千金藤素抗新冠病毒研究進展

我們利用前期成功分離培養(yǎng)的動物來源的類新冠病毒建立了細胞培養(yǎng)模型，該病毒與新冠病毒在分類學(xué)上屬于同一物種，均為Beta冠狀病毒，二者全基因組DNA序列同源性達86.0%，刺突糖蛋白（S蛋白）氨基酸序列同源性達92.2%，病毒進入細胞的受體都是ACE2。我們利用該病毒感染模型對包括上市藥物在內(nèi)的約3000種單體化合物進行篩選，我們首次發(fā)現(xiàn)千金藤素可作為治療新冠病毒感染的潛在藥物，提示千金藤素可以同時抑制冠狀病毒的入胞和入胞后過程。相關(guān)成果于2020年2月16日申報了“千金藤素用于制備治療新冠病毒感染性疾病的藥物的用途”中國專利。

選擇2017年12月份之前入職的低年資手術(shù)室護士為研究對象。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）手術(shù)室護士。（2）工作年限＜5年。（3）自愿參加本次調(diào)查。

隨后日本的Ohashi等人在BioRxiv上發(fā)表預(yù)印版研究論文，發(fā)現(xiàn)千金藤素比瑞德西韋具有更好的抗新冠病毒潛力，該研究引用了我們團隊前述的研究結(jié)果并發(fā)表于iScience。此研究使用新冠病毒感染VeroE6/TMPRSS2細胞，通過藥物添加實驗確定千金藤素靶向病毒入胞階段，后續(xù)通過分子對接模擬推測千金藤素通過結(jié)合病毒S蛋白從而干擾其與ACE2的結(jié)合。對千金藤素和奈非那韋進行聯(lián)合用藥后發(fā)現(xiàn)，單獨使用千金藤素或奈非那韋均可降低病毒RNA水平，而二者聯(lián)用可將病毒RNA水平降至更低，說明二者在抑制新冠病毒感染方面具有協(xié)同作用。

2020 年8 月10 日，美國德克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Mark Andrew White等人通過同源建模和分子動力學(xué)方法對970 000種化合物進行虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)千金藤素與SARS-CoV-2 NSP13的ATP結(jié)合位點具有最好的結(jié)合活性，提出千金藤素是SARS-CoV-2 Nsp13的潛在抑制劑。該研究也通過體外酶活性實驗驗證了該結(jié)果，測試了千金藤素對重組SARS-CoV-2 Nsp13蛋白的ATP酶活性的抑制能力，其IC50值為0.4 mmol/L，具有顯著的ATP酶活性抑制能力。Nsp13解旋酶對病毒復(fù)制至關(guān)重要，且在冠狀病毒家族中高度保守，千金藤素對Nsp13解旋酶的顯著抑制作用可能為其抗新冠病毒及廣譜抗冠狀病毒活性的作用機制之一。

1)浮標(biāo)站主導(dǎo)風(fēng)向主要為東北方向和西南方向,主要受江流分布影響,這兩個方向的干擾因素最少;從各個方位風(fēng)速情況看,東北、西南方向的風(fēng)速也高于其它方向。

作為一個上市70余年的老藥，千金藤素主要從防己科千金藤屬植物根莖中提取、分離、純化獲得，具備成熟的生產(chǎn)工藝，價格便宜。其主要原料Stephania rotunda是一種原產(chǎn)于中國，現(xiàn)常見于整個東南亞的爬行植物。除了抗新冠病毒，還有報道表明千金藤素具有抗寄生蟲、抗菌、抗腫瘤、抗炎癥等活性。國內(nèi)目前已存在的千金藤素片的中成藥藥品批文有4個。此外西安海納生物醫(yī)藥有限公司和河南省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所對鹽酸千金藤素和鹽酸千金藤素注射液進行了化藥藥品注冊，并且被同意批準(zhǔn)臨床。

在千金藤素治療新冠肺炎的臨床試驗方面，加拿大制藥公司PharmaDrug于2020年3月3日在美國申請獲得了千金藤素腸溶制劑的專利。該專利中千金藤素被制備成千金藤素腸溶制劑（PD-001）用于口服，與千金藤素相比，PD-001在嚙齒動物和非嚙齒動物模型中更容易吸收，生物利用度顯著提高。2021年6月該公司將千金藤素用于治療輕度至中度COVID-19感染的臨床試驗申請?zhí)峤恢撩绹鳩DA，9月份獲得美國FDA的Pre-IND會議請求，并于11月下旬與美國FDA就千金藤素用于治療輕度至中度新冠病毒感染的臨床試驗達成一致意見，PharmaDrug計劃在2022年下半年啟動相關(guān)臨床研究。這是迄今唯一一個千金藤素擬用于治療新冠肺炎臨床研究的項目。

