泰安市“香野”草莓采后主要病原菌的分離鑒定及精油抑菌效果評(píng)價(jià)

姜莉莉，孫守民，宗曉娟，孫瑞紅，王曉芳，武 沖*

（1.山東省果樹研究所/山東省現(xiàn)代設(shè)施果樹技術(shù)創(chuàng)新中心，泰安 271000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，泰安 271018）

草莓FragariaananassaDuch.屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，其果實(shí)汁多味美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者喜愛，素有“水果之王”的美譽(yù)[1]。草莓貨架期較短，采后腐爛是影響其品質(zhì)和貯藏性狀的重要因素。目前的草莓保鮮技術(shù)主要包括氣調(diào)、可食涂膜、輻照等[2]。氣調(diào)貯藏可以降低果實(shí)呼吸速率、減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，從而達(dá)到延長(zhǎng)貨架期的目的。然而，不同品種草莓對(duì)CO2的耐受能力不同，氣體濃度比例不合適，反而會(huì)引起品質(zhì)劣化等不良反應(yīng)[3]?？墒惩磕ぜ夹g(shù)是以可食性物質(zhì)為原料，形成半透性薄膜，封閉草莓表面，降低草莓呼吸強(qiáng)度，防止微生物侵入[4]。輻照處理能夠使草莓果實(shí)維持較高的總酚、黃酮及花色苷類物質(zhì)的含量，抑制貯藏期間腐爛指數(shù)的上升，但由于設(shè)備使用成本太高，尚未得到廣泛應(yīng)用[5]。

草莓采后腐敗與病原菌侵染有著密切的聯(lián)系[6]。含糖量較高水果的致腐病菌主要有鐮刀菌Fusarium、葡萄孢菌Botrytis、鏈格孢菌Alternaria、青霉菌Penicillum等[7]?；瘜W(xué)殺菌劑雖可有效抑制果實(shí)采后病害的蔓延，但具有較高的農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)，甚至影響草莓行業(yè)公信力[8]。鄧義才等[9]報(bào)道，以500和1000 mg/L濃度的多菌靈、抑霉唑和咪鮮胺處理采后荔枝2 min，貯藏期間果皮中的殺菌劑會(huì)向果肉滲透轉(zhuǎn)移，且可持續(xù)至采后35 d。劉萍等[10]報(bào)道，經(jīng)450 g/L咪鮮胺乳油1000倍液和250 g/L吡唑醚菌酯乳油1250倍液處理采后沙糖桔，第3、7和14 d果皮中的殘留量均高于最大殘留限量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。隨著人們對(duì)食品安全及環(huán)保問題認(rèn)識(shí)的不斷提高，化學(xué)藥劑防腐保鮮越來越受到抵制[11]。

植物精油是芳香植物的高度濃縮提取物，易溶于有機(jī)溶劑，具有揮發(fā)性，大多具有抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑[12]。作為植物源提取物，植物精油來源廣泛、環(huán)境友好、食用安全，同時(shí)其抑菌譜廣、多靶點(diǎn)作用、不易產(chǎn)生抗藥性，已成為當(dāng)前果品保鮮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[13]。左盼盼等[14]報(bào)道，獼猴桃采后軟腐病主要致病菌為葡萄座腔菌B.dothidea和擬莖點(diǎn)霉菌Phomopsissp.，香芹酚精油對(duì)其有較好的抑制活性，EC50值分別為12.15和8.87 μg/L。王靖博等[15]報(bào)道，香榧假種皮精油可有效抑制油桃灰霉病菌和根霉病菌菌絲生長(zhǎng)，EC50值分別為81.672和209.131 μL/L。本研究從山東省泰安市設(shè)施栽培“香野”草莓自然腐爛的果實(shí)上分離病原菌，采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)手段和分子生物學(xué)手段進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步評(píng)價(jià)肉桂、薄荷、檸檬草、玫瑰草、百里香、丁香和月桂葉7種精油對(duì)3種優(yōu)勢(shì)病原菌的EC50值，并選取離體抑菌活性較高的幾種精油進(jìn)行草莓果實(shí)活體抑菌效果評(píng)價(jià)，以期為草莓采后病害的科學(xué)防控及果實(shí)保鮮技術(shù)優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試精油

