Bacillus amyloliquefaciens C-1 胞外抑菌脂肽的分離與鑒定

呂 佳，徐興科，胡森科，張瑞娟，韓 蓓*

1 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院;2 陜西省營養(yǎng)與食品安全工程研究中心，西安 710061

食源性致病菌是導(dǎo)致微生物性食物中毒的一類病原菌，對食源性致病菌的控制是食品工業(yè)防腐方向的一個重點，針對食源性致病菌的高效生物防腐劑研究成為了當前的熱點之一。芽孢桿菌可以產(chǎn)生許多種抗菌物質(zhì)，包括肽類、細菌素、脂肽類等，其中肽類和脂肽類具有較高的生物工程利用價值［1-3］。Sutyak 等從酸奶廠的益生菌乳制品中分離出一株解淀粉芽孢桿菌，其培養(yǎng)物上清對李斯特菌、陰道加德納菌和無乳鏈球菌有抑制效果，其有效抑菌物質(zhì)為細菌素［4］。Romano 等從解淀粉芽孢桿菌BO5A 中分離出2 種環(huán)狀脂肽，其對真菌Fusarium xoysporum、Aspergillus niger、Botrytis cinerea、Penicillium italicum、Trichoderma harzianum 等具有顯著的抑制作用［5］。脂肽類物質(zhì)是枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的主要抗菌物質(zhì)之一，但是研究解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生脂肽類抑菌物質(zhì)的報道不多。

本實驗室從即食水果果盤上分離出一株解淀粉芽孢桿菌，命名為C-1，其在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生大量的胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)，該菌現(xiàn)保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(編號M2012177)。C-1 的胞外多糖具有高的抗氧化活性，同時具有抑制人腫瘤細胞生長并誘導(dǎo)其凋亡的活性［6］。同時B.amyloliquefaciens C-1 的發(fā)酵液上清具有顯著的抑菌活性，但是該抑菌活性與胞外多糖無關(guān)［7］。

基于此，本實驗初步推測其胞外抑菌物質(zhì)可能為蛋白類或多肽類物質(zhì)。為了進一步分析與鑒定B.amyloliquefaciens C-1 發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)，本研究從C-1 上清中分離出了粗脂肽，并對其是否具有抑菌活性、對不同測試菌的抑菌活性、抑菌活性的穩(wěn)定性分別進行了研究，結(jié)果顯示B.amyloliquefaciens C-1 胞外抑菌活性物質(zhì)為脂肽，且其抑菌活性非常穩(wěn)定，具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

本實驗以Bacillus amyloliquefaciens C-1(本實驗室自行分離保藏)為生產(chǎn)菌株。蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus MS10362R，產(chǎn)黑色素)為中國科學(xué)院武漢病毒研究所袁志明研究員惠贈;大腸桿菌O157∶H7 CDC157 來源于西安市疾控中心;蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus CMCC63301)購自于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心，這3 株細菌為抑菌試驗的測試菌株。

液體培養(yǎng)基采用LB 培養(yǎng)基，配方為:蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母粉5 g/L;固體平板采用LB固體培養(yǎng)基，配方為:蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母粉5 g/L，瓊脂1.5%。B.amyloliquefaciens C-1發(fā)酵培養(yǎng)基，配方為:蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖1%。

1.2 試劑

冰乙酸、考馬斯亮藍G250、Tris-HCl、TEMED、甲醇、乙腈、丙酮、10%胰蛋白酶(使用濃度為0.1%)、4%胃蛋白酶(使用濃度為0.1%)、2%蛋白酶K(使用濃度為0.1%)、0.5 mol/L NaOH、0.5 mol/L HCl、30 mg/mL 卡那霉素(使用濃度為30 μg/mL)，14 mg/mL 四環(huán)素(使用濃度為14 μg/mL)。所用試劑均為分析純。

1.3 B.amyloliquefaciens C-1 胞外脂肽類活性物質(zhì)的提取與定性檢測

接種環(huán)取C-1 單菌落至3 mL LB 液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 rpm 恒溫搖床中培養(yǎng)過夜;次日按1%量轉(zhuǎn)接至50 mL LB 培養(yǎng)基中，30 ℃、200 rpm 恒溫搖床中培養(yǎng)5 h，按1%量轉(zhuǎn)接至多份150 mL LB 培養(yǎng)基中，30 ℃、200 rpm 恒溫箱中培養(yǎng)96 h。4 ℃，10000 rpm 離心取上清液。上清液用6 M 鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2.0，混勻后4 ℃靜置24 h，4 ℃10000 rpm離心收集沉淀，冷凍干燥后為粗提活性物質(zhì)［8］。