2021年12月9日，日本的Shirai團隊也報道了千金藤素在VeroE6/TMPRSS2細胞上具有優(yōu)異的新冠病毒抑制能力，EC50為1.90 μmol/L，并根據(jù)計算機模擬推測千金藤素分子中的二苯酯基團為藥效基團，但未能發(fā)現(xiàn)千金藤素重點靶向的病毒蛋白。

2021年11月4日，清華大學(xué)和北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院的研究團隊利用ChIRP-MS技術(shù)鑒定了與新冠病毒、Zika和Ebola等重要人類病毒互作的宿主因子，并在開放藥物庫中篩選了靶向病毒-宿主因子相互作用的藥物。其中，千金藤素能很好的抑制新冠病毒原始株感染過表達ACE2的A549細胞系，IC50為1.67 μmol/L，CC50為30.92 μmol/L。隨后，千金藤素在hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠中的抗新冠病毒作用也被評估。相較于對照組，藥物治療組（感染新冠病毒原始株前1 d進行鼻內(nèi)給藥）的病毒載量在感染后第5天出現(xiàn)顯著降低，并且千金藤素治療組小鼠的TNF和IL-6等炎癥因子水平明顯降低，小鼠肺部的炎癥損傷明顯減輕。此外，千金藤素對Beta突變株感染的A549細胞系也具有很好的抑制作用，IC值為0.24 μmol/L，這一數(shù)值在Beta突變株感染的Huh7.5.1細胞中僅為0.06 μmol/L。聯(lián)合使用千金藤素和三氟拉嗪（各5 μmol/L）可使Huh 7.5.1細胞系中病毒RNA水平降至低于0.01%。這些結(jié)果表明，千金藤素能在較低濃度下發(fā)揮抗新冠病毒作用，具有良好的有效性和安全性。同時，其還能發(fā)揮抗炎作用，減輕病毒感染引起的肺損傷。千金藤素在新冠病毒突變株感染的細胞和新冠病毒感染的hACE2小鼠上均表現(xiàn)出很強的抑制作用，提示千金藤素具有潛在的控制新冠病毒感染的臨床價值。

其實，類似問題完全可以通過堅持市場主導(dǎo)與政府引導(dǎo)相結(jié)合的新機制獲得更好解決，例如《意見》中要求的健全區(qū)際利益補償機制等等。應(yīng)該看到，當(dāng)下新出現(xiàn)的重大形勢變遷是，中國依靠出口與投資雙輪驅(qū)動的發(fā)展模式基本已經(jīng)走到盡頭，中國以及中國各地區(qū)下一步的發(fā)展，必須轉(zhuǎn)向更為注重挖掘國內(nèi)市場一體化帶來的規(guī)模經(jīng)濟效應(yīng)，因此，在這種倒逼形成的巨大壓力下，我國區(qū)域協(xié)調(diào)發(fā)展機制破舊立新已迫在眉睫、勢在必行。

2021年7月20日，芝加哥大學(xué)的Nir Drayman等人在Science發(fā)表的相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，在1900種臨床安全的藥物中，千金藤素對新冠病毒具有最好的體外抑制活性，其在A549-ACE2細胞中的EC50僅為0.1 μmol/L，其次則為地氯雷他定，瑞德西韋和三氟噻噸，EC50分別為0.7、0.72、0.76 μmol/L。另外還有3種EC50小于2 μmol/L的藥物，分別為三甲丙咪嗪（EC50=1.5 μmol/L），拉帕替尼（EC50=1.6 μmol/L），苯托品（EC50=1.8 μmol/L）。該研究首先利用人冠狀病毒OC43模型對1900種臨床安全的藥物進行體外篩選，經(jīng)過兩輪篩選后最終確定了108種藥物能顯著減少A549細胞中OC43的感染，其中僅僅5種藥物對OC43病毒的EC50小于1 μmol/L。隨后進一步驗證了有效抑制OC43的藥物對新冠病毒的抑制活性，有趣的是，抑制OC43感染最有效的藥物（艾爾巴韋和兩性霉素B）并沒有抑制新冠病毒感染，而千金藤素才是體外最有效的新冠病毒抑制藥物。然而千金藤素并不抑制293T細胞中3CL蛋白活性，其對新冠病毒的抑制活性并不通過3CL蛋白實現(xiàn)。此研究證明了千金藤素的體外抗新冠病毒活性在所有被分析的上市單體藥物中最高，遠遠高于已經(jīng)上市的抗新冠病毒藥物瑞德西韋和作者在文章中重點研究的馬賽替尼（Masitinib）（EC50=3.2 μmol/L）。

