貝萊斯芽胞桿菌JK19發(fā)酵液穩(wěn)定性及抑菌物質(zhì)初步分析

黃 偉，張麗娟，秦新政，王 寧，王 瑋

（新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091）

貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis在2016年經(jīng)過學(xué)界的反復(fù)論證后，才獲得了公認(rèn)的分類學(xué)地位[1]。它在自然界中分布廣泛，易于實(shí)驗(yàn)室分離和培養(yǎng)，對(duì)環(huán)境友好，其代謝產(chǎn)物豐富，能促進(jìn)植物生長(zhǎng)和拮抗病原菌，因此該菌在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[2,3]。貝萊斯芽胞桿菌的代表菌株FZB42，在美國(guó)已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)農(nóng)作物細(xì)菌和真菌類病害都能起到較好的防治效果[4-6]。在國(guó)內(nèi)貝萊斯芽胞桿菌9912D于 2016年經(jīng)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)成為新型生物殺菌劑，它能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，特別是抗菌脂肽，在高效防治黃瓜灰霉病、番茄灰霉病、棉花枯萎病和蘋果腐爛病等植物病害領(lǐng)域具有重要意義[7]。目前研究芽胞桿菌與青枯病菌互作的生防機(jī)制成為研究熱點(diǎn)之一，而研究較多的是脂肽類化合物產(chǎn)生的拮抗作用，曹禺等[8]研究貝萊斯芽胞桿菌Y6和F7對(duì)番茄青枯病病原菌菌假單胞菌Ralstoniasolanacearum的防治機(jī)理時(shí)，構(gòu)建了脂肽表面活性素（surfactin）、伊枯菌素（iturin）和豐原素（fengycin）合成基因缺失株，結(jié)果表明伊枯菌素或豐原素均對(duì)青枯病菌有顯著的拮抗效果。解淀粉芽胞桿菌JK6和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌Y2可有效防治番茄青枯病菌，其抗菌活性成分是表面活性素[9]。芽胞桿菌在植物病害生物防治中潛力巨大，但是部分芽胞桿菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)易受到溫度、光照和pH的影響，造成穩(wěn)定性下降，不利于田間施用[7]。枯草芽胞桿菌a1產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)在pH＞8.0時(shí)，其活性降低[10]。蘇云金芽胞桿菌Bt185發(fā)酵上清液在50 ℃以上高溫處理后抑菌活性開始下降[11]。因此，對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行研究有助于提高微生物菌劑的防治效果。

本研究前期從耐輻射微生物資源庫(kù)中篩選得到一株對(duì)青枯病菌有較好抑菌效果的貝萊斯芽胞桿菌JK19，但菌株JK19防治青枯病菌的抑菌物質(zhì)及其穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步研究，通過對(duì)菌株JK19發(fā)酵上清液穩(wěn)定性及其拮抗活性物質(zhì)進(jìn)行探究，為新型生物農(nóng)藥的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株：貝萊斯芽胞桿菌JK 19由本課題組分離保存。

試驗(yàn)試劑：硫酸銨，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，鹽酸，甲醇，乙酸乙酯均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物有限公司；0.22 μm微孔濾膜；蛋白酶K，胰蛋白酶，胃蛋白酶，脂肪酶均購(gòu)自上海源葉生物有限公司。

試驗(yàn)儀器：FA-2204型電子天平，上海衡平儀器儀表廠；DHP-052型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Rot ina 380r型高速冷凍離心機(jī)，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SX-500型高壓滅菌鍋，日本TOMY公司；SW-CJ-2FD型無菌超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；79-3型磁力攪拌器，鄭州寶晶電子科技有限公司；TQ8040NX三重四極桿型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；autoflex speed型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS），德國(guó)布魯克（北京）科技有限公司。

