木霉菌對植物寄生線蟲防治作用機制

王秀娟，張樹武，徐秉良

（甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070）

植物寄生線蟲（Plant-parasitic nematodes，PPNs）是引起植物病害的一類重要經(jīng)濟類有害生物[1,2]。據(jù)估計，全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中因其危害造成的經(jīng)濟損失每年高達1570億美元[3]。植物寄生線蟲引起的線蟲病已成為我國主要的農(nóng)業(yè)病害之一，嚴重阻礙我國糧食、經(jīng)濟作物安全生產(chǎn)。長期以來，施用化學殺線蟲劑一直是防治植物線蟲病害的主要措施，然而大量施用化學藥劑不僅會使線蟲產(chǎn)生抗藥性，還會造成嚴重的環(huán)境污染問題并危害人體健康，進而導(dǎo)致大多數(shù)高毒類殺線劑已被禁用或限制使用[4]。同時，隨著人們綠色環(huán)保意識的提高和無公害生產(chǎn)的要求，生物防治因能有效減少化學農(nóng)藥的使用并減輕環(huán)境污染已逐漸成為植物寄生線蟲病安全有效的防治措施。

木霉菌Trichodermaspp.是一類廣泛分布于土壤中的有益菌，因在線蟲病防治中極具生防潛力而被廣泛研究[1,2,4-6]。近年來，木霉對植物線蟲病的防治機理已成為木霉生防研究中的重要科學問題。本文主要從木霉防治線蟲病的直接和間接生防機制的視角，綜述了木霉對線蟲的重寄生作用、毒殺作用及其對植物的誘導(dǎo)抗性和促生作用等多種協(xié)同防治植物病原線蟲病的機制，以期為進一步深入研究生防木霉菌防治植物線蟲病提供新思路。

1 木霉菌防治線蟲的直接作用機制

1.1 木霉菌重寄生作用

木霉菌通過重寄生作用進行識別、接觸、纏繞和穿透線蟲來抑制或溶解寄主體壁，是木霉最重要、最廣泛的生防機制之一[7]。研究表明，木霉菌胞外酶在木霉菌重寄生作用過程扮演著重要的作用，如其在重寄生過程中分泌幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、葡聚糖酶等一系列水解酶來消解線蟲孢囊、卵、體壁，其中以幾丁質(zhì)酶和蛋白酶尤為重要[1,2,7-9]。目前，已發(fā)現(xiàn)哈茨木霉T.harzianum[10]、康寧木霉T.koningiopsis[11]、綠色木霉T.viride[6]和長枝木霉T.longibrachiatum[1]等菌株可以有效抑制根結(jié)線蟲的繁殖，本課題組前期分離篩選出適宜于西部干旱生態(tài)環(huán)境條件下的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的一株長枝木霉T6殺線菌株，并發(fā)現(xiàn)其對禾谷孢囊線蟲Heteroderaavenae孢囊、卵和幼蟲均具有較強的寄生和致死作用，利用顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其寄生后能夠?qū)е骆吣摇⒙押途€蟲體壁破裂和溶解[2,4,12]，進一步研究發(fā)現(xiàn)其能夠通過提高和分泌大量幾丁質(zhì)酶和蛋白酶導(dǎo)致孢囊體壁和卵殼溶解，以及能夠分泌蛋白酶導(dǎo)致南方根結(jié)線蟲Meloidogyneincognita幼蟲體壁溶解和線蟲死亡[1]。

1.1.1 木霉菌幾丁質(zhì)酶殺線作用及機理 幾丁質(zhì)酶是木霉菌胞外酶的重要組成成分之一，主要由內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（Endochitinase）和外切幾丁質(zhì)酶（Exochitinase）組成，其在重寄生線蟲過程中發(fā)揮著重要的殺線功能。木霉菌分泌的幾丁質(zhì)酶在線蟲寄生和致死作用中已有相關(guān)研究，Sahebani等[10]報道爪哇根結(jié)線蟲M.javanica卵能夠誘導(dǎo)哈茨木霉BI幾丁質(zhì)酶活性的升高，進而提高其侵染卵的活力。Baldoni等[11]從51株分離的真菌中篩選出康寧木霉UFSMQ40具有較好的殺線活性，通過以膠體幾丁質(zhì)作為誘導(dǎo)劑提取的幾丁質(zhì)酶發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲有較高的致死率。Szabo等[13]研究表明，18株木霉菌株中有5株木霉菌對植物寄生線蟲具有較強的寄生作用，其中哈茨木霉SZMC 1647對植物寄生線蟲卵具有較強的寄生作用，進一步利用實時熒光定量PCR分析哈茨木霉SZMC 1647幾丁質(zhì)酶基因chi18-5（chit42）和chi18-12（chit33）的表達量發(fā)現(xiàn)，chi18-5（chit42）和chi18-12（chit33）在不同時間點存在較明顯的表達量差異，但總體而言，哈茨木霉與線蟲互作過程中幾丁質(zhì)酶基因高表達，表明哈茨木霉與線蟲互作過程中，線蟲卵可能誘導(dǎo)哈茨木霉幾丁質(zhì)酶基因chi18-5（chit42）和chi18-12（chit33）顯著上調(diào)表達，進一步調(diào)控其產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的能力增強，從而促進線蟲卵體壁溶解。然而，有關(guān)chi18-5（chit42）和chi18-12（chit33）基因的具體功能還有待后期進一步驗證。朱玉婷等[14]從煙草南方根結(jié)線蟲卵中分離到 1株可產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的長枝木霉HBF1，從菌株HBF1中克隆到1個幾丁質(zhì)酶基因，命名為TlChi46，初步預(yù)測該基因編碼氨基酸的個數(shù)、理論分子量及等電點分別為423個、45.9 kDa、5.23，通過構(gòu)建TlChi46與昆蟲寄生菌幾丁質(zhì)酶基因的進化樹明確了二者親緣關(guān)系可能相對較遠，該基因能否合成幾丁質(zhì)酶并殺死線蟲仍待進一步驗證。

