基于2,4-二硝基氟苯標記氨基酸的高效液相色譜法測定脂肽含量

邵穿石， 楊世忠， 郎劍橋， 楊佳穎， 牟伯中*

(生物反應器工程國家重點實驗室及應用化學研究所，華東理工大學，上海 200237)

脂肽是一類重要的生物表面活性劑，如表面活性素、地衣素、伊枯草菌素、豐原素等，通常由微生物產(chǎn)生[1]。據(jù)報道，脂肽主要是環(huán)狀脂肽，根據(jù)脂肪酸與肽間的關系可以分為3類[2]，有約90種不同的脂肽[3]。某些脂肽具有抗癌、抑菌、抗凝血作用[4 - 6]，促進烴降解[7]及可與金屬離子螯合作用[8]。由于脂肽的兩親結構及其表現(xiàn)出的很強表面活性和生物活性，脂肽在許多方面有潛在的用途，如食品、化妝品、藥物、環(huán)保及采油等領域。

脂肽和許多有活性物質(zhì)一樣，對產(chǎn)生菌及應用的研究和評價離不開定量測定，對脂肽的測定方法較方便的是直接高效液相色譜(HPLC)法[9]，樣品經(jīng)簡單處理，直接進樣測定。根據(jù)大部分脂肽中氨基酸與茚三酮在特定條件下反應產(chǎn)生的可見吸收，其摩爾吸收系數(shù)相近的特性[10]，用光度法也可以測定脂肽[11]。為了測定脂肽中的不同變體，可將脂肽水解后用氣相色譜-質(zhì)譜(GC)法測定[12]。該方法不僅能對脂肽進行定量，還可以定量脂肽中脂肪酸碳數(shù)不同的異構體，但反應需要無水狀態(tài)。本文將提取的一種脂肽(表面活性素)先水解成其組成的氨基酸，然后以2,4-二硝基氟苯標記產(chǎn)生的氨基酸后，采用HPLC法測定標記的目標氨基酸。根據(jù)脂肽中氨基酸與標記產(chǎn)物色譜峰面積的線性關系，建立了一種測定脂肽含量的新方法。

1 實驗部分

1.1 主要試劑及儀器

亮氨酸、纈氨酸、天門冬氨酸(分析純，上海捷倍思基因技術有限公司)，谷氨酸(生化試劑，上?；瘜W試劑公司)，2，4-二硝基氟苯(FDNB)(生化試劑，上海金山興塔化工廠)，NaOH、HCl、三乙胺、乙腈(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)，實驗用水為純水。

質(zhì)譜儀(Micromass LCT,Manchester,UK)；高效液相色譜儀(LC100 plus,上海伍豐科學儀器有限公司，上海)。

1.2 實驗方法

1.2.1脂肽的提取取500 mL脂肽發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH>9， 5 000 r/min離心除菌，取上清液，滴加HCl酸化，使pH ≤ 2.0，室溫下靜置24 h， 5 000 r/min下離心30 min，收集沉淀，在4 ℃下冷凍干燥24 h，得到淡黃色塊狀固體，用40 mL乙酸乙酯浸提3次，用20 mL水洗滌3次，濃縮并用乙酸乙酯定容至20.0 mL。

1.2.2脂肽的定性取10 mL脂肽發(fā)酵液，2 000 r/min離心除菌，在上清液中滴加HCl酸化，使pH≤2.0，用2.0 mL、1.0 mL及1.0 mL乙醚萃取3次。合并乙醚后，用2.0 mL水洗滌3次，吹除乙醚。加入1.0 mL甲醇溶解殘留物，用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)分析，測定分子量，確定脂肽類型。質(zhì)譜采用正離子模式，噴射電壓為4.8 kV；毛細管電壓設置為15 V，以N2為鞘氣，流速為50 μL/min；輔助器流速設置為20 μL/min；以He為碰撞氣；測定質(zhì)譜，分析常見脂肽m/z850～1 250 Da范圍的質(zhì)譜圖。

