懸滴培養(yǎng)法促進(jìn)雞胚胎干細(xì)胞形成類胚體

張 蕾，王宵燕，左其生，路鎮(zhèn)宇，王 飛，紀(jì)艷芹，王穎潔，張亞妮*，李碧春*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009； 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300)

懸滴培養(yǎng)法促進(jìn)雞胚胎干細(xì)胞形成類胚體

張 蕾1，2，王宵燕1，左其生1，路鎮(zhèn)宇1，王 飛1，紀(jì)艷芹1，王穎潔1，張亞妮1*，李碧春1*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009； 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300)

本研究旨在通過懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)雞胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)，摸索雞胚胎干細(xì)胞形成類胚體(Embryoid body，EB)的最佳方案，以期提高雞胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)效率。 將雞ESCs培養(yǎng)傳代至第3代，采用1×104、3×104和6×104mL-13個(gè)細(xì)胞濃度，使用懸滴培養(yǎng)后，觀察類胚體的形成效率。對(duì)懸滴培養(yǎng)形成的類胚體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，qRT-PCR檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，并進(jìn)行類胚體自分化檢測(cè)和核型分析。3×104mL-1細(xì)胞濃度生成的類胚體數(shù)量最高，單個(gè)視野下可觀察到約267個(gè)類胚體，且形成的類胚體大小均一，呈圓球狀。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在類胚體形成48 h內(nèi)，干細(xì)胞標(biāo)記基因Nanog、Sox2、Oct4和C-kit仍維持表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示，該方法形成的類胚體表面抗原檢測(cè)Nanog和SSEA-1呈陽(yáng)性。自分化檢測(cè)三胚層分化標(biāo)記基因SOX17、SMA和TUJ-1呈陽(yáng)性。核型分析顯示，懸滴培養(yǎng)形成的類胚體具有并保持正常的核型。雞ESCs懸滴培養(yǎng)形成類胚體的適宜細(xì)胞濃度為3×104mL-1，且形成的類胚體可分化成3個(gè)胚層，用于體外定向誘導(dǎo)過程。本研究建立了雞ESCs體外懸滴培養(yǎng)形成類胚體的培養(yǎng)體系，為后期信號(hào)通路的體外驗(yàn)證提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

類胚體；懸滴培養(yǎng)；雞；胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)具有多向分化的潛能，能夠分化成包括內(nèi)胚層、中胚層和外胚層3個(gè)胚層在內(nèi)的各種類型細(xì)胞，因此ESCs不僅僅可應(yīng)用于早期胚胎發(fā)育的研究，還可作為細(xì)胞替代治療和藥物篩選等的細(xì)胞來源。胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化是指在體外將胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成具有功能的其他類型細(xì)胞，純化的ESCs在非細(xì)胞因子體外培養(yǎng)條件下(無白血病抑制因子等細(xì)胞分化抑制因子)可自發(fā)形成類胚體(Embryoid body，EB)[1-4]。EB由分化細(xì)胞和未分化細(xì)胞組成，在形成階段具有較強(qiáng)的分化潛能，故在EB早期形成階段常被用于生產(chǎn)不同細(xì)胞系[5]。EB還被廣泛用于特定組織細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，有助于提高定向誘導(dǎo)的分化效率[6-7]。因此，EB的制備已經(jīng)成為干細(xì)胞研究不可或缺的工具[8-10]。

家禽是發(fā)育生物學(xué)中重要的動(dòng)物模型，且從雞胚中可以獲得能夠滿足研究需要的雞ESCs，克服了取材和倫理上的限制。本課題組一直致力于家雞ESCs的體外定向誘導(dǎo)分化研究[11-13]，通過特定的誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)雞ESCs形成雄性生殖細(xì)胞，然而誘導(dǎo)效率較低。本研究以家雞為研究對(duì)象，采用懸滴培養(yǎng)方法，用不同細(xì)胞濃度的ESCs形成類胚體，并通過形態(tài)學(xué)、qRT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)形成的類胚體中全能性基因的表達(dá)。摸索雞ESCs懸滴培養(yǎng)形成類胚體的最佳條件，通過類胚體進(jìn)行體外誘導(dǎo)，從而進(jìn)一步提高雞雄性生殖細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。該研究為進(jìn)一步優(yōu)化雞ESCs向生殖細(xì)胞定向分化提供理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮受精蛋來自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所實(shí)驗(yàn)禽場(chǎng)如皋黃雞雞群。按H.Eyal-Giladi等[14]方法分為Ⅸ～Ⅺ期，采用產(chǎn)蛋后5 h以內(nèi)的雞蛋進(jìn)行雞胚盤細(xì)胞的分離。