利用三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(ABI，API3200 LC-20A)對C-1 菌株發(fā)酵液上清粗提活性物質(zhì)進行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的定性檢測，初步確定提取物的主要成分。

1.4 B.amyloliquefaciens C-1 胞外脂肽的抑菌活性

1.4.1 平板法抑菌試驗

以革蘭氏陽性細菌蠟樣芽孢桿菌B.cereus CMCC63301、產(chǎn)黑色素臘樣芽孢桿菌 B.cereus MS10362R 和大腸桿菌E.coli O157∶H7 CDC157 作為測試菌，在直徑約15 cm 平板傾倒固體培養(yǎng)基厚約6 mm，冷卻后均勻打孔5 個，孔徑6 mm，其中包含陽性對照孔一個(敏感抗生素，大腸桿菌使用30 μg/mL 卡那霉素，蠟狀芽孢桿菌使用14 μg/mL 四環(huán)素)，陰性對照孔一個(等體積的LB 液體培養(yǎng)基)，實驗組孔3 個，分別加入10 mg/mL C-1 脂肽溶液200 μL、分離脂肽前的發(fā)酵液上清200 μL、分離脂肽后的發(fā)酵液上清200 μL(表1 中為“去脂肽上清”，為酸沉淀脂肽后的上清，pH 與發(fā)酵液上清調(diào)節(jié)為一致)，抑菌活性以抑菌圈直徑表示。

1.4.2 生長曲線法抑菌試驗

B.cereus CMCC63301、B.cereus MS10362R 和E.coli O157∶H7 CDC157 作為測試菌，過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)液用LB 液體培養(yǎng)基稀釋至1%，取2 mL 分別置入24 孔板中，每孔加入20 μL 10 mg/mL 脂肽溶液，混勻，加入20 μL 無菌水的孔作為陰性對照。酶標儀測定初始的OD600。將24 孔板分別置于30 ℃(蠟樣芽孢桿菌)、37 ℃(大腸桿菌)培養(yǎng)6 h，每小時測定一次OD600，觀察脂肽對病原菌生長的抑制作用，并繪制抑制曲線，計算加入脂肽后培養(yǎng)6 h 的抑制率。

抑制率=1-(B2-B0)/(A2-A0)×100%

式中，A 為陰性對照組OD600，A0 為0 h 數(shù)據(jù)，A2 為6 h 數(shù)據(jù);B 為添加脂肽的處理組OD600，B0 為0 h 數(shù)據(jù)，B2 為6 h 數(shù)據(jù)。

1.5 B.amyloliquefaciens C-1 胞外脂肽的穩(wěn)定性

10 mg/mL 脂肽溶液分別置于50、80、120 ℃下處理30 min，處理后放于室溫，對處理后的脂肽溶液進行1.4.2 的抑菌活性測定實驗，以B.cereus CMCC63301、B.cereus MS10362R 和E.coli O157∶H7 CDC157 作為測試菌，以未處理的脂肽為陽性對照。繪制抑制曲線，并計算培養(yǎng)6 h 后的抑制率。

10 mg/mL 脂肽溶液分別用0.1% 胰蛋白酶、0.1%胃蛋白酶、0.1%蛋白酶K 處理，37 ℃孵育1 h，對經(jīng)過不同蛋白酶處理后的脂肽溶液進行1.4.2的抑菌活性測定實驗，以B.cereus CMCC63301、B.cereus MS10362R 和E.coli O157∶H7 CDC157 作為測試菌，以未處理的脂肽為陽性對照。繪制抑制曲線，并計算培養(yǎng)6 h 后的抑制率。

分別用甲醇、乙腈、丙酮溶解脂肽，配成10 mg/mL 脂肽溶液，對處理后的脂肽溶液進行1.4.2 的抑菌活性測定實驗，以B.cereus CMCC63301、B.cereus MS10362R 和E.coli O157∶H7 CDC157 作為測試菌，以未處理的脂肽為陽性對照，計算培養(yǎng)6 h 后的抑制率。

