(dāng)復(fù)制叉遭遇損傷停滯時(shí)，參與完成mtDNA的準(zhǔn)確復(fù)制。

2.3DNA聚合酶γ與mtDNA拷貝數(shù) DNA聚合酶γ(polymerase γ，polγ)是目前已知唯一存在于線粒體內(nèi)的線粒體特異性DNA聚合酶，由一個(gè)polγ催化亞基(polγA)和兩個(gè)附屬亞基(polγB)組成，分別由不同的核基因編碼。polγ在mtDNA的復(fù)制和維護(hù)中必不可少，polγA的病理突變以mtDNA的缺失或消耗為特征。polγA對(duì)mtDNA的調(diào)控在一定程度上受核DNA甲基化的影響。老鼠出生后的干細(xì)胞中，核DNA甲基化與polγA的表達(dá)呈一定負(fù)相關(guān)性。編碼polγA的核基因CpG島上外顯子2高度甲基化，影響該CpG島下游的延伸及polγA的前體mRNA選擇性剪切和激活，抑制mRNA表達(dá)水平，從而影響mtDNA復(fù)制[8]。此外，基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島處于非甲基化狀態(tài)，發(fā)生甲基化時(shí)可導(dǎo)致基因沉默。這在一定程度上可以解釋DNA甲基化水平高，polγ表達(dá)水平和mtDNA拷貝數(shù)低的現(xiàn)象。

3 氧化應(yīng)激對(duì)mtDNA拷貝數(shù)的影響

mtDNA沒有組蛋白保護(hù)，缺乏抗氧化機(jī)制和有效修復(fù)系統(tǒng)，且接近線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈，極易受周圍活性氧類(reactive oxygen species,ROS)的損傷。當(dāng)ROS超過內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的消除能力時(shí)，氧化/抗氧化失衡，會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的出現(xiàn)。在氧化應(yīng)激作用下，mtDNA拷貝數(shù)可能升高或降低。妊娠糖尿病患者胎盤mtDNA拷貝數(shù)與氧化應(yīng)激水平呈正相關(guān)，而在心力衰竭患者心肌組織中則呈負(fù)相關(guān)[9-10]。氧化應(yīng)激在受影響的細(xì)胞中可能扮演兩種角色：一方面，輕度氧化應(yīng)激損傷線粒體氧化呼吸鏈，可刺激線粒體及mtDNA分子的增加以代償減弱的線粒體呼吸功能，保證細(xì)胞的存活、損傷修復(fù)及所需蛋白質(zhì)的合成；另一方面，氧化應(yīng)激導(dǎo)致ROS的增加和氧化損傷的進(jìn)一步加劇，超過某一閾值時(shí)，導(dǎo)致線粒體功能障礙甚至細(xì)胞死亡[11]。mtDNA的D-環(huán)區(qū)是mtDNA中兩段主要非編碼區(qū)之一，調(diào)控mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，其對(duì)氧化應(yīng)激敏感，易引起基因突變，影響mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)下降[12]。氧化應(yīng)激還可通過TFAM影響mtDNA拷貝數(shù)的變化，肝外膽汁淤積患者體內(nèi)肝臟氧化/抗氧化失衡，隨氧化應(yīng)激水平升高，TFAM及mtDNA拷貝數(shù)均呈下降趨勢(shì)[13]。Sage等[6]發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激條件下TFAM優(yōu)先結(jié)合氧化損傷的mtDNA，且結(jié)合率上升?？梢姡趸瘧?yīng)激條件下TFAM有保護(hù)mtDNA的作用[13]。

4 機(jī)體不同疾病狀態(tài)下mtDNA拷貝數(shù)的變化

4.1mtDNA拷貝數(shù)與骨質(zhì)疏松 Kim等[14]發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后婦女外周血mtDNA拷貝數(shù)減少與股骨頸骨密度降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與椎體骨密度無關(guān)聯(lián)性，其原因可能是基因在椎體受影響較小或生物力學(xué)對(duì)椎體與股骨頸骨密度變化影響不一致。絕經(jīng)后婦女雌激素水平顯著下降，抗氧化能力減弱，補(bǔ)充雌激素可降低氧化應(yīng)激水平并增強(qiáng)抗氧化作用[15]。但Kim等[14]的研究未檢查受試者外周血氧化應(yīng)激水平，故對(duì)于氧化應(yīng)激是否是連接mtDNA拷貝數(shù)與BMD變化的中間紐帶有待進(jìn)一步研究。