肉桂精油、薄荷精油、檸檬草精油、玫瑰草精油、百里香精油、丁香精油和月桂葉精油，純度99%，由江西萬花香料有限公司提供。

1.2 病果采集

2021年4月20日，在山東省泰安市岱岳區(qū)道朗鎮(zhèn)（E 116°58′53"，N 36°9′27"）“德萊美”草莓基地，3個(gè)設(shè)施草莓大棚分別隨機(jī)采集10枚“香野”草莓近成熟健康果實(shí)，帶回實(shí)驗(yàn)室，室溫放置，待自然發(fā)病初期進(jìn)行病原菌分離。

1.3 病原菌分離

采用常規(guī)組織分離法，將病健交界組織在75%乙醇溶液中浸泡30 s，以無菌水沖洗3次后，置于PDA平板中央，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d。每枚病果接種3皿，待各菌落形成后，在邊緣挑取菌絲接種于新的PDA平板上進(jìn)行分離、純化、編號(hào)。根據(jù)菌落形態(tài)，合并相同的病原菌，選取數(shù)量最多的3株病原菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 病原菌形態(tài)鑒定

將純化后的菌株接種在PDA平板上，25 ℃、黑暗培養(yǎng)5 d，以光學(xué)顯微鏡記錄孢子和菌絲形態(tài)。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

挑取菌絲接種于PD液體培養(yǎng)基中，25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5 d后，抽濾，以無菌水沖洗3次，取菌絲，以CTAB法提取基因組DNA，采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序。所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，與同源性較高的已知序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 致病力測(cè)定

根據(jù)柯赫氏法則[17]，將健康、無傷口的草莓果實(shí)表面消毒后，以濃度約為1×106孢子/mL的各病原菌孢子懸浮液浸泡1 min，取出瀝干水分，置于無菌保鮮盒中，室溫存放，每天觀察果實(shí)發(fā)病情況。

1.7 室內(nèi)毒力測(cè)定

選擇直徑9 cm的培養(yǎng)皿，在皿蓋中央貼1片邊長(zhǎng)1 cm的正方形濾紙片，滅菌后待用。在超凈工作臺(tái)上，向培養(yǎng)皿內(nèi)倒入20 mL PDA培養(yǎng)基，剩余空間容積為70 mL，接種直徑5 mm的各病原菌菌餅，在濾紙片上分別滴加 1.4、2.8、4.2、5.6 和 7.0 μL各植物精油，迅速封口，使其濃度分別為 20、40、60、80和100 μL/L。以不加精油為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)4次。25 ℃黑暗培養(yǎng)4～7 d，待對(duì)照組菌落直徑長(zhǎng)至皿內(nèi)徑2/3左右時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑。計(jì)算各處理的抑制率（%），抑制率（%）＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－菌餅直徑）×100。采用 SPSS18.0軟件計(jì)算各種精油的EC50值。

1.8 活體抑菌效果測(cè)定

選擇體外抑菌效果較好的百里香精油、玫瑰草精油、檸檬草精油和肉桂精油進(jìn)行活體抑菌試驗(yàn)。取10枚健康、無傷口的草莓果實(shí)，經(jīng)表面消毒處理后，在濃度為1×106孢子/mL的各病原菌孢子懸浮液中分別浸泡30 s，取出瀝干水分，置于容積1 L的無菌保鮮盒內(nèi)。盒蓋內(nèi)側(cè)粘貼一張直徑5 cm的濾紙，其上滴加100 μL植物精油。以不加精油為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。常溫放置3 d后，記錄各處理發(fā)生腐爛的病果數(shù)，并計(jì)算發(fā)病率和各處理的防效。發(fā)病率（%）＝病果數(shù)/總果數(shù)×100，防效（%）＝（對(duì)照組發(fā)病率－處理組發(fā)病率）/對(duì)照組發(fā)病率×100。采用SPSS18.0軟件分析各處理間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓采后病原菌的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定 從自然腐爛的“香野”草莓果實(shí)上分離得到病原菌226株，根據(jù)形態(tài)將相同菌株合并，數(shù)量最多的3種病原菌分別有102株、53株和39株，分別編號(hào)為CH-1、CH-2和CH-3。