主要試劑：高糖DMEM(Gibco，美國(guó))；胎牛血清(Hyclone，美國(guó))；β-巰基乙醇(BBI，加拿大)； 胚胎階段特異抗原1(SSEA-1)、Sox2和IgG-FITC(Genetimes)(博奧森，北京)；雞血清、L-谷氨酰胺、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、人干細(xì)胞因子(hSCF)、鼠白血病抑制因子(mLIF)(Sigma，美國(guó))。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(天根，北京)。

1.2 方法

1.2.1 雞ESCs的分離培養(yǎng)及鑒定 參照孫敏等[13]ESCs分離培養(yǎng)及傳代步驟進(jìn)行。

1.2.2 懸滴培養(yǎng)雞ESCs 將雞ESCs培養(yǎng)傳代至第3代，待ESCs克隆開始形成，大小相差不大時(shí)，加入1 mg·mL-1Collage Ⅳ，37 ℃消化10 min，加入含5% FBS的DMEM終止消化，收集ESCs克隆并制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，設(shè)立3個(gè)細(xì)胞濃度：1×104、3×104和6×104mL-1，每組3個(gè)重復(fù)。將10 cm的培養(yǎng)皿上蓋打開，內(nèi)表面朝上，25 μL細(xì)胞懸液，逐滴整齊地滴加在皿蓋上；在皿內(nèi)加上3 mL PBS后，小心將皿蓋扣至皿底上，再將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中。采用倒置顯微鏡每隔24 h觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化情況。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè) 各組細(xì)胞懸滴培養(yǎng)后，分別提取0、24和48 h的細(xì)胞總RNA。每個(gè)時(shí)期均有3個(gè)重復(fù)。將獲取的總RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。qRT-PCR所需引物信息見表1。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) 懸滴培養(yǎng)48 h后，用微量移液器將各組懸滴培養(yǎng)后形成的EB吸出，分別接種到多聚賴氨酸處理過的24孔板內(nèi)。待細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定30 min。PBS漂洗3次后，用10% BSA-PBS封閉液37 ℃孵育1 h。分別滴加1∶200倍稀釋的一抗anti-Nanog和anti-SSEA-1，37 ℃孵育45 min后， PBST漂洗3次。再以1∶100倍稀釋的FITC標(biāo)記的二抗于37 ℃避光孵育45 min。PBST漂洗3次后，甘油封片，倒置顯微鏡下觀察、拍照。

表1 qRT-PCR鑒定所需基因引物及片段大小

Table 1 Primer information for qRT-PCR

基因名稱Genename堿基序列(5′→3′)Primersequence上游引物Forwardprimer下游引物Reverseprimer片段大小/bpSizeNanogF：TGGTTTCAGAACCAACGAATGAAGR：TGCACTGGTCACAGCCTGAAG180Sox2F：GAAGATGCACAACTCGGAGATCAGR：GAGCCGTTTGGCTTCGTCA100Oct4F：ACCAGCATCGAGACCAACGTGAR：TTGCAGAACCAGACCCGGACA117β?actinF：CAGCCATCTTTCTTGGGTATR：CTGTGATCTCCTTCTGCATCC164

1.2.5 核型分析 懸滴培養(yǎng)48 h后，用含有0.1 μg·mL-1秋水仙素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 h。微量移液器將各組懸滴培養(yǎng)后形成的EB吸出，用0.25%胰酶消化細(xì)胞。參照徐琪等[15]方法進(jìn)行核型分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均采用Office2010 Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用SPSS19.0進(jìn)行雙因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 雞ESCs的特異性鑒定

