腺相關(guān)病毒衣殼保守區(qū)多價(jià)抗原肽的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

腺相關(guān)病毒（AAV）是一種單正鏈DNA病毒，屬于細(xì)小病毒科依賴病毒屬，目前普遍認(rèn)為AAV感染不會(huì)引起人類疾病的發(fā)生。AAV載體優(yōu)異的安全性，以及對(duì)靶器官組織的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)性，使其成為體內(nèi)基因治療的首選載體系統(tǒng)。AAV病毒粒子直徑約25 nm，其中包裹著4.7 kb的單鏈DNA基因組，基因組由Rep基因和Cap基因組成，兩側(cè)是反向末端重復(fù)序列（ITR），左側(cè)的ORF編碼四種復(fù)制蛋白，根據(jù)它們的分子量命名為：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，右側(cè)的ORF通過不同起始密碼子編碼3個(gè)衣殼蛋白VP1、VP2和VP3，這3種衣殼蛋白共用1個(gè)羧基末端，但具有不同的氨基末端，AAV組裝過程中，VP1、VP2和VP3以1∶1∶10的比例形成二十面體病毒衣殼。

目前市面上還未有能識(shí)別所有常見血清型的AAV抗體。進(jìn)行AAV相關(guān)研究時(shí)往往需要準(zhǔn)備多種針對(duì)不同血清型的抗體，既增加了研究成本又不利于研究結(jié)果之間的比較。本研究根據(jù)AAV1-AAV10衣殼蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)序列分析，共發(fā)現(xiàn)10處AAV衣殼保守區(qū)（Aa42-50，Aa93-101，Aa107-124，Aa 271-303，Aa 334-350，Aa 395-410，Aa 615-623，Aa 649-655，Aa669-698，Aa727-733），將所有衣殼保守區(qū)DNA序列進(jìn)行人工拼接后合成，經(jīng)原核蛋白表達(dá)純化，制備多克隆抗體，采用多種方式驗(yàn)證人工制備的抗原的抗原性，為后續(xù)研究AAV的生物學(xué)功能以及載體優(yōu)化改造奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

pET-30a表達(dá)質(zhì)粒及大腸桿菌菌株BL21（DE3）由作者實(shí)驗(yàn)室保存，日本大耳朵白兔雄性（湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心），羊抗兔IgG-His抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、Ni-NTA樹脂（Novagen）、弗氏不完全佐劑（Sigma-aldrich），其它相關(guān)生物化學(xué)試劑均由全式金公司提供，本實(shí)驗(yàn)通過三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理審查（2022010C1）。

1.2 方法

1.2.1 AAV衣殼保守區(qū)蛋白序列獲得 NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得AAV1-10血清型序列并進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示AAV1-AAV10衣殼蛋白氨基酸序列中有10處保守區(qū)，（Aa42-50，Aa93-101，Aa107-124，Aa271-303，Aa334-350，Aa395-410，Aa615-623，Aa649-655，Aa669-698，Aa727-733），10處保守區(qū)序列進(jìn)行拼接，獲得的序列即為AAV1-AAV10衣殼蛋白保守區(qū)序列，該序列由金唯智生物公司合成并構(gòu)建到pET-30a原核表達(dá)載體，其中5′末端酶切位點(diǎn)為XhoI，3′末端酶切位點(diǎn)為NdeI。

1.2.2 AAV保守區(qū)蛋白原核表達(dá) 將pET-30a-AAV-CR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21（DE3），挑取陽性克隆接種于含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h，菌液達(dá)到0.8～1.0時(shí)，加入IPTG（終濃度為1 mmol/L）繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。在不同的誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)取樣，12%的SDS-PAGE分析AAV保守區(qū)蛋白的表達(dá)，確定誘導(dǎo)AAV保守區(qū)蛋白表達(dá)的最優(yōu)條件。

SDS-PAGE分析pET30a-AAV-CR質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)情況，在相對(duì)分子質(zhì)量17 000附近有一明顯條帶（圖2），符合預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量的大小。經(jīng)Ni-NTA高效純化后，AAV保守區(qū)蛋白條帶單一，無其他雜帶，表明成功純化（圖3），此外采用His標(biāo)簽抗體可識(shí)別AAV衣殼蛋白保守區(qū)N端所帶的His標(biāo)簽，說明本實(shí)驗(yàn)中純化的蛋白為AAV保守區(qū)蛋白（圖4）。