1.2.3脂肽水解取一定量的脂肽有機溶液于2.00 mL刻度凍存管中，吹除有機溶劑后，加入1.00 mL 6.0 mol/L NaOH溶液，密封，90 ℃溫度下水解24 h[13]，或在除去有機溶劑后的脂肽樣品中加入標準氨基酸溶液，干燥后，同樣用NaOH水溶液水解。水解后的溶液，加入0.50 mL濃HCl，隨后用1.0 mol/L稀HCl和稀NaOH溶液調(diào)節(jié)到中性(用點樣毛細管取樣檢測)，用水定容到2.00 mL備用，其中的NaCl濃度為3.0 mol/L。

1.2.4標記反應在試管中加入含3.00 mol/L NaCl的標準氨基酸(2.00 mmol/L Asp、Glu、Val及8.00 mmol/L，相當于2.00 mmol/L脂肽表面活性素中的氨基酸)溶液，補加3.00 mol/L NaCl溶液至0.800 mL，分別加入0.200 mL的三乙胺及1.000 mL 1.0% FDNB-乙腈溶液，充分混勻后，置于75 ℃水浴中加熱，反應30 min，冷卻，用0.22 μm有機微孔濾膜過濾，濾液用HPLC法測定。

1.2.5液相色譜測定用HPLC儀配備Arcus自動進樣器測定，梯度洗脫：0～2 min，2%乙腈水溶液；22 min，25%乙腈水溶液。紫外360 nm波長檢測，進樣10.0 μL。

2 結果討論

脂肽水解后疏水部分產(chǎn)生羥基脂肪酸或氨基脂肪酸，親水部分產(chǎn)生氨基酸。氨基酸酸中通常有一分子谷氨酸/酰胺和天門冬氨酸/酰胺，有多個亮氨酸(Leu)，如表面活性素，一分子脂肽中有谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)、纈氨酸(Val)各一分子，有四分子的Leu酸[10,14]。如果脂肽以Leu的形式測定，靈敏度較以其它氨基酸形式測定的靈敏度要高。擬以測定Leu的方式測定脂肽的含量。

氨基酸的測定在化學及生物化學的研究中有重要意義，具體有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細管電泳法(CE)等。氨基酸本身不易檢測，需要用熒光標記試劑或紫外標記試劑標記后檢測。硝基氟苯標記氨基酸的產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，本文選用硝基氟苯標記氨基酸[15]，用HPLC法分離測定Leu的方法來定量脂肽。

2.1 脂肽的類型

圖1 脂肽樣品的質(zhì)譜圖Fig.1 The mass spectrum of lipopeptide in sample

圖2 脂肽surfactin的結構示意圖Fig.2 The primary structure of lipopeptide surfactin

用電噴霧質(zhì)譜測定了脂肽正離子化的質(zhì)荷比，結果見圖1。從正離子化質(zhì)譜圖中可見m/z1 008.8、1 022.8、1 036.8 及1 050.7(1 044.8與1 058.8之間)的離子，它們彼此相差14(CH2)的質(zhì)量，可以認為是同系物。與此相似，m/z1 030.8(1022.8與1 036.8之間)、1 044.8、1 058.8 及1 072.8，也相差14，也為同系物。這兩組同系物的質(zhì)荷比之間相差22。因脂肽的肽部分是強極性的、有電負性大的基團，可以結合H+、Na+等離子后，形成帶正電的[M+1]、[M+23]分子離子，它們的質(zhì)荷比相差22。顯然，上述兩組質(zhì)荷比為一同系物的H+離子化和Na+離子化產(chǎn)生的。故其分子量為m/z-1或m/z-23，從而得到分析的脂肽的分子量分別為1 007.8、1 021.8、1 035.8和1 049.8。根據(jù)脂肽的結構[2]指紋圖譜[3]，這些分子與一種重要的脂肽表面活性素的分子量一致，確定該脂肽為表面活性素系列化合物[16]。它們的Leu相同，含有1個Asp、Glu和Val殘基及4個Leu殘基，水解后產(chǎn)生相應的氨基酸，其結構示意圖如圖2。脂肽中的羥基脂肪可有C12、C13、C14、C15和C16，其中以C13、C14和C15為主。根據(jù)其脂肪酸的比例代表脂肽的比例[12]和相應的分子量，可以計算出脂肽的平均分子量約為1 028 Da。

