姜瘟病生防菌幼套近明球囊霉N62的篩選鑒定

汪 茜，李冬萍，覃曉娟，車江旅，宋 娟*，陳廷速*

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，南寧 530007）

姜瘟病，又稱姜腐爛病，是由青枯勞爾氏菌Ralstoniasolanacearum（R.S）侵染所致[1]。姜瘟病是生姜ZingiberofficinaleRoscoe生產(chǎn)中經(jīng)常發(fā)生的病害，一般病田發(fā)病率為10%～30%，重癥田高達(dá)90%以上，甚至全田枯死，種姜全部腐爛[2]，經(jīng)濟(jì)損失巨大，嚴(yán)重制約了生姜產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。由于該病為土壤傳播，常規(guī)化學(xué)藥劑很難在土壤中起到持續(xù)控病作用；采用作物輪作的方式雖然可以減輕姜瘟病的發(fā)生，但需要較長的輪作周期才能達(dá)到較好的防病效果。隨著生物防治技術(shù)在作物土傳病害防治中的發(fā)展與應(yīng)用，利用生防微生物防治姜瘟病將是可供選擇的一條有效防控途徑。叢枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM）真菌能與植物根系形成互惠共生體，在植物根際形成龐大的菌絲網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，目前90%以上的陸地植物都能形成叢枝菌根[3]。AM真菌能夠促進(jìn)宿主植物吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)[4,5]，減少植物病害，提高植物抗病性，改善土壤生態(tài)，修復(fù)退化土壤，保證甚至促進(jìn)植物在逆境中的生長發(fā)育[6-8]。李應(yīng)德等[9]研究發(fā)現(xiàn)，接種摩西球囊霉Glomusmosseae可抑制煙色織孢霉Microdochiumtabacinum對紫花苜蓿Medicagosativa的侵染危害，降低根腐病發(fā)病率。王維華等[10]研究結(jié)果表明接種AM真菌能顯著增加生姜植株的株高、分枝數(shù)、單株葉面積、根莖產(chǎn)量，提高經(jīng)濟(jì)系數(shù)和葉片中葉綠素含量。隨著生育期的延長，生姜植株對AM真菌的依賴性增大。劉貴猛等[11]研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌地表球囊霉Glomusversiforme與植物根際促生細(xì)菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）假單胞菌S3-11菌株組合能夠相互促進(jìn)、協(xié)同抑制生姜青枯病菌、誘導(dǎo)生姜抗病性、促進(jìn)生姜生產(chǎn)和增加產(chǎn)量。目前，利用AM真菌防治姜瘟病的研究報道較少，可利用的菌株數(shù)量不多。為了進(jìn)一步發(fā)掘姜瘟病的生防菌資源，本研究從生姜根際土壤中分離篩選出 1 株對青枯勞爾氏菌具有明顯促生及防治效果的生防AM真菌。通過形態(tài)學(xué)及18S rDNA分子生物學(xué)相結(jié)合將其鑒定為幼套近明球囊霉，以期為姜瘟病的生物防治提供新的菌種資源，也為后續(xù)抗病菌劑菌肥的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試AM真菌菌株N62、LC39-10、GZ-10、FS-1-74由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；生姜（ZingiberofficinaleRoscoe）組培苗由本實(shí)驗(yàn)室培育；姜瘟病病原菌為青枯勞爾氏菌Ralstoniasolanacearum，分離菌株Gg06，由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院惠贈，分離自百色生姜根際土壤。

1.2 病原菌及菌劑制備

病原菌制備：將病原菌轉(zhuǎn)接于NA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，制備菌液，用無菌水調(diào)整菌液濃度至1×108cfu/mL，備用。

AM菌劑制備：以玉米為宿主，將AM菌株的孢子接種于玉米幼苗根系，種植于以河沙:沸石=3:1（河沙粒徑≤2 mm，沸石粒徑2 mm）于121℃高壓蒸汽滅菌2 h的培養(yǎng)基質(zhì)中進(jìn)行盆栽（種植盆規(guī)格為206 mm×175 mm×150 mm），每盆種植3～5株玉米。光照培養(yǎng)12～16周；每周澆50% Hoagland營養(yǎng)液；培養(yǎng)12～16周后除去莖稈，保留玉米根系以及培養(yǎng)基質(zhì)中含有的AM真菌菌絲、孢子即為AM真菌菌劑。