在4T-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染AAV2、AAV6、AAV9衣殼蛋白質(zhì)粒，免疫熒光法檢測4T-1細(xì)胞內(nèi)AAV衣殼同源區(qū)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示制備的抗體能有效用于各型血清型AAV的細(xì)胞免疫熒光分析（圖7）。

5.2.2 Sustainable Living through the exchange of products between rural and pastoral communities

1.2.5 制備的抗血清抗體效價(jià)檢測 采用間接ELISA法檢測血清中多克隆抗體效價(jià)。將10 μg的AAV衣殼保守區(qū)蛋白加入96孔板，4 ℃包被過夜，3%的BSA 37 ℃封閉2 h后，加入系列稀釋血清（以等體積PBS作為空白對(duì)照），37 ℃孵育1 h，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶3000稀釋），37 ℃孵育1～2 h；TMB 法顯色，加入終止液后，檢測值。以空白對(duì)照所測得值進(jìn)行調(diào)零，實(shí)驗(yàn)孔值與陰性對(duì)照孔值的比值≥2.1即為陽性，以能獲得陽性的最大稀釋比例作為待檢血清的抗體效價(jià)。

既然旅游者具有其自身的特殊性，并且外出旅游就是為了放松，享受閑暇時(shí)間的自由，那么就應(yīng)該在充分理解游客的基礎(chǔ)上，做出有針對(duì)性的安排，來減少其不文明行為發(fā)生的機(jī)會(huì)。既然游客喜歡刻字或者涂鴉，那么就可以給游客提供涂鴉的專門空間和位置，在景區(qū)的適當(dāng)位置建立游客涂鴉區(qū)或者留言區(qū)，這樣的管理措施就是有意識(shí)的“順”的行為，然后，在通過其他的規(guī)則、標(biāo)識(shí)等方式進(jìn)行“導(dǎo)”，可以大幅度降低游客發(fā)生不文明行為的可能性。

1.2.6 Western bolt法鑒定制備的AAV保守區(qū)蛋白抗體AAV2、AAV6、AAV9病毒樣品經(jīng)10%的SDS-PAGE分離后以300 mA 的恒流電轉(zhuǎn)膜，封閉采用1%BSA 的TBST孵育1 h。用制備的抗體為一抗（1∶1000稀釋使用）4 ℃孵育過夜，以HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 為二抗（1∶1000），室溫孵育1～2 h，TBST漂洗2～3次，ECL法顯色。

AAV保守區(qū)蛋白質(zhì)粒pET30a-AAV-CR經(jīng)I+I 雙酶切后，采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離顯示，可見5000與1500兩個(gè)DNA片段（圖1）。酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒經(jīng)DNA 測序，證實(shí)質(zhì)粒中插入序列正確，閱讀框架對(duì)接無誤。

根據(jù)運(yùn)動(dòng)員的基礎(chǔ)能力，進(jìn)行綜合職業(yè)能力測評(píng)，培訓(xùn)過程中優(yōu)化考核標(biāo)準(zhǔn)，全面發(fā)掘?qū)W員的潛能，增加培訓(xùn)項(xiàng)目和形式的多樣性；加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)員就業(yè)的心理建設(shè)和職業(yè)規(guī)劃的方向性；通過多渠道優(yōu)化培訓(xùn)資源，拓寬網(wǎng)絡(luò)培訓(xùn)平臺(tái)，增加相關(guān)知識(shí)的資源應(yīng)用，活學(xué)活用所學(xué)知識(shí)和技能。使退役運(yùn)動(dòng)員所學(xué)習(xí)的知識(shí)更加系統(tǒng)化、正規(guī)化，以達(dá)到理想的就業(yè)培養(yǎng)目標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒鑒定

1.2.7 細(xì)胞免疫熒光法鑒定AAV保守區(qū)蛋白抗體 將表達(dá)AAV2、AAV6、AAV9 衣殼蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4T-1 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，接種于24孔板繼續(xù)培養(yǎng)，貼壁后PBS洗滌2～3次，4%多聚甲醛室溫固定15～20 min，0.5%的TritonX-100室溫孵育15 min，PBS洗滌2～3次，5%山羊血清37 ℃孵育30 min，每孔加入待檢抗血清（1∶300稀釋），37 ℃孵育1 h，PBS 洗滌1～2次后，滴加熒光二抗（1∶200 稀釋），室溫避光孵育1 h，PBS洗滌去除未結(jié)合的二抗，滴加DAPI（1∶50）避光孵育15～20 min，熒光顯微鏡成像。