2.2 色譜上氨基酸的識別

圖3 樣品標記產(chǎn)物的色譜圖Fig.3 Chromatogram of labeled derivetives

含氨基酸Val和Leu的樣品、脂肽水解后的樣品及脂肽中加入氨基酸Val和Leu水解后的樣品，經(jīng)標記反應，冷卻、過濾，HPLC法測定的結果如圖3所示。用單一氨基酸標記測定，確定保留時間17.82～18.07 min是標記的Val，保留時間21.10～21.27 min是標記的Leu，Glu及Asp兩種氨基酸標記產(chǎn)物在采用的色譜條件下與標記試劑不能分離。氨基酸樣品除標記試劑的色譜峰(5～13 min，未畫出)外，在保留時間17.82～18.07 min和21.10～21.27 min有兩個色譜峰，且面積之比約為1∶4，與配制的比例一致；脂肽經(jīng)水解釋放出其中的氨基酸，標記后的產(chǎn)物在相應保留時間處也出現(xiàn)色譜峰，峰面積的比例也約為1∶4；脂肽加入氨基酸后水解、標記，測定結果也顯示，保留時間不變，與脂肽相比峰面積增加，面積比仍然為1∶4。

2.3 氨基酸量與標記產(chǎn)物峰面積的定量關系

按脂肽中氨基酸的組成，配制含3.00 mol/L NaCl的14.0 mmol/L混合氨基酸溶液，其中L-Leu∶L-Val∶L-Asp∶L-Glu的摩爾比為4∶1∶1∶1[17 - 19]，這些氨基酸及其比例與廣泛存在的重要的脂肽表面活性素相同。取氨基酸溶液0～0.400 mL補加3.00 mol/L NaCl水溶液至0.800 mL，加入0.200 mL三乙胺及1.00 mL標記試劑，混合后于75 ℃水浴中反應30 min。冷卻，過濾后用HPLC法記錄色譜圖，積分Leu標記物的峰面積，其量與積分面積關系見圖4A?？紤]到堿性水解脂肽，在中和、定容后的鹽濃度(3.0 mol/L)及最大取樣量(0.800 mL)，控制反應體系中NaCl為2.40 mmol。反應后分層，下層為含鹽水相，上層為有機相，標記產(chǎn)物主要在有機相。

如要進行均相標記反應，NaCl不能超過0.40 mmol。在含0.40 mmol NaCl介質(zhì)中反應后，HPLC法測定結果見圖4B。

圖4 亮氨酸的量與標記產(chǎn)物積分面積的關系 Fig.4 The Relationship between Leu amount and integration area of labeled derivatives A:with 2.40 mmol NaCl;B:with 0.40 mmol NaCl.

從回歸方程的線性相關系數(shù)看出，氨基酸的量與標記產(chǎn)物的積分面積有很好的線性關系，可以用于Leu的分析測定。因表面活性素中以Leu的比例最高，故以Leu來測定脂肽時靈敏度最高。高鹽濃度體系的回歸方程斜率大，靈敏度更高，而低鹽濃度的線性相關系數(shù)大，線性關系更好。為了測定低濃度的樣品，采用高鹽濃度的反應體系。

2.4 氨基酸的檢出限

測定6次無氨基酸的空白樣品，在Leu標記物平均保留時間21.18 min前后0.50 min內(nèi)獲得積分面積作為測定的空白值(0.005、0.090、0.061、0.007、0.002、0.000)，分別計算平均值0.0275和標準偏差0.038，以3倍標準差作為檢出限，將積分面積0.143代入回歸方程計算得到檢出限是0.0162 μmol亮氨酸(2.12 μg)，相當于脂肽0.00405 μmol脂肽(4.16 μg)。標記反應時最多取0.800 mL水解后的中性溶液，故最低檢測濃度是5.2 mg/L的脂肽溶液。