2021年3月23日，重慶醫(yī)科大學(xué)的黃愛龍團隊利用新冠病毒假病毒模型展開了188種天然化合物的抗病毒篩選工作，其中千金藤素抗新冠病毒療效最佳。該研究表明千金藤素在3種不同細胞系中對新冠病毒的假病毒S-G614 均有顯著的抑制效果，在293TACE2，Calu-3，A549-ACE2細胞上對新冠病毒S-G614假病毒的EC50 分別為0.351、0.759、0.911 μmol/L；在293T-ACE2細胞中對新冠原始毒株S-D614和突變體N501Y.V1（B.1.1.7）、N501Y.V2（B.1.351）假病毒的EC50分別為0.0537、0.047、0.296 μmol/L。同時，千金藤素對引起了重要疫情的冠狀病毒SARS-CoV 和MERS-CoV S 蛋白假病毒的EC50 為0.0417 μmol/L，0.140 μmol/L。以上數(shù)據(jù)表明千金藤素在體外可以有效的抑制新冠病毒突變體及不同冠狀病毒的感染。他們進一步表明千金藤素對新冠病毒S假病毒進入的阻斷作用主要取決于鈣穩(wěn)態(tài)，千金藤素可以通過靶向宿主鈣離子通道來抑制S蛋白/ACE2介導(dǎo)的膜融合。同時，千金藤素上調(diào)了細胞內(nèi)膽固醇水平，這也可能有助于抑制病毒感染。

式中：Tco為切削液更換周期，EEcp為切削液在制備過程的單位能耗，η為切削液濃度，ρ為切削液密度，EWcl為單位廢棄切削液處理能耗，Lin和Lad分別為切削液初始用量和添加用量，為機床Mm加工過程產(chǎn)生的切削液內(nèi)含能。

2021年1月11日，我們通過對千金藤素抑制類新冠病毒感染Vero細胞進行RNA-seq測序分析，顯示千金藤素可能通過逆轉(zhuǎn)病毒干擾的HSF1介導(dǎo)的熱休克反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/未折疊蛋白反應(yīng)和缺氧途徑發(fā)揮抗病毒作用?；贑OVID-19患者的單細胞轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，新冠病毒感染后患者體內(nèi)的熱休克反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白上調(diào)。臨床結(jié)果與千金藤素在細胞水平抑制類新冠病毒的潛在機制吻合，為COVID-19治療靶點提供了重要依據(jù)。

總結(jié)與展望

自從2020年2月千金藤素抗新冠病毒活性被首次發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外多個研究團隊相繼發(fā)現(xiàn)并證實了其優(yōu)異的抗新冠病毒活性。無論是在體外細胞水平還是在hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)水平，千金藤素均能顯著抑制野生型以及Beta等突變株的感染。值得注意的是，加拿大制藥公司PharmaDrug已申請了千金藤素治療輕度至中度新冠病毒感染的臨床試驗，這對千金藤素早日走入新冠病毒病臨床治療具有重要意義。千金藤素作為一種從天然植物中提取的上市“老藥”，我們應(yīng)該加速對千金藤素抗病毒的臨床前及臨床研究，這對于COVID-19疫情的防治具有重要的意義。

此外，多項研究表明千金藤素具有廣譜的抗病毒活性，不僅能顯著抑制新冠病毒的感染，還對SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HIV-1、EboV、Zika、HSV-1、HTLV-1等多種重要人類病原體具有顯著的抑制活性。千金藤素還具有增加白細胞數(shù)量和提高人體免疫力的作用。千金藤素廣泛的藥用價值正在受到普遍關(guān)注，提高了人們對千金藤素相關(guān)研究重視程度，推動了千金藤素相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。隨著千金藤素抗各種重要人類病原體的活性被廣泛認可，人們對千金藤素的需求逐漸增大。而目前千金藤素主要從相關(guān)植物如地不容、金線吊烏龜、云南地不容等多年生草質(zhì)落葉藤木中提取得到，提取工藝復(fù)雜，提取率等問題可能導(dǎo)致相關(guān)植物面臨著被過度挖掘而成為瀕危物種的危險。

因此，我們應(yīng)該深入研究千金藤素的化學(xué)合成和生物合成的生產(chǎn)工藝，提前布局千金藤素相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為千金藤素服務(wù)人類健康事業(yè)作出更大的貢獻。