2.2 AAV保守區(qū)蛋白的原核表達(dá)和純化

1.2.3 AAV保守區(qū)蛋白的純化及復(fù)性 依據(jù)曹春雨等所報(bào)道的研究及上述誘導(dǎo)的最佳條件進(jìn)行AAV保守區(qū)蛋白大量誘導(dǎo)，收集菌體后經(jīng)高濃度尿素（8 mol/L 尿素，0.1 mol/L NaHPO，0.02 mo/L Tris-HCl，pH=8.0）裂解細(xì)菌，6000 r/min、4 ℃、30 min離心去除不溶性碎片。將上清液與Ni-NTA樹脂于4 ℃親和雜交孵育2.5 h后上柱，先用洗脫液A（8 mol/L 尿素，10 mmol/L Tris，100 mmol/L NaHPO，pH=6.3）洗脫雜蛋白，0.5 h后用洗脫液B（10 mmol/L Tris，8 mol/L 尿素，110 mmol/L NaHPO，pH=4.3）洗脫目的蛋白。目的蛋白經(jīng)透析液分步透析去除尿素而復(fù)性。透析緩沖溶液為（50 mmol/L Tris，250 mmol/L NaCl、0.01 mmol/L EDTA、1 mol/L DTT，pH=7.5），尿素濃度按照5、2.5、1、0 mol/L梯度遞減，每梯度透析12 h，純化后的蛋白于-80 ℃保存。

阿里研究院與德勤研究聯(lián)合發(fā)布報(bào)告《平臺(tái)經(jīng)濟(jì)協(xié)同治理三大議題》，報(bào)告提出了平臺(tái)經(jīng)濟(jì)協(xié)同治理三大挑戰(zhàn)：權(quán)益保護(hù)、合理稅收和公平競爭，德勤預(yù)計(jì)中國平臺(tái)經(jīng)濟(jì)規(guī)模將會(huì)在2030年突破100萬億。報(bào)告提到，2016年中國電子商務(wù)交易額超過20萬億元，網(wǎng)民7.1億，互聯(lián)網(wǎng)普及率達(dá)到51.7%，平臺(tái)經(jīng)濟(jì)已經(jīng)占據(jù)了GDP的10.5%，如今平臺(tái)經(jīng)濟(jì)正為中國經(jīng)濟(jì)營造出熱氣騰騰的發(fā)展場景。截止至2017年7月，全球十大平臺(tái)經(jīng)濟(jì)體市值已經(jīng)超過十大傳統(tǒng)跨國公司，其中中國公司占三席[5]。

2.3 抗AAV保守區(qū)蛋白多克隆抗體鑒定

間接ELISA 法檢測制備抗血清的效價(jià)1∶320 000（圖5）。

Western bloting 檢測AAV 抗體對(duì)不同血清型的AAV病毒（AAV2、AAV6、AAV9）的識(shí)別效果，結(jié)果顯示制備的AAV抗體能特異性識(shí)別和結(jié)合不同血清型的AAV 病毒，可用于該種血清型AAV 病毒相關(guān)的Western blot 檢測（圖6）。

2.4 制備抗體用于細(xì)胞免疫熒光分析

1.2.4 抗AAV保守區(qū)蛋白多克隆抗血清的制備 純化后的AAV保守區(qū)蛋白用作抗原免疫日本大耳朵白兔，依據(jù)呂亞豐等的研究報(bào)道中，本研究首次免疫采取600 μg抗原與等體積弗氏完全佐劑乳化，皮下免疫白兔，設(shè)置未免疫抗原的日本大耳朵白兔為陰性對(duì)照。間隔2周進(jìn)行2次加強(qiáng)免疫，末次免疫一周后耳中動(dòng)脈取血，全血4 ℃靜置過夜，12 000 r/min離心收集血清，加入1/10體積甘油、1%疊氮鈉后保存于-20 ℃。