NB培養(yǎng)基：牛肉浸膏10 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，利用蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.0；NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏10 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，瓊脂 17 g，利用蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.0；BPY培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，葡萄糖5 g，利用蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.0。TTC（Triphey tetrazolium chloride）固體培養(yǎng)基[12]：水解乳蛋白1 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，瓊脂17 g，pH 6.5～7.0，利用蒸餾水定容至1 L；使用前冷卻至55 ℃，加入過濾除菌的1%的2,3,5-氯化三苯四氮唑，終濃度為0.005%）；CPG液體培養(yǎng)基：水解乳蛋白1 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，pH 6.5～7.0，定容至1 L。

1.2 菌株JK19發(fā)酵上清液無菌濾液的制備

挑取在NA培養(yǎng)基中活化的菌株JK19，接種至盛有50 mL NB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24 h得到種子液，將種子液以1%（v/v）的接種量接種于含有100 mL BPY培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，同樣條件下培養(yǎng)96 h得到發(fā)酵液。將上述發(fā)酵液于4 ℃、4500 r/min離心20 min除去菌體，得到上清液，再用0.22 μm微孔濾膜過濾，得到無菌濾液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株JK19抑菌活性穩(wěn)定性的測(cè)定

以番茄青枯病菌為指示菌，分別測(cè)定JK19發(fā)酵上清液在不同環(huán)境下（pH、溫度、酶和紫外線）的抑菌活性穩(wěn)定性。抑菌活性的檢測(cè)采用平板對(duì)峙法，將NA平板上活化好的番茄青枯病病原菌，挑取單菌落接種CPG液體培養(yǎng)基，30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，作為指示菌種子液。將指示菌種子液與冷卻至60 ℃的TTC固體培養(yǎng)基按1∶10比例混勻后倒板[13]。用打孔器（6 mm）在含指示菌的平板打3個(gè)孔，將待測(cè)液體加入孔內(nèi)，每孔50 μL，30 ℃靜置培養(yǎng)72 h，測(cè)量抑菌圈直徑（扣除打孔器直徑），每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.1 不同pH處理下菌株JK19發(fā)酵上清液的抑菌效果穩(wěn)定性 將發(fā)酵上清液分別用 1 mol/L鹽酸和1 mol/L氫氧化鈉調(diào)成不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9、10和11），每個(gè)樣品體積為50 mL，每個(gè)處理重復(fù)3次。4 ℃放置過夜后再調(diào)回中性（pH＝7.0），作為待測(cè)液備用。以加入無菌水，不經(jīng)酸、堿處理的原樣品為對(duì)照。

1.3.2 不同溫度處理下菌株JK19發(fā)酵上清液的抑菌效果穩(wěn)定性 取上清液分別于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴條件及高溫高壓（121 ℃、100 KPa）條件處理30 min，置于冰塊上快速冷卻，每個(gè)樣品體積為5 mL，每個(gè)處理重復(fù)3次。處理結(jié)束后添加無菌水調(diào)制原始體積，作為待測(cè)液備用。以4 ℃保存的上清液為對(duì)照。

1.3.3 不同酶處理下菌株JK19發(fā)酵上清液的抑菌效果穩(wěn)定性 分別取上清液加入到4個(gè)試管（規(guī)格15 mL）中，使胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶質(zhì)量濃度為500 μg/mL。37 ℃孵育2 h，作為待測(cè)液備用。以相同濃度的未經(jīng)蛋白酶處理的上清液作對(duì)照[14]。

1.3.4 不同紫外線照射時(shí)長(zhǎng)下菌株JK19發(fā)酵上清液的抑菌效果穩(wěn)定性 將15 mL上清液倒入到無蓋的培養(yǎng)皿中，用磁力攪拌器緩慢攪拌培養(yǎng)皿中的上清液，并置于30 W紫外燈下，距離30 cm分別照射1、2、3、4 h后，作為待測(cè)液備用。以未經(jīng)紫外處理的上清液為對(duì)照組。