1.1.2 木霉菌蛋白酶殺線作用及機理 木霉菌胞外蛋白酶是另一類重要的細胞壁降解酶，對植物病原線蟲的生物防治也有著重要作用，木霉與植物病原線蟲互作時，木霉分泌的蛋白酶能失活鈍化寄主線蟲體壁，降解病原線蟲體壁中蛋白質(zhì)組分等途徑，與其他細胞壁降解酶協(xié)同發(fā)揮對線蟲的致死作用[3,15]。Geremia等[16]從哈茨木霉IMI206040中分離到一種堿性絲氨酸蛋白酶Prb1，分子量31 kD，等電點9.2。隨著分子生物技術(shù)水平的飛速發(fā)展，編碼木霉菌蛋白酶prb1基因已克隆，同時過表達prb1基因的突變體能夠增強木霉菌的生防功能[17]。另有研究表明，哈茨木霉能夠毒殺南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲，并且過表達堿性絲氨酸蛋白酶prb1基因的哈茨木霉轉(zhuǎn)化菌株對南方根結(jié)線蟲的毒殺作用顯著增強[18]。另外，Suarez等[19]從哈茨木霉CECT2413菌株中發(fā)現(xiàn)1種蛋白酶PRA1，其功能與胰蛋白酶類似，該發(fā)酵蛋白粗提液顯著降低了線蟲卵的孵化率。Stleger等[20]研究表明，微生物胞外蛋白酶是大部分蟲生真菌侵染初期產(chǎn)生的唯一胞外酶，而幾丁質(zhì)酶則是侵染后期產(chǎn)生的最主要胞外酶。Chen等[21]從擬康寧木霉T.pseudokoningiiSMF2中分離到1種線蟲體壁降解酶-絲氨酸蛋白酶（Cuticle-degrading serine protease）SprT，該酶對根結(jié)線蟲卵的孵化率表現(xiàn)為顯著降低，并且對線蟲2齡幼蟲表現(xiàn)出較強的毒殺作用。另外，天冬氨酸蛋白酶在木霉菌重寄生和植物共生作用中也發(fā)揮著重要作用[22]。Szabó等[23]通過測定哈茨木霉與線蟲卵互作中的 13個肽酶編碼基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)酸性絲氨酸蛋白酶pra1、天冬氨酸蛋白酶p6281和p9438、金屬內(nèi)肽酶p7455和絲氨酸蛋白酶p5216均高表達，這預(yù)示著哈茨木霉蛋白酶基因pra1、p6281、p9438、p7455和p5216可能在與卵互作過程中發(fā)揮著關(guān)鍵殺線作用。