3 討論

AAV載體具有免疫原性低、很少或幾乎不整合宿主基因組、可實(shí)現(xiàn)組織異性等特點(diǎn)，目前在遺傳性疾病、腫瘤等與基因突變相關(guān)的疾病中已逐漸成為遞送基因的主要載體。如今，已有3種基于AAV載體的基因治療藥物上市，分別是Glybera、Luxturna和Zolgensma。Glybera 采用AAV1攜帶脂蛋白脂酶基因，用于治療遺傳性脂蛋白酯酶缺乏的患者，于2012年10月獲得歐洲藥品管理局批準(zhǔn)上市；Luxturna采用AAV2將正常的RPE65基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，用于治療由RPE65基因突變導(dǎo)致的遺傳性視網(wǎng)膜疾病，于2017年12月獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)；Zolgensma采用AAV9攜帶治療基因SMN1，用于治療2歲以下的脊髓性肌肉萎縮癥患者，于2019年5月經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市。AAV載體的開發(fā)以及優(yōu)化離不開AAV 抗體的使用，本研究旨在建立一種原核表達(dá)AAV衣殼蛋白保守區(qū)抗原肽的方法以及制備一種可廣泛識(shí)別所有血清型AAV病毒的多克隆抗體。

北京市的城市中水回用取得了豐厚的成果，國內(nèi)其他省市也開展了中水回用系統(tǒng)的建設(shè)，其中天津、青島、大連等沿海城市，陸續(xù)打造了符合城市發(fā)展特點(diǎn)和城市地理環(huán)境的中水回用建設(shè)方案。以青島市為例，青島市于2001年開始便依托海泊河污水廠開展了中水回用試點(diǎn)工程，市內(nèi)中水資源供應(yīng)量達(dá)原供應(yīng)量四倍，（何為原供應(yīng)量的4倍?）并廣泛應(yīng)用于景觀、綠化、洗車、沖廁等領(lǐng)域。

目前針對(duì)AAV衣殼蛋白的商業(yè)化抗體較少，并且已有抗體只能識(shí)別部分血清型AAV，還沒有能夠同時(shí)結(jié)合AAV1-AAV10所有血清型的抗體，進(jìn)行AAV相關(guān)基礎(chǔ)及應(yīng)用研究時(shí)往往需要準(zhǔn)備多種針對(duì)不同血清型的抗體，不僅增加了研究成本同時(shí)又也不利于不同研究結(jié)果之間的比較。基于此，本研究我們根據(jù)AAV1-AAV10衣殼蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)序列分析，共發(fā)現(xiàn)10處AAV衣殼保守區(qū)（Aa42-50，Aa93-101，Aa107-124，Aa 271-303，Aa 334-350，Aa 395-410，Aa 615-623，Aa 649-655，Aa669-698，Aa727-733），為了制備可廣泛識(shí)別不同血清型AAV的多克隆抗體，我們將所有AAV保守區(qū)氨基酸進(jìn)行人工拼接并合成其DNA序列。構(gòu)建pET-30a/AAV-CR原核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）中。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AAV保守區(qū)蛋白可被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，且主要以包涵體的形式存在。由于重組AAV保守區(qū)蛋白帶有His 標(biāo)簽，我們根據(jù)這一特點(diǎn)利用Ni-NTA 樹脂親和層析法在尿素變性的條件下純化得到高純度的AAV衣殼保守區(qū)蛋白。為制備抗AAV衣殼保守區(qū)蛋白多克隆抗體，我們將純化后的AAV保守區(qū)蛋白用做抗原免疫日本大耳朵白兔，經(jīng)過1次啟動(dòng)免疫和2次加強(qiáng)免疫后，得到了高效價(jià)的抗AAV衣殼保守區(qū)蛋白多克隆抗體。該抗體能特異性識(shí)別和結(jié)合人真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)的AAV衣殼蛋白，可有效用于各類血清型AAV衣殼蛋白的免疫印跡、ELISA等化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)。值得注意的是，雖然通過直接將保守區(qū)氨基酸序列拼接的方式獲得了高效價(jià)的多克隆抗體，但是也存在拼接交界處產(chǎn)生新的抗原從而誘導(dǎo)形成無關(guān)抗體的風(fēng)險(xiǎn)，而這一風(fēng)險(xiǎn)也是該策略無法規(guī)避的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明拼接保守區(qū)序列可在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)AAV的抗體形成，表明AAV衣殼保守區(qū)序列存在較強(qiáng)的免疫原性，為了克服上述保守區(qū)拼接交界處誘導(dǎo)抗體形成的問題，下一步我們將分別合成AAV衣殼保守區(qū)序列以制備抗體。

綜上所述，本研究成功建立了AAV衣殼保守區(qū)蛋白的原核表達(dá)純化技術(shù)，成功制備了抗AAV衣殼保守區(qū)蛋白的多克隆抗體，制備的抗體理論上可識(shí)別所有血清型AAV，上述研究有助于后續(xù)AAV載體的改造、AAV篩選、AAV檢測以及AAV生物學(xué)功能等研究。