培養(yǎng)至第3代的ESCs可形成明顯的細(xì)胞克隆，且克隆邊界清晰，呈鳥巢狀。對(duì)這些克隆進(jìn)行多能性鑒定，結(jié)果顯示：經(jīng)AKP染色后，ESCs克隆呈現(xiàn)棕紅色(圖1A)；SSEA-1染色后，可在熒光顯微鏡下觀察到ESCs表面的綠色熒光(圖1B)。該結(jié)果表明第3代的ESCs克隆保持有干性，還處于未分化狀態(tài)。

2.2 懸滴培養(yǎng)制備類胚體

將培養(yǎng)至第3代雞ESCs細(xì)胞消化成單細(xì)胞，用普通培養(yǎng)液分別重懸細(xì)胞至1×104、3×104和6×104mL-13個(gè)細(xì)胞濃度，進(jìn)行懸滴培養(yǎng)。采用倒置顯微鏡在0 、24和48 h觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化情況(圖2)。單個(gè)視野內(nèi)對(duì)形成的類胚體計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)24 和48 h類胚體的形成數(shù)量，每組3個(gè)重復(fù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1×104mL-1細(xì)胞濃度懸滴培養(yǎng)24 h出現(xiàn)少量有10～15個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的圓球狀類胚體，48 h類胚體數(shù)量增多，體積增大，隱約可見中心有囊腔形成(圖2A)；3×104mL-1細(xì)胞濃度懸滴培養(yǎng)24 h出現(xiàn)較多圓球狀類胚體，48 h類胚體體積增大，且數(shù)量增加，開始形成囊腔(圖2B)；6×104mL-1細(xì)胞濃度懸滴培養(yǎng)24 h細(xì)胞開始增殖，并開始出現(xiàn)細(xì)胞聚集，有單個(gè)類胚體形成，且類胚體體積較小，約由3～8個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，48 h出現(xiàn)少量圓球狀類胚體，此時(shí)類胚體體積小于其他兩組，未觀察到囊腔形成(圖2C)。對(duì)單個(gè)視野下類配體形成數(shù)量統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，懸滴培養(yǎng)24 h后，1×104mL-1細(xì)胞濃度單個(gè)視野下約有22個(gè)類胚體形成；3×104mL-1細(xì)胞濃度約有53個(gè)類胚體形成，顯著高于其他兩個(gè)試驗(yàn)組；6×104mL-1細(xì)胞濃度下細(xì)胞開始增殖并形成細(xì)胞集落，僅有約3個(gè)類胚體形成。懸滴培養(yǎng)48 h后，各組類胚體體積增大，且數(shù)量有不同程度的增加，對(duì)1×104、3×104和6×104mL-13個(gè)細(xì)胞濃度形成的類胚體統(tǒng)計(jì)數(shù)分別為57、267和37。3×104mL-1細(xì)胞濃度懸滴培養(yǎng)48 h后，類胚體數(shù)量極顯著高于其他兩個(gè)試驗(yàn)組(表2)。

A.ESCs的AKP染色結(jié)果；B.ESCs的SSEA-1染色結(jié)果(暗場(chǎng))；C.ESCs的SSEA-1染色結(jié)果(明場(chǎng))?！?ESCs克隆A.Stained ESCs by AKP；B.Stained ESCs by SSEA-1(dark field)；C.Stained ESCs by SSEA-1(light field).→.ESCs clone圖1 第3代雞ESCs的特異性鑒定400×Fig.1 Identification of the 3rd generation chicken ESCs 400×

A.1×104 mL-1細(xì)胞濃度懸滴培養(yǎng)24 h出現(xiàn)少量圓球狀類胚體，48 h類胚體數(shù)量增多，體積增大，隱約可見中心有囊腔形成；B.3×104 mL-1細(xì)胞濃度懸滴培養(yǎng)24 h出現(xiàn)較多圓球狀類胚體，48 h類胚體體積增大，且數(shù)量大量增加；C.6×104 mL-1細(xì)胞濃度懸滴培養(yǎng)24 h細(xì)胞開始增殖，并出現(xiàn)少量集落，48 h出現(xiàn)少量圓球狀類胚體。→.類胚體A.1×104 mL-1 cell concentration group started to form EB after 24 h，the volumn and number of EB both increased with 48 h； B.3×104 mL-1 cell concentration group formed more EB than the other groups within 24 h，and the EB’s number kept increasing within 48 h；C.6×104 mL-1 cell concentration goup only had a little EB after 24 h，and no sign for significant increase of EB within 48 h.→.EB圖2 不同細(xì)胞濃度不同時(shí)間點(diǎn)ESCs細(xì)胞形態(tài)變化400×Fig.2 The cell morphologic change at different time spots under different cell concentrations 400×