1.3 菌株對生姜生長影響的測定

盆栽試驗(yàn)基質(zhì)為滅菌的河沙，將基質(zhì)放于塑料盆底部（占體積1/3），取4葉期大小的生姜組培苗，放置于盆中央，然后將接上述制備好的AM菌劑均勻?yàn)⒂诮绺蹈浇?，每?00 g，最后覆蓋2～3 cm厚的基質(zhì)，用自來水澆透。每個處理重復(fù)5盆，以不接種AM菌劑處理為對照。45 d后取每個處理的部分根系做AM真菌根系侵染試驗(yàn)，3個月后測定生姜苗的株高、葉片數(shù)、鮮重和干重。

1.4 菌株的定殖檢測

將根系清洗干凈剪成2 cm長，加20% KOH溶液完全浸泡根系，90 ℃水浴10 min后用自來水輕輕沖洗3次。用堿性 H2O2脫色60 min，用自來水沖洗3次。加5%乙酸溶液室溫酸化5 min，去掉乙酸溶液，用自來水輕輕沖洗3次。再用5%的墨水醋染液（Quink牌純黑墨水）在66 ℃水浴染色30 min，然后用清水浸泡（12 h）脫色后即可鏡檢[12]。以PVLG為浮載劑將染色根段壓成顯微制片。在200×顯微鏡下觀察染色根段中的AM真菌侵染結(jié)構(gòu)，并利用十字交叉法[13]測定AM真菌總定殖率。

1.5 菌株對姜瘟病的防治效果測定

溫室試驗(yàn)中，測定AM菌劑對姜瘟病的防效作用?；|(zhì)為滅過菌的河沙，按照1.3描述的方法接種AM菌劑，1周之后每株生姜苗澆取25 mL的青枯菌菌液灌根處理，其濃度為l×108cfu/mL，以不接菌根真菌的處理為對照，每個處理5盆。7 d后調(diào)查葉片發(fā)病情況[14]，病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無癥狀；，1%～25%的葉片出現(xiàn)萎蔫癥狀；2級，全株26%～50%的葉片出現(xiàn)萎蔫癥狀；3級，全株51%～75%的葉片出現(xiàn)萎蔫；4級，全株76%～100%的葉片出現(xiàn)萎蔫癥狀。計(jì)算病情指數(shù)和防效，病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.6 生防菌株的分類鑒定

1.6.1 形態(tài)學(xué)鑒定 取20 g土樣用濕篩傾注-蔗糖離心法，篩取孢子，在體視鏡下先觀察記錄孢子的顏色、大小、連孢菌絲的特征、孢子果形態(tài)等。在此基礎(chǔ)上，用毛細(xì)吸管挑取新鮮的AM真菌孢子置于載玻片上，加浮載劑（水、乳酸、乳酸甘油、PVLG）后，在Nikon E-600顯微鏡下觀察，記錄孢子的形狀、大小、顏色、表面紋飾，孢子內(nèi)含物、連孢菌絲的數(shù)目、寬度及形狀、孢壁結(jié)構(gòu)、輔助細(xì)胞（土生泡囊）、外生菌絲及附屬結(jié)構(gòu)產(chǎn)孢子囊等特征；同時輔助使用Melzer′s試劑、棉蘭試劑，觀察孢子的特異反應(yīng)，對有代表性或特異性的特征進(jìn)行拍照。根據(jù)孢子的形態(tài)特征，采用Schü?ler和Walker[15]的分類系統(tǒng)，并參閱王幼珊和劉潤進(jìn)[16]“球囊菌門叢枝菌根真菌最新分類系統(tǒng)菌種名錄”和相關(guān)網(wǎng)站：http://invam.caf.wvu.edu（INVAM，West Virginia University，USA）；http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota/Taxonomy.html（Department of Plant Pathology，University of Agriculture in Szczecin，Poland）及 http://www.lrz.de/～schuessler/amphylo/amphylogeny.html的鑒定資料以及近幾年發(fā)表新種的原始描述，進(jìn)行種屬的檢索、鑒定。AM真菌孢子以Melzer′s:PVLG = 1:1或PVLG為浮載劑制成玻片標(biāo)本，密封、編號并進(jìn)行貯藏。