菌株CH-1菌落呈圓形，邊緣呈放射狀，菌絲較疏松，氣生菌絲發(fā)達(dá)，初為白色，后變?yōu)闇\褐色，后期可產(chǎn)生黑色菌核。顯微鏡檢顯示，CH-1菌絲短，分支多。分生孢子梗較長(zhǎng)，叢生，有隔，產(chǎn)生大量分生孢子；分生孢子圓形，無色，單胞，表面光滑（圖1）。

圖1 菌株CH-1菌落及菌絲顯微圖片F(xiàn)ig.1 Colony and hypha micrograph of strain CH-1

菌株CH-2菌落呈圓形，顏色由中心向外逐漸由褐色變?yōu)榘咨z絨狀、較密實(shí)；顯微鏡檢顯示，菌絲細(xì)長(zhǎng)，分支少，透明，有分隔；分生孢子呈鏈狀，頂端稍彎曲（圖2）。

圖2 菌株CH-2菌落及顯微圖片F(xiàn)ig.2 Colony and micrograph of strain CH-2

菌株CH-3菌落呈圓形，顏色為淺灰色至深灰色，有同心圈，菌絲較密，氣生菌絲較少；顯微鏡檢顯示，菌絲細(xì)長(zhǎng)，分隔少；分生孢子倒棒錘形，有縱橫分隔，分隔處有縊縮（圖3）。

圖3 菌株CH-3菌落及顯微圖片F(xiàn)ig.3 Colony and micrograph of strain CH-3

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 以真菌通用引物ITS1/ITS4對(duì)CH-1、CH-2和CH-3菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到了542、573和555 bp的基因片段。將序列進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，3菌株和已知菌株均有較高的相似性。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株CH-1與灰葡萄孢菌B.cinerea聚在一枝（圖4），相似度最高，結(jié)合菌落和孢子形態(tài)特征，將其鑒定為灰葡萄孢菌；菌株CH-2與鏈格孢菌A.alternata相似度最高（圖5），結(jié)合菌落形態(tài)特征，將其鑒定為鏈格孢菌；菌株CH-3與枝孢菌C.tenuissimum聚在一枝（圖6），結(jié)合菌落形態(tài)和文獻(xiàn)報(bào)道[7]將其鑒定為枝孢菌。

圖4 菌株CH-1的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 ITS phylogenetic tree of CH-1

圖6 菌株CH-3的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 ITS phylogenetic tree of CH-3

2.1.3 致病力鑒定 3株病原菌的孢子懸浮液處理，2～3 d均可使草莓果實(shí)發(fā)病，與原發(fā)病癥狀一致。且病原菌重新分離后，培養(yǎng)性狀與原菌株一致（圖7）。

圖7 病原菌回接癥狀Fig.7 Re-inoculated symptom of pathogens

2.2 7種精油對(duì)草莓采后病原菌的抑制活性

2.2.1 7種精油對(duì)草莓果實(shí)灰葡萄孢菌的抑制活性 在供試7種精油中，丁香精油對(duì)草莓果實(shí)灰葡萄孢菌的抑制活性最低，EC50值為96.074 μL/L；百里香精油對(duì)灰葡萄孢菌的毒力最高，EC50值為39.998 μL/L，相較于丁香精油的相對(duì)毒力指數(shù)為2.40；其次為玫瑰草精油，EC50值為41.545 μL/L，相對(duì)毒力指數(shù)為2.31；此外，肉桂精油、薄荷精油和檸檬草精油的EC50值分別為61.684、72.553和79.631 μL/L，相對(duì)毒力指數(shù)分別為1.56、1.32和1.21（表1）。

表1 7種精油對(duì)草莓果實(shí)灰葡萄孢菌的室內(nèi)毒力Table 1 Indoor toxicity of 7 kinds of essential oil on B.cinerea of strawberry fruit