表2 不同細(xì)胞濃度不同時(shí)間點(diǎn)EBs形成數(shù)量

Table 2 The number of EB at different time spot under different cell concentrations

細(xì)胞濃度/(×104mL-1)Cellconcentration0h24h48h1022±357±23053±3?267±10??603±137±3

*.P<0.05；**.P<0.01

2.3 懸滴培養(yǎng)過程中相關(guān)全能性基因的qRT-PCR檢測(cè)

以β-actin為內(nèi)參基因，將0 h的ESCs細(xì)胞表達(dá)量設(shè)為空白對(duì)照，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)對(duì)干細(xì)胞相關(guān)基因Nanog、Sox2、C-kit和Oct4的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，采用2-ΔΔCt法分析相對(duì)定量結(jié)果，SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示，1×104、3×104和6×104mL-13個(gè)細(xì)胞濃度48 h懸滴培養(yǎng)期間，干細(xì)胞相關(guān)基因Nanog、Sox2、C-kit和Oct4持續(xù)表達(dá)(圖3)。各組基因相對(duì)表達(dá)量如表3所示，1×104mL-1細(xì)胞濃度48 h懸滴培養(yǎng)后，Nanog、Sox2、C-kit和Oct4相對(duì)表達(dá)量分別為1.68、1.13、1.48和1.01；3×104mL-1細(xì)胞濃度48 h懸滴培養(yǎng)后，Nanog、Sox2、C-kit和Oct4相對(duì)表達(dá)量分別為1.76、1.10、1.52和1.05；6×104mL-1細(xì)胞濃度48 h懸滴培養(yǎng)后，Nanog、Sox2、C-kit和Oct4相對(duì)表達(dá)量分別為1.80、1.15、1.32和1.02，各組基因表達(dá)量無顯著性差異。

A.1×104 mL-1細(xì)胞濃度；B.3×104 mL-1細(xì)胞濃度；C.6×104 mL-1細(xì)胞濃度。圖4同A.1×104 mL-1 cell concentration；B.3×104 mL-1 cell concentration；C.6×104 mL-1 cell concentration.The same as Fig.4圖3 懸滴培養(yǎng)48 h ESCs的干性基因Nanog、Sox2、C-kit和Oct4的表達(dá)變化Fig.3 Relative expression levels of Nanog,Sox2,Oct4 and C-kit after 48 h hanging-drop culture

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)特異性標(biāo)記物的表達(dá)

對(duì)各細(xì)胞濃度懸滴培養(yǎng)48 h后的類胚體進(jìn)行表面抗原SSEA-1和Nanog檢測(cè)。結(jié)果顯示，懸滴培養(yǎng)所形成的類胚體SSEA-1和Nanog檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)，熒光下分別呈黃綠色和紅色；DAPI染色為藍(lán)色(圖4)。表明懸滴培養(yǎng)48 h所獲取的類胚體中的細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。

2.5 類胚體自發(fā)分化驗(yàn)證

獲取3×104mL-1細(xì)胞濃度懸滴培養(yǎng)獲得的類胚體，使用10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中隔天換液，定期觀察類胚體的自發(fā)分化情況。并對(duì)自發(fā)分化獲得的細(xì)胞進(jìn)行SOX17 (內(nèi)胚層)、SMA(Smooth Mmuscle Actin)(中胚層)和TUJ-1(βIII-tubulin)(外胚層) 免疫熒光鑒定(圖5)。間接免疫組化染色結(jié)果表明，類胚體自分化后內(nèi)胚層標(biāo)記蛋白SOX17，中胚層標(biāo)記蛋白SMA和外胚層標(biāo)記蛋白TUJ-1表達(dá)呈陽(yáng)性。結(jié)果表明，所獲得的類胚體具有分化為3個(gè)胚層的能力。