1.4 提取菌株JK19發(fā)酵上清液中的脂肽

按照1.3中的方法獲得JK19的無菌濾液，使用6.0 mmol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，4 ℃靜置過夜，4 ℃、10000 r/min離心30 min后收集沉淀，用等體積100%甲醇萃取2～3次，合并萃取液，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸干得到脂肽類提取物，使用無水甲醇溶解后，配制成濃度為1 mg/mL的甲醇粗提物溶液，并置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌株JK19發(fā)酵上清液中脂肽的鑒定

采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）鑒定甲醇粗提物的成分[15]。確定儀器真空度為10-7mbar或無，開始樣品分析時(shí)先進(jìn)行分子量校正，使用337 nm氮激光源解吸和電離，采用α-氰-4-羥肉桂酸為基質(zhì)，取1 μL樣品與等體積的基質(zhì)混勻，置于儀器離子源進(jìn)行測(cè)定，質(zhì)量掃描范圍為500～2000 Da。

1.6 提取菌株JK19發(fā)酵上清液中的易揮發(fā)性物質(zhì)

樣品前處理：取1 mL發(fā)酵液樣品，加入10 mL乙酸乙酯振蕩混勻，10000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用于質(zhì)譜分析。

GC-MS/MS分析：GC條件為SHIMADZU SH-Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；分流進(jìn)樣，分流比10∶1；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，初始溫度為30 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。MS條件：EI電離源；載氣為He；吹掃流量3 mL/min；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃。全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍為50～600 amu；溶劑延遲2 min。分析所用的數(shù)據(jù)庫(kù)為NIST數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株JK19抑菌活性的穩(wěn)定性

隨著pH的升高，JK19對(duì)青枯病菌的抑菌效果呈先升高后降低的趨勢(shì)（圖1A），在pH 7時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大，為（1.59±0.03）cm；pH為2和11時(shí)，抗菌活性顯著降低，但仍然有較好的抑菌效果，分別為（0.86±0.06）和（1.13±0.06）cm，與pH為7時(shí)相比，抑菌圈直徑分別下降了45.9%和28.9%，當(dāng)pH為4.0和10.0時(shí)，與pH為7時(shí)相比，抑菌圈直徑分別下降了18.8%和22.6%，適宜pH為4.0～10.0，說明菌株JK19發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)pH范圍很廣，具有較好的酸堿穩(wěn)定性。隨著溫度的升高，菌株JK19對(duì)青枯病菌的抑菌效果呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)（圖1B），對(duì)溫度略敏感，與30 ℃處理相比，超過80 ℃時(shí)，抑菌圈直徑下降了28%，但121 ℃下依然有抑菌效果，抑菌圈直徑為（0.79±0.01）cm，與30 ℃處理相比，抑菌圈直徑下降了 48.7%，說明JK19發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。發(fā)酵液經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶處理后，抑菌活性較對(duì)照無顯著差異（P＞0.05）（圖1C），表明菌株JK19發(fā)酵液對(duì)4種供試的酶不敏感。經(jīng)紫外照射后，菌株JK19發(fā)酵液的抑菌活性沒有明顯變化，無顯著差異（P＞0.05）（圖 1D），表明菌株 JK19發(fā)酵液在紫外照射下仍具有較強(qiáng)的抑菌作用，具有較好的紫外穩(wěn)定性。

圖1 不同pH（A）、溫度（B）、蛋白酶（C）和紫外照射時(shí)長(zhǎng)（D）對(duì)菌株JK19發(fā)酵上清液的影響Fig.1 The effect of fermentation supernatant of strain JK19 by different pH (A), temperature (B), protease (C)and UV irradiation duration (D)

2.2 菌株JK19發(fā)酵上清液中脂肽粗提液抑菌效果

將獲得的粗提液進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn)，測(cè)得抑菌圈直徑為（1.34±0.16）cm（圖2）。

圖2 菌株JK19發(fā)酵上清液脂肽粗提液平板對(duì)峙試驗(yàn)Fig.2 Plate confrontation test of lipopeptide crude extract from fermentation supernatant of strain JK19