2.2.2 7種精油對(duì)草莓果實(shí)鏈格孢菌的抑制活性 在供試7種精油中，月桂葉精油對(duì)草莓果實(shí)鏈格孢菌的室內(nèi)毒力最低，EC50值為64.815 μL/L；百里香精油的室內(nèi)毒力最高，EC50值為18.456 μL/L，相較于月桂葉精油的相對(duì)毒力指數(shù)為3.51；其次為檸檬草精油，EC50值為29.448 μL/L，相對(duì)毒力指數(shù)為2.20；玫瑰草精油的EC50值為40.179 μL/L，相對(duì)毒力指數(shù)為1.61；肉桂精油、丁香精油和薄荷精油對(duì)草莓果實(shí)鏈格孢菌的室內(nèi)毒力較低，EC50值分別為53.464、54.441和57.507 μL/L，相對(duì)毒力指數(shù)分別為1.21、1.19和1.13（表2）。

表2 7種精油對(duì)草莓果實(shí)鏈格孢菌的室內(nèi)毒力Table 2 Indoor toxicity of 7 kinds of essential oil on A.alternata of strawberry fruit

2.2.3 7種精油對(duì)草莓果實(shí)枝孢菌的抑制活性 由表3可以看出，在供試7種精油中，月桂葉精油對(duì)草莓果實(shí)枝孢菌的抑制活性最低，EC50值為79.322 μL/L；薄荷精油次之，EC50值為78.619 μL/L，相較于月桂葉精油的相對(duì)毒力指數(shù)為1.01；檸檬草精油對(duì)枝孢菌的活性最高，EC50值為30.523 μL/L，相較于月桂葉精油的相對(duì)毒力指數(shù)為2.60；此外，玫瑰草精油、百里香精油、肉桂精油和丁香精油的EC50值分別為44.370、48.264、53.076和54.670 μL/L，相對(duì)毒力指數(shù)分別為1.79、1.64、1.49和1.45。

表3 7種精油對(duì)草莓果實(shí)枝孢菌的室內(nèi)毒力Table 3 Indoor toxicity of 7 kinds of essential oil on C.tenuissimum of strawberry fruit

2.3 4種精油的活體抑菌效果評(píng)價(jià)

濃度均為100 μL/L，百里香精油和玫瑰草精油對(duì)草莓灰葡萄孢菌的活體抑菌效果較好，防效分別為86.21%和72.41%。百里香精油和檸檬草精油對(duì)草莓鏈格孢菌的防效較高，分別為89.29%和78.57%。4種精油對(duì)枝孢菌的活體抑菌效果均略低，其中檸檬草精油防效最高，為75.86%（表4）。

3 討論

病原菌侵染引起的果實(shí)腐爛是造成草莓采后損失的重要原因之一。探明草莓果實(shí)貯藏期主要致病菌種類，并探索無毒、環(huán)境友好的抑菌手段，對(duì)延長(zhǎng)草莓貨架期和保障草莓產(chǎn)業(yè)食品安全具有重要意義[18]。本研究經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，初步確定山東省泰安市“香野”草莓采后主要病原菌為灰葡萄孢菌、鏈格孢菌和枝孢菌。這與李英華等[19]報(bào)道的新疆“達(dá)賽萊克特”草莓果實(shí)采后病原菌主要為黑根霉、青霉屬、灰葡萄孢屬和疫霉屬的結(jié)果不完全一致，是否存在地區(qū)和品種間差異尚有待進(jìn)一步探明。

Blacharski等[20]報(bào)道，異菌脲、啶酰菌胺、咯菌腈等浸泡處理可以降低草莓果實(shí)貯藏期間灰霉病等病害的發(fā)生率。但隨著消費(fèi)者健康意識(shí)的增強(qiáng)，在草莓保鮮領(lǐng)域，化學(xué)合成殺菌劑將逐漸被其他更安全有效的處理方式所取代[21]。