2.6 類胚體細(xì)胞核型分析

通過3×104mL-1細(xì)胞濃度懸滴培養(yǎng)獲得類胚體，對(duì)其染色體進(jìn)行核型分析。選擇良好分裂相，在顯微鏡下計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。結(jié)果表明，懸滴培養(yǎng)形成的類胚體具有并保持正常的核型，為38條常染色體和2條性染色體(圖6)。

3 討 論

類胚體是由胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)獲得的，具有向多個(gè)方向分化的潛能。類胚體是ESCs細(xì)胞發(fā)育的啟動(dòng)，在特定的細(xì)胞因子和微環(huán)境中可對(duì)其進(jìn)行定向誘導(dǎo)，從而產(chǎn)生特定細(xì)胞。EB最早由A.Takeda[16]觀察并描述，被認(rèn)為是一種卵巢腫瘤內(nèi)發(fā)生的現(xiàn)象；此后G.B.Pierce等[17]研究發(fā)現(xiàn)，EB可以用來形成畸胎瘤或畸胎癌；G.R.Martin等[18]克隆畸胎癌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)形成了具有分化功能的EB；M.J.Evans和M.H.Kaufman[19]體外培養(yǎng)老鼠的胚胎干細(xì)胞形成EB。近年來，類胚體被廣泛應(yīng)用于體外定向誘導(dǎo)過程，陳明等[6]通過類胚體的體外形成，誘導(dǎo)生成小鼠心肌細(xì)胞。陳惠芹等[8]通過添加誘導(dǎo)劑，促進(jìn)擬胚體中原始造血干細(xì)胞發(fā)生。而現(xiàn)有研究中，針對(duì)家禽類胚體形成的研究較少，尚未見有詳細(xì)的報(bào)道。

本課題組一直致力于家雞雄性生殖細(xì)胞的分化研究，目前已初步建立雞ESCs向雄性生殖細(xì)胞分化的體外誘導(dǎo)體系，但是誘導(dǎo)效率較低，產(chǎn)生的雄性生殖樣細(xì)胞數(shù)量較少。因此，本研究在懸滴培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，摸索雞ESCs形成類胚體的最佳體系，以期提高體外誘導(dǎo)雞ESCs生成雄性生殖細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。采用1×104、3×104和6×104mL-13個(gè)細(xì)胞濃度，使用懸滴培養(yǎng)后觀察類胚體的形成效率。研究發(fā)現(xiàn)，在3×104mL-1的細(xì)胞濃度下，通過不含干細(xì)胞維持因子的培養(yǎng)液懸滴培養(yǎng)48 h，類胚體數(shù)量呈對(duì)數(shù)上升，表明3×104mL-1為雞ESCs體外懸滴培養(yǎng)形成類胚體的最適濃度，這與張良等[3]結(jié)論相符。

間接免疫熒光法檢測(cè)各試驗(yàn)組懸滴培養(yǎng)48 h后，類胚體中干性標(biāo)記蛋白的表達(dá)情況：綠色熒光為SSEA-1蛋白，紅色熒光為Nanog蛋白，藍(lán)色為DAPI染色，Merge代表合并圖。→.EBAfter 48 h hanging-drop culture,immunocytochemistry showed EB was positive for SSEA-1(green)，Nanog(red) and DAPI (blue) in all 3 groups，Merge were showed respectively.→.EB圖4 類胚體中的蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) 400×Fig.4 Expression of proteins in EB detected by immunocytochemistry 400×

類胚體自分化后檢測(cè)三胚層標(biāo)記基因：SOX17 (內(nèi)胚層)、SMA (中胚層)和TUJ-1 (外胚層)的表達(dá)，藍(lán)色為DAPI染色，Merge代表合并圖After EB differetiated in vitro，the marker genes of 3 layer were detected by immunocytochemistry：SOX17 (endoderm)，SMA (mesoderm) and TUJ-1 ( ectoderm).DAPI (blue)，Merge were showed respectively圖5 類胚體體外自分化免疫熒光檢測(cè)200×Fig.5 Differentiation of EB in vitro detected by immunocytochemistry 200×