4.2mtDNA拷貝數(shù)與糖尿病及其并發(fā)癥 mtDNA拷貝數(shù)與糖尿病患者體內(nèi)的脂肪氧化速率、胰島素敏感性及胰島素分泌呈正相關(guān)[16]。糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠病程初期，線粒體損傷防御機(jī)制活躍，TFAM、D-環(huán)區(qū)mtDNA-TFAM復(fù)合物、polγ及mtDNA拷貝數(shù)升高；隨著病程進(jìn)展，mtDNA修復(fù)和復(fù)制機(jī)制不堪重負(fù)開始崩解；病程6個(gè)月時(shí)線粒體DNA功能受損，TFAM、mtDNA-TFAM復(fù)合物減少，mtDNA拷貝數(shù)下降。且糖尿病高糖血癥容易引起氧化應(yīng)激，早期通過刺激polγ、TFAM等促進(jìn)mtDNA拷貝數(shù)增加，以代償線粒體功能障礙。隨著氧化應(yīng)激加劇，代償機(jī)制崩潰，polγ、TFAM減少，mtDNA拷貝數(shù)隨之下降[17]。

4.3mtDNA拷貝數(shù)與心血管疾病 心臟在體內(nèi)具有最高的攝氧率，心力衰竭患者心肌組織氧化應(yīng)激水平升高，過氧化物還原酶3過表達(dá)，使用線粒體抗氧化劑或TFAM增加可以改善mtDNA拷貝數(shù)減少的現(xiàn)象，從而改善心力衰竭的病理生理進(jìn)程[10]。3～4個(gè)月齡心臟功能正常的小鼠，隨mtDNA拷貝數(shù)下降和氧化應(yīng)激水平增加可發(fā)生嚴(yán)重異常情況[18]?？梢姡琺tDNA拷貝數(shù)下降可能是預(yù)測(cè)心肌病的發(fā)生、發(fā)展的因素之一。提高mtDNA拷貝數(shù)能減緩循環(huán)壓力超負(fù)荷小鼠模型左心室心肌纖維化進(jìn)程，可成為治療高血壓性心臟病的新途徑[19]。

4.4mtDNA拷貝數(shù)與腫瘤 線粒體對(duì)許多致癌因素敏感，mtDNA拷貝數(shù)的變化與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。外周血mtDNA拷貝數(shù)減少可導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP減少的同時(shí)伴糖酵解的增強(qiáng)，增加肝細(xì)胞癌、進(jìn)展期胃癌、腎細(xì)胞癌等風(fēng)險(xiǎn)，低mtDNA拷貝數(shù)者腎細(xì)胞癌患病率比對(duì)照組高1.56倍[1,20]。在肺癌、胰腺癌等腫瘤中，mtDNA拷貝數(shù)增高；而大腸癌與mtDNA拷貝數(shù)過低或過高均有關(guān)，呈U形曲線關(guān)系[21]。mtDNA拷貝數(shù)與某些腫瘤分化程度成反比，過去認(rèn)為乳腺癌患者mtDNA拷貝數(shù)減少；Xia等[22]發(fā)現(xiàn)Ⅰ期乳腺癌患者mtDNA拷貝數(shù)呈低水平，而Ⅱ～Ⅳ期患者則增高。這可能與mtDNA受ROS不斷攻擊，復(fù)制增強(qiáng)以及代償能量需求有關(guān)。一項(xiàng)最新研究顯示，患者乳腺癌確診前3年的外周血mtDNA拷貝數(shù)下降，提示亞臨床乳腺癌也會(huì)影響mtDNA拷貝數(shù)的變化[23]。故mtDNA拷貝數(shù)變化可能是腫瘤發(fā)生過程中的一個(gè)早期事件。

5 結(jié) 語

關(guān)于mtDNA拷貝數(shù)的研究越來越多，涉及的范圍愈加廣泛，隨著科學(xué)研究的不斷發(fā)展，越來越多疾病被發(fā)現(xiàn)與mtDNA拷貝數(shù)的變化具有相關(guān)性，mtDNA拷貝數(shù)變化受環(huán)境、遺傳等因素影響，其中氧化應(yīng)激作用是重要因素之一，不同因素對(duì)mtDNA拷貝數(shù)具體調(diào)控機(jī)制有待更多的研究去闡明。如何根據(jù)mtDNA拷貝數(shù)的變化對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展做出預(yù)測(cè)及恰當(dāng)治療，也將是今后研究的重要方向。

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