低氧環(huán)境可體外促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為擬胚體

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)和疾病建模領(lǐng)域，都具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。與胚胎干細(xì)胞不同的是，它們可在保留原宿主遺傳信息的情況下進(jìn)行多向分化，而且不引發(fā)倫理問題。目前，擬胚體形成法是人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為成體細(xì)胞的主要方法之一，該方法模擬了早期胚胎發(fā)育的生理過程。

大血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，當(dāng)腦部血管硬化時(shí)，可能會(huì)影響腦血流動(dòng)力學(xué)，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)長期處于慢性缺血缺氧狀態(tài)，對(duì)認(rèn)知水平產(chǎn)生影響；微血管病變是糖尿病另一主要并發(fā)癥，其病理改變包括微循環(huán)障礙、微血管形成和基底膜增厚，手術(shù)和麻醉的應(yīng)激可能會(huì)加重這一病理改變，繼而加重認(rèn)知損傷。

在體外懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞因細(xì)胞間重力和張力作用自發(fā)形成的細(xì)胞聚集體即為擬胚體，具有向三胚層分化的潛力。擬胚體分化過程需要相對(duì)較長的培養(yǎng)時(shí)間，細(xì)胞外部培養(yǎng)環(huán)境可對(duì)細(xì)胞分化、形態(tài)和增殖等生物學(xué)行為產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。目前，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞主要采用21%氧氣條件進(jìn)行擬胚體分化，但在正常的人體生理狀態(tài)下，干細(xì)胞主要生存于低氧環(huán)境，氧氣濃度范圍在1%～9%。因此有必要深入了解低氧環(huán)境是否有助于干細(xì)胞向擬胚體分化。目前低氧環(huán)境對(duì)不同來源干細(xì)胞形成擬胚體過程的影響結(jié)論不一，有研究顯示人胚胎干細(xì)胞形成擬胚體過程中，低氧環(huán)境可以促進(jìn)細(xì)胞的分化過程，但是會(huì)增加了細(xì)胞凋亡而減緩擬胚體生長速度；但也有不同的研究結(jié)果顯示，低氧環(huán)境能促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞或鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞更高效地向擬胚體分化；還有研究使用牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形成擬胚體，發(fā)現(xiàn)擬胚體的形成并不受到低氧環(huán)境的影響。在低氧條件下，細(xì)胞主要受HIF-1α和其他相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，例如Wnt/β-catenin和VEGFA信號(hào)通路，均可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和存活。關(guān)于低氧環(huán)境是否有利于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞通過擬胚體法進(jìn)行分化，以及不同時(shí)間點(diǎn)上產(chǎn)生何種影響等問題，目前均未有明確結(jié)論。

本研究擬采用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過設(shè)計(jì)正常氧氣濃度及低氧兩種不同環(huán)境，結(jié)合分化過程的時(shí)間軸獲得不同階段變化結(jié)果，對(duì)分化過程中擬胚體的形成、成熟、粘附、擴(kuò)增和三胚層分化潛力的功能特性進(jìn)行分析判斷，并且進(jìn)一步檢測低氧信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

mTeSR1 培養(yǎng)基、ReLeSR、Dispase、L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.1%明膠（STEMCELL）；低生長因子-基質(zhì)膠、超低吸附六孔板（BD Corning）；高糖DMEM、胎牛血清FBS、PBS（Gibco）；β-巰基乙醇、多聚甲醛（Sigma）；HIF-1α特異性抑制劑Echinomycin、抗OCT4、SOX2、NANOG 抗 體（Abcam）；Image-iT ?Green缺氧檢測試劑、Alexa Fluor 488二抗、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、Trizol試劑（Invitrogen）；預(yù)混型定量用反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green染料法標(biāo)準(zhǔn)型定量試劑盒（寶日醫(yī)公司）；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、細(xì)胞總蛋白提取試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天公司）；抗體HIF-1α、β-catenin、VEGFA、Tublin（Abcam）；THUNDER 3D細(xì)胞顯微鏡（Leica）；低氧培養(yǎng)箱、全波長酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）；熒光定量PCR 儀（qTOWER3G）；SDS-PAGE電泳儀（Bio-Rad）化學(xué)發(fā)光成像儀（ImageQuant LAS 500）。