1.6.2 分子鑒定 對AM真菌孢子進(jìn)行表面消毒，用移液槍挑取孢子至1.5 mL離心管中，加無菌水清洗，放入超聲波處理3～5次后，加入2%（w/v）氯胺T+2滴吐溫20，保證消毒液沒過孢子，搖晃10 min，用無菌水沖洗3～5次后，加入200 mg/L鏈霉素+100 mg/L硫酸慶大霉素混合消毒液，搖晃浸泡10 min后，用無菌水沖洗3～5次，靜置20 min后于4 ℃保存?zhèn)溆肹17]。

依據(jù)董秀麗和趙斌[18]描述的方法對AM真菌單孢DNA提取，即用移液槍吸取單個AM真菌孢子，用無菌水漂洗5次后，將其放入無菌的1.5 mL離心管中，加入40 μL TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0），將其充分破碎后，加入10 μL 20% Chelex-100，以減少金屬離子對DNA的影響。沸水浴10 min，冰浴1～2 min，15000 r/min離心5 min，吸取上清液到新的離心管中，置于-20 ℃保存，備用。

將AM真菌單孢DNA作為第一次PCR擴(kuò)增模板，將第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍后作為第二次PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行nested-PCR。第1次PCR擴(kuò)增采用真菌18S rDNA通用引物GeoA2（5′-CCAGTAGT CATATGCTTGTCTC-3′）和 Geo11（5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′）[19]，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸100 s，循環(huán)30次，最后 72 ℃延伸 10 min，擴(kuò)增片段的大小約1800 bp；第2次 PCR 擴(kuò)增采用AM真菌特異性引物NS31（5′-TTGGAGGGCAAGTCTGG TGCC-3′）和 AML2（5′-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC-3′），擴(kuò)增片段的大小約 550 bp，模板以第一次PCR產(chǎn)物稀釋100倍，取2 μL，反應(yīng)體系與第一次PCR相同，反應(yīng)程序退火溫度改為50 ℃，延長時間為50 s，其余反應(yīng)程序與第一次相同。取擴(kuò)增產(chǎn)物 2 μL，用1.2%瓊脂凝膠電泳檢測。產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用 SPSS 18.0 軟件分析進(jìn)行組件均值數(shù)據(jù)的One-way ANOVA差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種菌株對生姜生長的影響

接種AM真菌菌株可有效促進(jìn)生姜植株的生長，植株的株高、葉片數(shù)、鮮重和干重的增長幅度分別為6.04%～30.2%、23.9%～43.5%、22.1%～54.7%、16.3%～71.9%，其中接種N62后生姜植株生長健壯，未出現(xiàn)各種病害癥狀，該處理株高、莖徑、鮮重和干重均比對照顯著增加（表1）。

表1 不同AM真菌菌株對生姜組培苗生長的影響Table 1 The effect of different AM fungi on ginger growth

2.2 AM真菌在生姜根系中的定殖

生姜組培苗接種AM真菌菌株40 d后，對生姜根系染色進(jìn)行顯微鏡觀察。4株AM真菌菌株的定殖率為27.7%～53.5%，其中N62、LC39-10、GZ-10的定殖率較高，但相互間差異不顯著，菌株 FS-1-74的定殖率最低（圖1）。接種菌株N62的生姜根段中有AM真菌的孢子、泡囊及菌絲的典型結(jié)構(gòu)，空白對照中未見菌絲體定殖（圖2）。