圖6 類胚體的染色體核型分析1 000×Fig.6 Karyotype analysis of EB 1 000×

為了克服普通懸滴培養(yǎng)法產(chǎn)生EB數(shù)量少，EB大小和分化階段不一致的問題，本研究對(duì)懸滴培養(yǎng)法進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的摸索和改進(jìn)，采用第3代雞ESCs形成的克隆進(jìn)行類胚體培養(yǎng)，能獲得相對(duì)較多的EB，且大小基本一致，可重復(fù)性高。對(duì)形成的類胚體進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其持續(xù)表達(dá)干性基因Nanog、Sox2、Oct4和C-kit，且免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Nanog和SSEA-1呈陽(yáng)性。另外，對(duì)懸滴培養(yǎng)形成的類胚體進(jìn)行核型分析，發(fā)現(xiàn)類胚體在形成過程中具有正常的核型。試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究采用懸滴培養(yǎng)法形成類胚體具有分化潛能，能夠用于體外定向誘導(dǎo)過程。

4 結(jié) 論

本研究采用懸滴培養(yǎng)法，成功建立雞胚胎干細(xì)胞類胚體體外快速形成技術(shù)，確定3×104mL-1為雞ESCs體外懸滴培養(yǎng)形成類胚體的最適濃度。所獲得的EB數(shù)量相對(duì)較多，大小均一，持續(xù)表達(dá)全能性標(biāo)記基因并具有分化為3個(gè)胚層的能力，且染色體核型正常。該研究為進(jìn)一步優(yōu)化雞ESCs向生殖細(xì)胞定向分化體系奠定了理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(編輯 程金華)

Embryoid Body Formation from Chicken Embryonic Stem Cells through Suspension Culture

ZHANG Lei1，2，WANG Xiao-yan1，ZUO Qi-sheng1，LU Zhen-yu1，WANG Fei1，JI Yan-qin1， WANG Ying-jie1，ZHANG Ya-ni1*，LI Bi-chun1*

(1.KeyLaboratoryofAnimalBreedingReproductionandMolecularDesignforJiangsuProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China； 2.JiangsuAgri-animalHusbandryVocationalCollege,Taizhou225300,China)

This experiment was conducted to explore the best suspension culture system for embryoid body (EB) formation from chicken embryonic stem cells (ESCs)，and to improve the induction efficiency of chicken ESCsinvitro.Pure clones from the third generation of chicken ESCs was collected，re-suspensed the cells into 3 cell concentrations：1×104，3×104and 6×104mL-1to make suspension culture.Morphology changes of EB were observed，qRT-PCR and immunofluorescence methods were used to detect the marker genes’s expression，self-differentiation and karyotype analysis were made to make full test of EB.The results showed that,the amount of EB with 3×104mL-1cell concentration was higher than the other groups，and the number of EB reached 267 in one single view with the same spherical shape.The stem cell marker genesNanog,Sox2,Oct4 andC-kitremained expression with 48 h of EB formation，and stem cell surface specific antigen (NanogandSSEA-1) detection was positive.After self-differentiation of EB，3 embryonic germ layers specific antigen (SOX17,SMAandTUJ-1) detection all showed positive.Karyotype analysis showed that the formatted EB maintained normal karyotype.The results indicated that the suitable concentration for chicken ESCs form the EB through suspension culture was 3×104mL-1，and the formatted EB had viability to provide experimental foundation for chicken ESCs induction invitro.

embryoid body；suspension culture；chicken；embryonic stem cells

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.008

2014-12-11

國(guó)家自然科學(xué)基金(31272429；31472087)；江蘇省研究生科研創(chuàng)新基金(CXZZ13_0909)

張 蕾(1987-)，女，江蘇常州人，博士，主要從事胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)研究，E-mail：leizhang17@sina.com

*通信作者：張亞妮，講師，博士，主要從事動(dòng)物遺傳工程研究；李碧春，教授，博士，主要從事動(dòng)物胚胎工程與遺傳工程研究，E-mail：yubcli@yzu.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)08-1333-08