市中心遠(yuǎn)遠(yuǎn)地朦朦朧朧地站著，行人很少，全街靜悄無聲。我們一家挨一家地問著，我比她更急切，我想趕快買到吧，我小心地盤問著那些店員們，我從來不放棄一個(gè)細(xì)微的機(jī)會(huì)，我鼓勵(lì)翠姨，沒有忘記一家。使她都有點(diǎn)兒詫異，我為什么忽然這樣熱心起來，但是我完全不管她的猜疑，我不顧一切地想在這小城里，找出一雙絨繩鞋來。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將第15～18代的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞接種于普通六孔板中，細(xì)胞生長至80%后用Dispase消化成細(xì)胞團(tuán)塊，平均分到兩個(gè)超低吸附六孔板的孔中，分別在21%氧氣（懸浮常氧組）和5%氧氣（懸浮低氧組）條件下培養(yǎng)5 d，隨后取將懸浮低氧組的擬胚體平均分到兩個(gè)明膠包被的六孔板中，一組繼續(xù)在5%氧氣條件下培養(yǎng)2 d（貼壁低氧組），另一組先在5%氧氣條件下培養(yǎng)1 d后加入1 nmol/L Echinomycin（貼壁低氧組＋Echinomycin），繼續(xù)培養(yǎng)1 d；從常氧培養(yǎng)的懸浮擬胚體中取與貼壁低氧組等量的懸浮擬胚體，繼續(xù)在21%氧氣條件下培養(yǎng)2 d（貼壁常氧組），每組至少重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.3 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)

將Cellapy公司購買的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞接種于表面涂有低生長因子-基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿上，并在21%氧氣條件下用mTeSR1培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基，每4天使用ReLeSR 將細(xì)胞以團(tuán)塊形式消化傳代。

通過RT-PCR檢測人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、21%和5%氧氣條件下擬胚體的三胚層標(biāo)記基因表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形成擬胚體后各胚層的基因表達(dá)均上調(diào)，包括內(nèi)胚層標(biāo)記基因AFP、FOXA2和GATA6（圖4A），中胚層標(biāo)記基因ACTA、LPL 和SPP（圖4B），外胚層標(biāo)記基因PAX6、VIMENTIN 和NESTIN（圖4C）。

1.4 懸浮期和貼壁期擬胚體的低氧檢測

分別在21%和5%氧氣條件下，取適量懸浮期第5天以及貼壁期第2天的擬胚體到玻璃培養(yǎng)皿，將ImageiT?Green缺氧檢測試劑加入到細(xì)胞培養(yǎng)基，使其濃度達(dá)到5μmol/L，接著繼續(xù)在原條件下孵育1 h，用DAPI進(jìn)行核染色，最后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化形成懸浮擬胚體

當(dāng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生長達(dá)到培養(yǎng)皿的80%時(shí)，利用Dispase消化7 min后機(jī)械刮取細(xì)胞，確保初始細(xì)胞團(tuán)塊大小相似，排除初始細(xì)胞密度和大小對(duì)后續(xù)擬胚體發(fā)育的影響，隨后均勻分到兩個(gè)超低吸附六孔板中，分別21%和5%氧氣條件下，在mTeSR1培養(yǎng)基中形成懸浮擬胚體，在整個(gè)分化過程中，氧氣濃度始終保持不變。擬胚體懸浮階段，mTeSR1培養(yǎng)基逐漸轉(zhuǎn)為擬胚體培養(yǎng)基（高糖DMEM、10%FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.012 mmol/L β-巰基乙醇），懸浮期mTeSR1培養(yǎng)基和擬胚體培養(yǎng)基配比為：第1天2∶1，第2天1∶1，第3天1∶2，第4天和第5天100%擬胚體培養(yǎng)基。

1.6 擬胚體的貼壁培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)觀察到人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是以集落樣生長方式為主，邊界清晰，集落形態(tài)呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，集落中的細(xì)胞緊密地聚集在一起，且細(xì)胞核質(zhì)比高。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有多能性，通過免疫熒光法檢測相關(guān)干性標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)集落內(nèi)的細(xì)胞均發(fā)出紅色熒光，強(qiáng)烈表達(dá)OCT4、SOX2、NANOG（圖1）。