圖1 不同AM真菌菌株的定殖率Fig.1 The colonization rate in ginger roots with different AM fungi

圖2 生姜根系A(chǔ)M真菌侵染情況Fig.2 The colonization of AM fungi in ginger roots

2.3 AM真菌對姜瘟病的防治效果

生姜接種AM真菌處理對姜瘟病產(chǎn)生了強(qiáng)弱不一的防治效果，盆栽防效為16.8%～58.6%，其中菌株N62處理的生姜植株表現(xiàn)的防治效果最佳，顯著高于其他處理（圖3，4）。

圖3 不同AM真菌菌株對姜瘟病的防治效果Fig.3 The effect of inhibition ginger wilt with different AM fungi

圖4 菌株N62對姜瘟病的防治效果Fig.4 The effect of strain N62 on ginger wilt

2.4 菌株N62的分類鑒定

菌株N62孢子在土壤中單生，球形或近球形，黃至黃棕色，直徑80.0～140.0 μm（圖5A）。孢子壁：2層。外層無色透明，表面不均勻，厚1.0～3.0 μm（圖5B）；外層在成熟孢子中脫落，有時只剩部分殘屑，在Melzer’s試劑反應(yīng)中呈粉紅色（圖5C），在棉蘭試劑反應(yīng)中呈淺藍(lán)色（圖 5D）。內(nèi)層厚3.0～6.0 μm。由多層薄壁組成，淡黃色至淡黃棕色層狀壁。連孢菌絲：圓筒狀至小喇叭狀，無色透明，寬3.0～6.0 μm，孢子成熟后即萎縮脫落。連點(diǎn)孔寬7～10 μm，兩層壁，成熟孢子外層常脫落，內(nèi)層與孢子壁內(nèi)層連接，有一個由內(nèi)壁形成的隔封閉連點(diǎn)（圖5E）。

圖5 菌株N62形態(tài)鑒定Fig.5 Morphological characteristics of strain N62

對菌株N62的18S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，得到的片段長度為550個堿基序列（GenBank登錄號：MT378291）。對該菌株的18S rDNA序列用Blast軟件與GenBank中已有序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與幼套近明球囊霉Claroideoglomusetunicatum有98%的最大同源性。用軟件MEGA version 7.0將菌株N62與來自GenBank的16株真菌一起構(gòu)建基于18S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）結(jié)果顯示：16株真菌劃分為2個類群，屬于AM真菌的12株真菌在100% boostrap水平上聚一群，不屬于AM真菌的3個菌株另聚一群，菌株N62則與近明球囊霉屬Cladosporium中的幼套近明球囊霉（MN726591和MN726593）聚為一支，同源性為97%。菌株N62的形態(tài)學(xué)與幼套近明球囊霉相符，結(jié)合基于18S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，將菌株N62鑒定為幼套近明球囊霉。

圖6 基于18S rDNA序列同源性的菌株N62的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on 18S rDNA sequence homology of strain N62 with the related bacteria derived from GenBank database

3 討論

AM真菌鑒定是菌根研究的基礎(chǔ)，其對保護(hù)菌種多樣性，促進(jìn)AM真菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用具有重要意義。目前，AM真菌的鑒定主要使用孢子形態(tài)鑒定和分子鑒定兩種方法。孢子的形態(tài)鑒定存在分離過程繁瑣和鑒定難度較高等問題，分子鑒定具有較高的穩(wěn)定性，并可以對樣本中的菌絲體進(jìn)行鑒定。本研究通過形態(tài)學(xué)特征分析，結(jié)合18S rDNA 基因序列的比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，將分離得到的菌株N62鑒定為幼套近明球囊霉。并已向中國普通微生物菌種保藏管理中心申請菌種專利保藏，編號為CGMCC No.17987。