1.2 木霉菌毒殺作用

毒殺作用是木霉防治線蟲的另一種重要的直接生防機制，在木霉菌生長過程中，產(chǎn)生多種具有毒殺活性的次級代謝產(chǎn)物，這些毒殺性的代謝產(chǎn)物能夠殺死線蟲[24]，達到防治植物病原線蟲病的目的。目前已報道的具有殺線活性的木霉菌主要有長枝木霉、綠色木霉、哈茨木霉、鉤狀木霉T.hamatum、深綠木霉T.atroviride及康寧木霉[24-31]。Zhang等[32]采用響應(yīng)面法來優(yōu)化長枝木霉T6的殺線發(fā)酵液的條件，結(jié)果表明，T6培養(yǎng)濾液在初始pH為6.06、接種量為1.62 mL、培養(yǎng)時間為7.15 d的發(fā)酵條件下殺線蟲活性最高，達92.42%，溫室試驗中T6培養(yǎng)濾液在小麥播種后70 d的生防效果為83.88%。Yang等[33]對所分離的329株木霉菌株進行了毒殺全齒復(fù)合線蟲測定，結(jié)果表明其中 15株木霉菌對全齒復(fù)合線蟲具有較強的毒殺活性。目前已發(fā)現(xiàn)木霉所產(chǎn)生的毒殺物質(zhì)分為兩類，一類是小分子和易揮發(fā)性物質(zhì)，包括芳香族化合物、聚酮化合物、丁烯酸內(nèi)酯類及萜烯類等[34,35]；另一類是大分子代謝產(chǎn)物，包括肽 Peptailbols、酶類等[36]。已有報道表明目前從木霉菌中分離的殺線物質(zhì)主要有木霉菌素[32]、乙酸[24]、膠酶毒素[37]和肽環(huán)孢菌素 A[38]等成分；同時，梁志懷等[39]利用GC-MS檢測和分析了木霉菌TUV-13菌株殺線活性成分，共獲得40多種化學成分，其中主要以烷烴類成分的種類最多，另外還包含有機酸類、酯類、酮類和類固醇類等有機化合物。

綜上，木霉菌發(fā)揮生物防治的功能主要為重寄生作用和毒殺作用，其主要機制為木霉菌在生長過程中分泌的胞外酶和次級代謝產(chǎn)物來協(xié)同發(fā)揮生物防治的功能[40,41]。

2 木霉菌防治線蟲的間接作用機制

早期對木霉生防機制的研究主要集中在木霉與寄生線蟲之間的直接作用，而對于木霉與寄主植物相互作用增強植物抗病性的研究較少。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)木霉菌可以通過誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)與植物建立共生關(guān)系，增強植物對線蟲病的抗性，該機制稱為木霉誘導(dǎo)的植物系統(tǒng)抗性[42-44]；另外，木霉菌與植物相互作用、相互共存和互利共生，木霉菌能夠加速植物吸收土壤中的養(yǎng)分，從而促進植物生長，增強植物抵抗逆境脅迫的能力，這便是木霉菌防治線蟲病的間接作用機制。

2.1 木霉菌誘導(dǎo)植物增強抗病性

Harman等[45]發(fā)現(xiàn)木霉是一種機會性的內(nèi)生真菌，可定殖于土壤中的植物根部，誘導(dǎo)植物抗病反應(yīng)。木霉菌定殖于植物根系后，水楊酸（Sacyclic acid，SA）和茉莉酸（Jasmonic acid，JA）通路均發(fā)揮著重要的防御作用[46]。Martínez-Medina等[47]發(fā)現(xiàn)當哈茨木霉T-78菌株定殖于番茄植株根際后，可通過誘導(dǎo)番茄植株SA和JA來增強對根結(jié)線蟲的抗性。另外，木霉也能夠誘導(dǎo)植物活性氧信號來增強對線蟲的抗性，如深綠木霉誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生活性氧可能是番茄生長過程中的防御根結(jié)線蟲的主要機制[48]。木霉在植物根部定殖，可增加植物體內(nèi)與防御相關(guān)酶和化合物的合成或積累，如過氧化物酶（Peroxidase，POD）、苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等，從而誘導(dǎo)植物對線蟲的防御反應(yīng)[49]。Zhang等[2]研究發(fā)現(xiàn)小麥接種長枝木霉T6菌株和禾谷孢囊線蟲卵后，小麥抗病相關(guān)酶（幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶）活性增加，這可能是T6抗小麥孢囊線蟲病的主要機制。Gupta等[50]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉可作為生物接種劑對洋甘菊總酚和黃酮含量具有顯著的誘導(dǎo)，進而抵抗對根結(jié)線蟲的侵染。木霉在定殖植物過程中能刺激植物產(chǎn)生胞壁沉積物，可不同程度地阻止線蟲侵入[51]?？傊?，木霉制劑施用到植物根際土壤后定殖于植物根部，通過SA、JA通路和活性氧信號來誘導(dǎo)植物增強抗線蟲病的能力，同時，其還可通過增強植物根部的細胞壁來抵御線蟲。