1.7 細(xì)胞免疫熒光

用作品來說話，是一個(gè)歌手最直接的表達(dá)；作品能否長久地被接受，是對(duì)歌手最真實(shí)的考驗(yàn)。說唱對(duì)艾熱來說，是青春期想要表達(dá)自我、抒發(fā)感情或者發(fā)泄情緒時(shí)遇見的一種音樂類型，它不僅僅教會(huì)了艾熱用另一種方式說話，也帶給了他成就感。

3.4 個(gè)體化系統(tǒng)管理模式提高母乳喂養(yǎng)率 觀察組產(chǎn)婦在產(chǎn)后半小時(shí)給予早接觸、早吸吮，產(chǎn)后4 h給予乳房按摩催乳，及母乳喂養(yǎng)的指導(dǎo)，結(jié)果顯示，觀察組產(chǎn)婦泌乳始動(dòng)時(shí)間明顯早于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。產(chǎn)后24 h體內(nèi)血清PRL水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從而為泌乳奠定了基礎(chǔ)，保證了圍產(chǎn)期的泌乳量，提高了母乳喂養(yǎng)率[13]。本文觀察組產(chǎn)后42 d純母乳喂養(yǎng)率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.8 RT-PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)

使用Trizol 試劑抽提人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、21%和5%氧氣條件下懸浮期第5天擬胚體以及貼壁期第2天各組擬胚體的總RNA，每個(gè)樣本取1 μg RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，引物序列見表1，分別擴(kuò)增內(nèi)胚層相關(guān)基因（AFP,FOXA2,GATA6）、中胚層相關(guān)基因（ACTA,LPL,SPP）和外胚層相關(guān)基因（PAX6,VIMENTIN,NESTIN），低氧相關(guān)信號(hào)通路（HIF-1α、β-catenin、VEGFA），以β-actin作為內(nèi)參基因。兩步法PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃30 s，1個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)：95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；熔解：95 ℃15 s，60 ℃1 min。

1.9 Western blot檢測HIF-1α、β-catenin和VEGFA蛋白表達(dá)情況

擬胚體貼壁2 d后，利用RT-PCR檢測21%和5%氧氣條件下HIF-1α、β-catenin、VEGFA基因的表達(dá)情況，可見不同氧氣條件下HIF-1α的mRNA水平?jīng)]有明顯差異（＞0.05），而低氧條件下β-catenin和VEGFA基因的表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6A，＜0.05）。接著，利用Western blot 檢測2 種氧氣條件下HIF-1α、βcatenin和VEGFA蛋白的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與21%氧氣條件組相比，低氧條件可上調(diào)HIF-1α、βcatenin 和VEGFA 蛋白的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6B、C，＜0.05）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

擬胚體貼壁1 d后，會(huì)有部分?jǐn)M胚體無法粘附到培養(yǎng)皿上，常氧和低氧組的擬胚體粘附率分別為71.67%和81.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5A、B，＜0.05）。擬胚體粘附后，開始有不規(guī)則的多邊形細(xì)胞從擬胚體邊緣爬出，計(jì)算粘附第2天與第1天擬胚體邊緣生長出細(xì)胞的直徑比值，在常氧和低氧條件下直徑分別增加了2.75倍和6.39倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5C、D，＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的鑒定

將等量21%和5%氧氣條件下培養(yǎng)了5 d的擬胚體接種到涂有0.1%明膠的培養(yǎng)皿上，加入2 mL擬胚體培養(yǎng)基培養(yǎng)，1 d后吸走未貼壁的擬胚體，計(jì)算擬胚體貼壁率；繼續(xù)在21%和5%氧氣條件下培養(yǎng)1 d，顯微鏡下觀察從擬胚體4周爬出的細(xì)胞，通過與第1天貼壁時(shí)的擬胚體直徑相比，評(píng)估擬胚體貼壁后的增殖速率。

2.2 擬胚體懸浮期和貼壁期低氧環(huán)境的檢測

利用Image-iT?Green缺氧檢測試劑檢測細(xì)胞低氧情況，與21%氧氣條件下培養(yǎng)的細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞置于5%氧氣條件時(shí)綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（圖2）。