2.5 樣品的脂肽含量

吸取0.500 mL脂肽提取液干燥、水解，同時吸取0.500 mL脂肽提取液加入0.500 mL標準氨基酸溶液(8.0 mmol/L Leu，相當于2.00 mmol/L脂肽)干燥、水解。經(jīng)中和，定容至2.00 mL，取0.400 mL，加入3.00 mol/L NaCl溶液至0.800 mL，經(jīng)過標記反應、冷卻、過濾、HPLC法測定。5次測定結果如表1所示。測定結果的重復性較好，相對標準偏差(RSD)<8%，回收率達92.6%。

根據(jù)每分子脂肽中含有7分子的氨基酸，其中4分子的亮氨酸，以及脂肽的平均分子量是1 028 Da，利用氨基酸的線性回歸方程，可以計算出脂肽提取液的脂肽量(0.253/4=0.0632 μmol)及濃度(0.0632/(0.500×0.400/2)=0.632 mmol/L=0.650 g/L)。

表1 脂肽樣品測定結果(n=5)

脂肽是一大類生物表面活性劑，結構上自然具有其多樣性，本方法是基于脂肽水解后產(chǎn)生亮氨酸，凡是水解后能產(chǎn)生亮氨酸的脂肽均可用此方法測定。因異亮氨酸與亮氨酸性質(zhì)非常相近， HPLC法也難將其分開。故含有異亮氨酸的脂肽也能用該方法測定。為了消除其它含有氨基酸的肽類及蛋白質(zhì)的干擾，可以通過洗滌的辦法加以除去[11]。但也有個別脂肽不含亮氨酸及異亮氨酸，這類脂肽不能用該方法進行測定。

不含亮氨酸及異亮氨酸的脂肽是：β-羥基脂肪酸成環(huán)環(huán)狀脂肽穩(wěn)桿菌肽(Empedopeptin)(8肽)、β-氨基脂肪酸成環(huán)環(huán)狀脂肽伊枯草菌素(Irurins)類，α-氨基脂肪酸成環(huán)環(huán)狀脂肽Trapoxins；脂肪酸接環(huán)的環(huán)狀脂肽括棘白菌素類(Echinocandins)(6肽環(huán))，環(huán)狀芽抱菌素(Circulocinα,β)；脂肪酸離環(huán)的環(huán)狀脂肽庫爾斯塔克素(Kurstakins)(4環(huán)肽/7肽)，A21978(10環(huán)肽/13肽)/達托霉素(Daptomycin)；線性脂肽螺旋形素(Spiroidesin)及線形脂肽TAN1511 A,B。

其它含有亮氨酸及異亮氨酸的脂肽占了大部分，它們是：β-羥基脂肪酸成環(huán)環(huán)狀脂肽，球園菌素(Globomycin)(5肽)，短小酸素(Pumilacidins)(7肽)，表面活性素(Surfactins)(7肽)，地衣素(Lichenysins)(7肽)，抗吸附素(Antiadhensin)(7肽)，環(huán)狀縮酚肽(Cyclodepsipeptide A)(7肽)，鹽桿菌素/異鹽桿菌素(Halobacillin/Isohalobacillin)(7肽)，節(jié)活性素(Arthrofactin)(10肽)；脂肪酸接環(huán)環(huán)狀脂肽的環(huán)狀芽抱菌素(Circulocinγ，δ)；脂肪酸離環(huán)環(huán)狀脂肽的豐原素(Fengycin)/制磷脂菌素(Plipastatins)(8環(huán)肽/10肽)，惡臭溶菌素(Putisolvins)(4環(huán)肽/12肽)，A54145(10環(huán)肽/13肽)的部分，雷莫拉寧(Ramoplanin)(16環(huán)肽/17肽)，多粘菌素 B(Polymixin)(7環(huán)肽/9肽)；線形脂肽TAN1511 C[2]。這類脂肽可以用本方法測定。

3 結論

脂肽中的氨基酸經(jīng)2,4-二硝基氟苯標記，采用HPLC法分離，含量最多的亮氨酸標記物與其它氨基酸的標記物能夠很好分離，且氨基酸的量與對應目標物的積分面積有很好的線性關系，據(jù)此可以對氨基酸進行定量測定。大部分脂肽水解后能夠釋放出相應的氨基酸，故該方法也可以用于這類脂肽的定量測定。