2.2 促生作用

研究表明，木霉菌對辣椒、馬鈴薯、番茄、黃瓜、白菜、香蕉、草莓和小麥等多種作物具有促生作用[52,53]，如哈茨木霉菌株T-22能顯著促進玉米、大豆、長春花等植物生長[52]；擬康寧木霉菌株Th003能顯著提高番茄種子的萌發(fā)率[54]；棘孢木霉T.asperellumDQ-1分生孢子粉能顯著促進黃瓜、辣椒、番茄等幼苗生長[55]；桔綠木霉T.citrinoviride不僅能有效防治根結(jié)線蟲，還能顯著增加番茄植株的生物量[56]；長枝木霉T6能顯著促進小麥種子萌發(fā)和幼苗生長，增加幼苗地上部分和根的重量[57]。朱佳芯等[58]從海南土壤中篩選出4株耐熱木霉菌株，其中桔綠木霉不僅能改善土壤養(yǎng)分，而且對熱區(qū)香蕉增產(chǎn)有顯著的影響；趙玳琳等[59]研究表明棘孢木霉 GYSW-6m1能顯著提高草莓的株高、根長、植株總鮮重和植株總干重。近年來，眾多學者關(guān)于對木霉菌的促生機制方面開展了相關(guān)研究，有學者研究發(fā)現(xiàn)，木霉對植物的促生機制具有多元性的特點，木霉制劑施入土壤后產(chǎn)生有機酸，這種有機酸會促使土壤中難溶的植物必需的微量元素進一步溶解，進而植物可通過吸收溶解的微量元素促進植物生長[45]；哈茨木霉T22既有溶解可溶性或微溶性礦物質(zhì)的能力，還能通過鰲合或降解作用來溶解土壤中金屬氧化物的能力，最終可溶解二氧化錳（MnO2）、鋅（Zn）、鐵（Fe）和硫酸鈣（CaSO4），從而促進植物根系對土壤中礦物質(zhì)的吸收，以發(fā)揮促生作用[60]。綠色木霉對擬南芥的促生作用主要表現(xiàn)為可促進生物量的增加和側(cè)根的發(fā)育[61]。Bharti等[62]研究表明哈茨木霉通過三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic Acid Cycle，TCA）以及戊糖磷酸途徑（Hexose Monophosphate Pathway，HMP）對番茄發(fā)揮促生功能。上述研究證明了木霉直接定殖植物根部后發(fā)揮的促生作用，另有研究表明，木霉菌在生長過程中能散發(fā)出揮發(fā)性的有機物質(zhì)，這些物質(zhì)同樣能夠促進植物生長，如揮發(fā)性有機物質(zhì)6-戊基-2H-吡喃-2-酮（6-pentyl-2H-pyran-2-one，6PP）可顯著促進擬南芥生長[63]。在密閉條件下，將深綠木霉與擬南芥共培養(yǎng)但不直接接觸，擬南芥的鮮重和葉綠素含量顯著增加[64]。綜上所述，木霉菌不僅能夠直接拮抗植物病原線蟲，還能定殖于植物根部，通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性和促進植物生長來間接防治植物線蟲病。

3 木霉防治線蟲病存在的問題及展望

3.1 加大對殺線木霉種類調(diào)查和挖掘

近年來，科研工作者發(fā)現(xiàn)了許多具有殺線蟲作用的木霉菌，雖在前人研究的基礎(chǔ)上開展了很多探索性的工作，但對有殺線潛力的木霉種類挖掘還不夠，這就要求科研工作者利用大自然廣泛的微生物資源，充分調(diào)查和挖掘具有殺線蟲作用的木霉種類，將更多的木霉菌資源有效地應(yīng)用于線蟲防治，以開拓我國線蟲生物防治的新領(lǐng)域。

3.2 明確殺線木霉對植物寄生線蟲的毒殺機制

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)木霉次級代謝產(chǎn)物能有效殺死線蟲，然而，已發(fā)現(xiàn)具有殺線蟲作用的木霉次級代謝產(chǎn)物種類較少。另外，關(guān)于木霉次級代謝產(chǎn)物中有效的殺線活性物質(zhì)如何殺死線蟲，其作用機理尚不明晰。因而，國內(nèi)外科研工作者有待于更深入、更系統(tǒng)地探明木霉代謝產(chǎn)物防治線蟲的機制，以期更好地發(fā)揮生防木霉的殺線作用。

3.3 揭示木霉防治線蟲的分子作用機制

木霉防治植物線蟲病的機制包括重寄生、毒殺作用及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、促進植物生長等多種機制，田間防治中木霉往往以多種機制協(xié)同發(fā)揮防效作用。因而，明確木霉防治線蟲病的機制是科學應(yīng)用木霉防治線蟲病的關(guān)鍵。近年來，眾多科研工作者已從木霉菌種、胞外酶、次級代謝物質(zhì)的分離鑒定等方面開展了木霉防治線蟲的研究，然而，在木霉胞外酶、次級代謝產(chǎn)物的種類以及調(diào)控其合成的基因、木霉誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的機制還需要更深入的研究。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，基于基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組學技術(shù)對于挖掘木霉胞外酶、次級代謝產(chǎn)物的種類以及調(diào)控其合成的基因、以及開展木霉誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性機制的研究工作，可為木霉的田間應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。