姜瘟病已成為影響生姜產(chǎn)量和品質(zhì)的最主要因素，現(xiàn)主要采用農(nóng)用硫酸鏈霉素等抗生素浸種或氯化苦等化學(xué)農(nóng)藥土壤消毒，但極易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性和環(huán)境污染。生產(chǎn)上也常采用抗病品種和輪作套種的方式來進(jìn)行防治，但效果均不理想[20]。充分挖掘自然生態(tài)系統(tǒng)中共生微生物的促生和抗病潛力，提高我國生姜的生產(chǎn)能力，保護(hù)和改善姜地的生態(tài)環(huán)境，對促進(jìn)我國生姜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前，國內(nèi)外研究學(xué)者對姜瘟病的生物防治研究中涉及的主要生防微生物為木霉和芽胞桿菌等真菌、細(xì)菌和放線菌有益微生物[21-23]，但這些生防微生物大多只定殖在生姜根際土壤中，受土壤微生態(tài)環(huán)境因子的影響較大，導(dǎo)致田間的生防效果不穩(wěn)定，很難大面積推廣，亟待發(fā)掘生防效果穩(wěn)定的新型生防微生物。由于AM真菌能夠通過定殖于植物根系內(nèi)并與宿主形成互惠的共生體，其相對于完全暴露在根際土壤中的其他生防微生物受到環(huán)境的影響相對較小[24,25]，更容易獲得穩(wěn)定的防治效果。本研究中所接種的4株AM真菌菌株有效提高了生姜幼苗的株高、葉片數(shù)、鮮重和干重，不同程度地促進(jìn)了生姜的生長，與前人的研究結(jié)果一致[10]。盆栽試驗(yàn)評價其對姜瘟病的防治效果，結(jié)果顯示生姜接種 AM 真菌處理對姜瘟病產(chǎn)生了強(qiáng)弱不一的防治效果，其中幼套近明球囊霉 N62處理的生姜植株表現(xiàn)的防治效果顯著優(yōu)于其他菌株，盆栽防治效果為58.6%，防效相對穩(wěn)定，但田間的防治效果仍需進(jìn)一步的田間評價。前人研究發(fā)現(xiàn)，接種幼套球囊霉顯著降低黃瓜枯萎病病情指數(shù)和發(fā)病率，根際真菌減少，細(xì)菌增多，降低了病原菌侵害宿主的機(jī)率[26]，本研究的幼套近明球囊霉 N62也能顯著降低姜瘟病病情指數(shù)和發(fā)病率，下一步將深入研究接種幼套近明球囊霉N62對生姜植株根際土壤微生物群落的變化，揭示其抗病機(jī)制。

在開展生姜根系A(chǔ)M真菌侵染與姜青枯菌關(guān)系研究中，觀察到同一生姜根內(nèi)同時著生有AM真菌和深色有隔內(nèi)生真菌（dark septate endophytes，DSE）結(jié)構(gòu)（圖2C），DSE是一類能與寄主植物互惠共生的微生物，其定殖宿主具有非專一性，且在逆境環(huán)境中，DSE也分布廣泛，可能具有與菌根真菌相似生態(tài)學(xué)功能[27,28]。關(guān)于DSE在生姜生長過程中的生態(tài)學(xué)功能，以及DSE與AM真菌之間的相互關(guān)系還待進(jìn)一步的研究。

田間條件下單靠AM真菌或PGPR對于植物病害往往難以達(dá)到理想的防治效果。為此，人們試圖以與AM真菌常常共生的PGPR來加強(qiáng)AM真菌的生防功能，因?yàn)橐欢ǚN類的AM真菌與PGPR的適當(dāng)搭配組合能相互促進(jìn)對方的定殖并協(xié)同發(fā)揮生理生態(tài)作用。劉貴猛等[11]發(fā)現(xiàn)AM真菌地表球囊霉Glomusversiforme與PGPR假單胞菌S3-11菌株組合能夠通過相互促進(jìn)對方的侵染與定殖，協(xié)同抑制生姜青枯病菌的繁殖和侵染，誘導(dǎo)植物合成防御性酶并提高其活性，進(jìn)而改善植物的抗病性、降低危害程度。本研究中菌株N62也有類似的功能，但是單菌株抗姜瘟病的機(jī)制與混合菌株的抗病機(jī)制是否一致還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。