2.3 低氧環(huán)境能夠促進(jìn)懸浮擬胚體的形成和成熟

利用顯微鏡觀察人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形成擬胚體過程的形態(tài)變化，在常氧和低氧條件下，懸浮培養(yǎng)1 d后的擬胚體直徑大約在100 μm，結(jié)構(gòu)均較為簡單，主要由緊密排列的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞組成。懸浮培養(yǎng)的第3天，低氧組出現(xiàn)內(nèi)部顏色較深的擬胚體即為囊性擬胚體，是擬胚體成熟的重要標(biāo)志，而在常氧組，懸浮期第4天才可觀察到少量囊性擬胚體。懸浮培養(yǎng)5 d后，幾乎所有低氧條件下的擬胚體發(fā)生囊腔化，邊緣光滑整齊，大小顏色相對(duì)一致，而在常氧條件下可觀察到大小不同的擬胚體，且未完全呈現(xiàn)囊腔化。在5天的懸浮期里，隨著擬胚體內(nèi)部細(xì)胞的不斷生長，常氧組和低氧組的平均擬胚體直徑逐漸增長到200 μm左右，二者無明顯差異。此外還可以觀察到懸浮期內(nèi)常氧組的擬胚體周圍每天都會(huì)有較多的細(xì)胞碎片，大多是凋亡的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，而低氧條件下，細(xì)胞碎片明顯減少（圖3），低氧可促進(jìn)懸浮期內(nèi)擬胚體的形成和后續(xù)的成熟。

2.4 21%和5%氧氣條件下形成的擬胚體均具有向三胚層分化的潛力

長垣縣位于河南省東北部，土質(zhì)肥沃，農(nóng)用價(jià)值高，種植作物以小麥、玉米、花生等為主。近年來，為順應(yīng)市場發(fā)展要求，實(shí)現(xiàn)農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效的目的，長垣縣堅(jiān)持以綠色理念引領(lǐng)農(nóng)業(yè)發(fā)展，大力調(diào)整農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)，積極推動(dòng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展區(qū)域布局規(guī)劃，完善涉農(nóng)優(yōu)惠扶持政策，大力發(fā)展現(xiàn)代高效農(nóng)業(yè)，持續(xù)提高農(nóng)業(yè)板塊比較效益。

2.5 低氧環(huán)境有利于提升擬胚體貼壁率以及貼壁后細(xì)胞從擬胚體邊緣向外生長

本研究采用軟件SPSS 27.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料，兩組獨(dú)立樣本采用檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，多組樣本間比較采用單因素方差分析，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 21%和5%氧氣條件下貼壁擬胚體HIF-1α、βcatenin、VEGFA的表達(dá)

收集貼壁2 d的擬胚體，預(yù)冷PBS洗滌3次后加入細(xì)胞蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取樣本總蛋白，BCA法檢測各組樣本蛋白濃度，按每孔20 μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，隨后加入相應(yīng)一抗，4 ℃條件下孵育過夜。第2天回收一抗，TBST洗膜3次后加入相應(yīng)二抗4 ℃孵育2 h，再次洗膜3次后，利用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）檢測顯影，使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值定量分析，以Tublin作為內(nèi)部參考。

將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞接種在裝有玻璃載玻片的六孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長到30%時(shí)，用PBS 輕輕洗滌3 次，室溫條件下用4%多聚甲醛固定30 min，然后用含有10% FBS的PBST（含有0.3%Triton X-100的PBS）通透封閉45 min，接著細(xì)胞與待測的一抗在4 ℃下孵育過夜。一抗孵育后PBS 洗3 次，常溫下再與相應(yīng)的二抗孵育1 h，PBS漂洗，隨后對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行DAPI染色。最后用熒光顯微鏡觀察染色細(xì)胞，并使用Image J軟件完成圖像處理和分析。

2.7 5%氧氣條件下HIF1α抑制劑Echinomycin對(duì)貼壁擬胚體的β-catenin和VEGFA表達(dá)的影響

Echinomycin 是HIF-1α的特異性抑制劑，使用1 nM的Echinomycin處理5%氧氣條件下的貼壁擬胚體1 d后，利用Western blot可檢測到HIF-1α明顯下調(diào)，βcatenin和VEGFA也顯著下調(diào)（圖7A、B，＜0.05）。

3.1 科學(xué)規(guī)劃 適地適栽，避免在冬季氣溫過低（美味獼猴桃一般極端最低溫度不低于-15℃，中華獼猴桃不低于-10℃）的地方建園；避免在盆地、低洼地或河灘地、空氣不流暢的地方建園；選擇土層深厚、土壤肥沃的園地建園。同時(shí)，盡量選擇抗寒性強(qiáng)的砧木和品種。