2.3 菌株JK19發(fā)酵上清液中脂肽粗提液的鑒定

將菌株JK19甲醇提取的脂肽粗提液進(jìn)行MALDITOF-MS 測(cè)定，初步分析結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，質(zhì)譜峰峰值 m/z為 1045.836、1059.885、1067.841、1081.894、1089.862、1103.906和 1119.905，呈現(xiàn)出脂肽的分子量規(guī)律，其中1045.836和1059.885，1067.841和1081.894分子量相差14 Da，即一個(gè)亞甲基（-CH2-），根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16,17]，推測(cè)1045.836、1059.885、1067.841和 1081.894為桿菌霉素（Bacillomycin）D的同系物，1045.836和1067.841分別為 C15桿菌霉素 D 的[M+H+]和[M+Na+]，分子量應(yīng)為 1044；1059.885和 1081.894分別為 C16 Bacillomycin D的[M+H+]和[M+Na+]，分子量應(yīng)為1058；1103.906和1119.905分別為[M+Na+]和[M+K+]，繼而推測(cè)[M+H+]是1081，該物質(zhì)分子量為1080，還未查詢到文獻(xiàn)中該分子量的物質(zhì)報(bào)道，因此可能是一種新的脂肽。而1089.862與1103.906相差一個(gè)亞甲基，應(yīng)為[M+Na+]離子峰，繼而推測(cè)[M+H+]是1067，該物質(zhì)分子量為1066，屬于分子量為1080物質(zhì)的同系物，還未查詢到文獻(xiàn)有該分子量物質(zhì)的報(bào)道，因此可能是一種新的脂肽。

圖3 菌株JK19發(fā)酵上清液中脂肽粗提液MALDI-TOF-MS圖譜Fig.3 MALDI-TOF-MS pattern of lipopeptide crude extract from fermentation supernatant of strain JK19

2.4 菌株JK19發(fā)酵上清液中易揮發(fā)性物質(zhì)成分及含量

通過GC/MS-MS檢測(cè)獲得總離子流圖（圖4），通過面積歸一法測(cè)得相對(duì)含量，JK19在最適發(fā)酵培養(yǎng)基中易揮發(fā)性物質(zhì)及含量情況（表1）：2-甲基丁酸（24.05%）；環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）二肽（21%）；3-甲基丁酸（20.29%）；六氫-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮，即環(huán)（苯丙氨酸-脯氨酸）二肽（8.74%）；環(huán)（L-脯-L-纈）二肽（7.97%）；六氫吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮（6.31%）；2,2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（4.63%）；環(huán)（亮氨酸-亮氨酸）二肽（3.99%）；3-甲基-1,4-二氮雜二環(huán)[4.3.0]壬烷-2,5-二酮（3.02%）。

圖4 菌株JK19最適發(fā)酵培養(yǎng)基中易揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖Fig.4 Total ion flow diagram of volatile matter in optimum fermentation medium of strain JK19

表1 菌株JK19最適發(fā)酵培養(yǎng)基中易揮發(fā)性物質(zhì)保留時(shí)間、含量及名稱Table 1 Retention time, content and name of volatile matter in optimal fermentation medium of strain JK19

3 討論

貝萊斯芽胞桿菌因其能夠產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，并且具有廣譜抑菌活性和促生長(zhǎng)作用，被廣泛應(yīng)用于植物病害的生物防治[18]。芽胞桿菌菌液的穩(wěn)定性不僅有利于工業(yè)化的大量生產(chǎn)，也能保證在田間施用時(shí)達(dá)到良好的防治效果[19]。本研究以對(duì)青枯病菌有較好的抑菌效果的貝萊斯芽胞桿菌JK19為研究材料，探究菌株 JK19發(fā)酵上清液穩(wěn)定性及抑菌物質(zhì)，為其作為微生物菌劑防治青枯病提供理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明，貝萊斯芽胞桿菌JK19菌株發(fā)酵上清液在超過溫度80 ℃后，抑菌活性顯著下降，但121 ℃下依然有抑菌效果。馮江鵬等[20]也研究發(fā)現(xiàn)高溫（超過50 ℃）可降低貝萊斯芽胞桿菌JK3對(duì)草莓膠孢炭疽菌的抑菌活性，JK19菌株發(fā)酵上清液不耐強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，適宜pH為4.0～10.0，這與趙雅等[14]研究結(jié)果相似；其耐受蛋白酶，這與孫平平等[21]研究結(jié)果一致，因此推測(cè)其主要抗菌活性成分不是蛋白質(zhì)，結(jié)合項(xiàng)目前期PCR反應(yīng)檢測(cè)JK19基因組中有參與脂肽類抗生素合成相關(guān)的基因ituA、ituD、bamC、fenB、fenD、srfAB，菌株JK19抑制青枯病菌的抑菌物質(zhì)是脂肽類物質(zhì)。