很多植物含有天然的抗菌活性成分，是提取生物保鮮劑的重要原料。植物精油一般從植物的花、葉片、果實(shí)或根莖中提取，經(jīng)過提煉濃縮而得，具有抗菌和抗氧化的作用，被美國(guó) FDA認(rèn)可為“一般認(rèn)為安全的物質(zhì)”（Generally Recognized As Safe，GRAS）。其作為廣譜性抑菌劑，已逐漸應(yīng)用于果品保鮮領(lǐng)域[22]。植物精油對(duì)微生物的作用方式十分復(fù)雜，報(bào)道較多的主要包括2種：一種是破壞菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞膜變形，或胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，誘發(fā)菌體溶解；第二種是抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)[23]。王丹等[16]報(bào)道，肉桂精油對(duì)藍(lán)莓采后尖孢鐮刀菌、鏈格孢菌和灰葡萄孢菌均有較好的抑制效果，其最小抑菌濃度分別為60、30和 30 μL/L。翟浩等[13]報(bào)道，80 μL/L肉桂精油對(duì)免套袋蘋果采后葡萄座腔菌B.dothidea、鏈格孢菌Alternaria、粉紅單端孢菌Trichotheciumroseum、韋司梅擬盤多毛孢菌Pestalotiopsisvismiae、膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides及產(chǎn)核枝頂孢菌Acremoniumsclerotigenum的抑制率均超過80%。劉瑞玲等[24]從貯藏期紅肉火龍果中分離得到2種病原菌，分別為層生鐮刀菌和平頭炭疽菌，發(fā)現(xiàn)2000 μL/L香芹酚精油、肉桂精油和百里香精油對(duì)其菌絲生長(zhǎng)抑制率均為 100%。盧錕等[25]報(bào)道，肉桂精油和丁香精油對(duì)儲(chǔ)藏期大米青霉和黑曲霉的抑菌效果最好，將肉桂精油與山蒼子精油按3:1（v/v）復(fù)配，其對(duì)大米青霉和黑曲霉的最小抑菌濃度為0.1 μL/mL。

本研究評(píng)價(jià)了薄荷精油、丁香精油、檸檬草精油、玫瑰草精油、月桂葉精油、肉桂精油和百里香精油對(duì)“香野”草莓果實(shí)采后灰葡萄孢菌、鏈格孢菌和枝孢菌的室內(nèi)毒力，發(fā)現(xiàn)百里香精油對(duì)灰葡萄孢菌和鏈格孢菌的室內(nèi)毒力均最高，EC50值分別為39.998和18.456 μL/L，檸檬草精油對(duì)枝孢菌的活性最高，EC50值為 30.523 μL/L。綜合比較可以發(fā)現(xiàn)，百里香精油、玫瑰草精油、檸檬草精油及肉桂精油對(duì)草莓采后 3種病原菌均具有較高的離體抑制效果?；铙w抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，濃度均為100 μL/L，百里香精油對(duì)草莓果實(shí)灰葡萄孢菌和鏈格孢菌的活體抑菌效果較好，防效分別為 86.21%和 89.29%。4種精油對(duì)枝孢菌的活體抑菌效果均略低，其中檸檬草精油防效最高，為75.86%。由此可見，百里香精油和檸檬草精油對(duì)草莓果實(shí)采后病害的活體抑菌效果較好，但其抑菌機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

將可食性成膜材料與抑菌精油相結(jié)合，既可降低果實(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，又能抑制病原菌的增殖，對(duì)草莓果品保鮮具有重要意義[26]。吳子龍等[27]報(bào)道，殼聚糖與姜精油配置成保鮮液，進(jìn)行草莓涂膜處理，可以降低草莓腐爛率、失重率，減少Vc和可溶性糖含量的損失，延緩草莓貯藏品質(zhì)的下降?？得鼷惖萚28]報(bào)道，在羧甲基纖維素鈉溶液中添加大蒜精油作為涂膜材料處理草莓，可降低果實(shí)呼吸作用強(qiáng)度，延緩花色苷的分解，有良好的護(hù)色作用。本研究發(fā)現(xiàn)，百里香精油、玫瑰草精油、檸檬草精油及肉桂精油對(duì)草莓采后3種病原菌均具有較高的抑制效果，在后續(xù)研究中，可將上述精油與可食性涂膜材料相結(jié)合，制備含功能精油的成膜劑，提高精油穩(wěn)定性，助力草莓貯藏保鮮領(lǐng)域的綠色高效發(fā)展。