3 討論

氧氣是胚胎發(fā)育的一種基本生理?xiàng)l件，其早期階段是在一個(gè)相對(duì)低氧的環(huán)境中進(jìn)行的，可能是因?yàn)樵缙谘h(huán)系統(tǒng)沒有完全建立，血液氧氣擴(kuò)散受到限制，也可能是胚胎時(shí)期的細(xì)胞處于快速增殖期，氧氣消耗量大。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，低氧濃度可顯著促進(jìn)胚胎發(fā)育至囊胚期，從而提高胚胎質(zhì)量。由此推斷，生理低氧濃度應(yīng)該會(huì)對(duì)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向擬胚體分化過程產(chǎn)生影響。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確證實(shí)這一推斷，發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境有利于生成大量貼壁性能高、增殖速度快且大小分布較均勻的擬胚體，且低氧條件不影響擬胚體三胚層分化潛力。

有學(xué)者提出在干細(xì)胞向擬胚體分化的過程中，細(xì)胞內(nèi)線粒體的代謝副產(chǎn)物活性氧會(huì)急劇增加，活性氧對(duì)細(xì)胞毒性很大，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。推測低氧可以抑制線粒體功能，減少有害的活性氧的過度產(chǎn)生，降低細(xì)胞凋亡，從而加強(qiáng)懸浮擬胚體中細(xì)胞間的相互聯(lián)系。本研究結(jié)果也顯示低氧環(huán)境促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形成大小較均勻的、成熟比例增多的擬胚體，證明低氧環(huán)境對(duì)均勻成熟擬胚體的形成以及進(jìn)一步穩(wěn)定分化的可行性和重要性。

農(nóng)場雖然耕地面積較大但大型谷物聯(lián)合收割機(jī)和配套農(nóng)具數(shù)量多遠(yuǎn)多于地方，部分合作社和農(nóng)戶要等到農(nóng)場收獲完成后租賃農(nóng)場機(jī)械進(jìn)行收獲作業(yè)，錯(cuò)過了最佳收獲時(shí)期無法保證顆粒歸倉。

我們發(fā)現(xiàn)，低氧組獲得的懸浮擬胚體與培養(yǎng)皿的粘附性較常氧組強(qiáng)，且相同時(shí)間內(nèi)向外擴(kuò)增的距離更大，提示低氧可以促進(jìn)擬胚體的粘附和增殖性能。這可能與分化的成熟擬胚體較多，細(xì)胞分泌的促粘附細(xì)胞因子增多有密切關(guān)系。此外，低氧還可促進(jìn)干細(xì)胞分化過程中細(xì)胞的增殖能力，其機(jī)制可能與HIF-1α及其下游等相關(guān)信號(hào)通路被激活有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α主要在蛋白質(zhì)水平而不是在mRNA水平上發(fā)揮作用，這與之前的研究結(jié)果一致。我們還發(fā)現(xiàn)，βcatenin和VEGFA的mRNA和蛋白質(zhì)水平均可在低氧條件下上調(diào)，這些分子均可受HIF-1α激活調(diào)控，參與多種細(xì)胞生物學(xué)行為，包括細(xì)胞存活、粘附和擴(kuò)增。因此，有理由認(rèn)為，適當(dāng)?shù)牡脱醺玫啬M了擬胚體發(fā)育的微環(huán)境，為細(xì)胞擴(kuò)增提供了更合適的生存條件。當(dāng)然，為了獲取足夠數(shù)量的細(xì)胞，研究者們還嘗試通過改善細(xì)胞外基質(zhì)、施加力學(xué)刺激和優(yōu)化培養(yǎng)基質(zhì)等方法來改善細(xì)胞粘附性能，提高后續(xù)細(xì)胞增殖速度。

綜上所述，低氧環(huán)境的設(shè)計(jì)可以明顯促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為擬胚體的過程，且目前很多干細(xì)胞分化方案都是基于擬胚體分化體系建立的，可通過調(diào)節(jié)氧氣濃度或者HIF-1α/β-catenin/VEGFA通路控制擬胚體的分化方向，從而提高干細(xì)胞的分化效率，這將為進(jìn)一步推動(dòng)其應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。