近年來，基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)被用于脂肽鑒定中，它方便快捷，樣品量少，靈敏度和準(zhǔn)確性高，通過離子峰信號(hào)可以快速定性判斷表面活性素、伊枯草菌素和豐源素類化合物[22]。劉佳欣等[16]利用MALDI-TOF-MS技術(shù)測(cè)定從海洋枯草芽胞桿菌中分離純化出對(duì)革蘭氏陰性海洋致病菌有較好抑制作用的物質(zhì)，結(jié)果為C14～C15桿菌霉素D。本研究中對(duì)貝萊斯芽胞桿菌JK19的脂肽粗提物進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè)，結(jié)果表明JK19脂肽粗提物中含桿菌霉素D和一種可能的新的脂肽。桿菌霉素D屬于環(huán)狀伊枯草菌素家族，被認(rèn)為是由貝萊斯芽胞桿菌FZB42體外產(chǎn)生最強(qiáng)大的抗真菌代謝物質(zhì)[23]，它對(duì)病原細(xì)菌也有較好的抑菌效果[24]。然而本研究中還有待進(jìn)一步分離純化脂肽粗提物，以確定主要抑菌活性物質(zhì)是何種脂肽類型，為該脂肽在青枯病防治中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

環(huán)二肽是（2,5-哌嗪二酮）是最小的環(huán)肽，許多天然環(huán)二肽化合物都具有明確的生物活性，例如作為抗生素，苦味劑，植物生長(zhǎng)抑制劑以及激素釋放抑制劑等[25,26]。此外，環(huán)二肽能抑制多種農(nóng)作物病原真菌，如尖孢鐮孢Fusariumoxysporum[27]、毛霉Mucorramannianus[28]、鏈格孢Alternariaalternata[29]等。本研究中貝萊斯芽胞桿菌JK19發(fā)酵液中環(huán)二肽占比達(dá)41.7%，其中環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）二肽占比達(dá)21%，環(huán)（苯丙氨酸-脯氨酸）占比達(dá) 8.74%。何培青等[29]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）二肽對(duì)辣椒疫霉Phytophthora capsici等5種作物病原真菌具有抑菌作用，最小抑制濃度為250～500 μg/mL。伯克霍爾德菌Burkholderia cepaciaCF-66產(chǎn)生的環(huán)（苯丙－脯）二肽對(duì)尖孢鐮孢Fusariumoxysporum、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、盤核菌Sclerotiniasclerotiorum和新月彎孢霉Curvularialunata等農(nóng)作物病原真菌均具有較強(qiáng)的抑制作用[30]。菌株JK19發(fā)酵液的環(huán)二肽含量較高，在番茄青枯病防治中有極大的潛力。

綜上所述，貝萊斯芽胞桿菌JK19具有抑制青枯病菌生長(zhǎng)的能力，可能與其產(chǎn)生脂肽、環(huán)二肽等多種抑菌活性物質(zhì)有關(guān)。本研究?jī)H對(duì)菌株 JK19發(fā)酵上清液體外防治番茄青枯病菌進(jìn)行研究，后續(xù)將進(jìn)一步純化分離其代謝產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)，并在體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，明確其抑菌機(jī)制，以期更好地利用拮抗菌株防控茄科類作物青枯病。