2 實驗結(jié)果

2.1 B.amyloliquefaciens C-1 胞外脂肽類活性物質(zhì)的提取與定性檢測

C-1 菌株在LB+1%葡萄糖液體培養(yǎng)基中30℃震蕩培養(yǎng)60 h，培養(yǎng)液離心取上清，用HCl、NaOH分別調(diào)節(jié)C-1 上清至pH=2、4、6、8、10。在調(diào)節(jié)pH時，當溶液的pH 達到3 左右，開始出現(xiàn)沉淀，溶液變得渾濁，繼續(xù)調(diào)節(jié)pH 至2，沉淀完全，溶液變的較為澄清。放置于4 ℃冰箱中24 h。10000 rpm，4 ℃離心獲得胞外活性物質(zhì)沉淀和去沉淀的上清液，胞外活性物質(zhì)沉淀經(jīng)過凍干獲得干粉，產(chǎn)量為1.2 g/L。

將菌株C-1 發(fā)酵液上清的粗提物進行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，經(jīng)過質(zhì)譜結(jié)果確定HPLC 分析得到的主要物質(zhì)峰屬于伊枯草菌素同系物，為分子量相差14 Da(CH2)的代謝同系物。胞外脂肽類粗提物的質(zhì)譜圖結(jié)果顯示其實測值分別為1045.5、1065.3、1067.1、1080.6 Da，分別與脂肽類抗生素C14-C17 Iturin A 的分子量的理論預(yù)測值1042.54、1056.55、1070.57、1084.61Da 相吻合［10-14］。其中以分子量為1065.3 Da 的伊枯草菌素代謝同系物的含量最高。從質(zhì)譜圖上可以初步確定該提取物為脂肽類伊枯草菌素同系物。

2.2 解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens C-1 脂肽的抑菌作用

2.2.1 C-1 脂肽的平板抑菌試驗

根據(jù)1.4.1 的設(shè)計進行平板抑菌試驗，用牛津杯法分別定性B.amyloliquefaciens C-1 發(fā)酵上清液、重溶的粗脂肽和分離脂肽后的發(fā)酵液上清液對蠟樣芽孢桿菌MS10362R、蠟樣芽孢桿菌CMCC63301 和大腸桿菌O157∶H7 的抑菌活性。得到如表1 的抑菌結(jié)果。陽性對照為敏感抗生素，陰性對照為空白培養(yǎng)基，脂肽濃度為10 mg/mL，加樣量均為200 μL。

表1 C-1 上清液的平板抑菌試驗結(jié)果(n=3)Table 1 Results of antibacterial activity of C-1 supernatant(n=3)

圖1 在C-1 脂肽抑制作用下的B.cereus CMCC63301(A)、B.cereus MS10362R(B)、E.coliO157∶H7 CDC157(C)生長曲線圖Fig.1 Growth curves of B.cereus CMCC63301(A)，B.cereus MS10362R(B)and E.coli O157∶H7 CDC157(C)treated by C-1 lipopeptide

由該表數(shù)據(jù)得知，C-1 發(fā)酵上清液具有一定的抑菌活性，當將脂肽類物質(zhì)分離后，余下的上清不具有抑菌效果，而抑菌效果集中體現(xiàn)在分離出的的活性脂肽類物質(zhì)中。

2.2.2 測試菌在C-1 脂肽作用下的生長曲線

以B.cereus CMCC63301、產(chǎn) 黑 色 素B.cereus MS10362R、E.coli O157∶H7 CDC157 作為測試菌，進行生長曲線試驗。在24 孔板中加入培養(yǎng)基2 mL 并接種，根據(jù)平板抑菌實驗結(jié)果，加入10 mg/mL 脂肽溶液20 μL，使用酶標儀測定6 h 內(nèi)脂肽作用下的細菌生長曲線，結(jié)果如圖1。

圖1 中對照組和脂肽處理組生長曲線有非常顯著的差異，表明B.amyloliquefaciens C-1 脂肽溶液對于測試細菌的生長具有抑制作用。其中C-1 脂肽對B.cereus MS10362R 和E.coli O157∶H7 CDC157 的抑制作用特別明顯，從開始接種到6 h 測定結(jié)束，這兩株菌的生長抑制率分別穩(wěn)定的保持在96%、93%，并且脂肽可以抑制B.cereus MS10362R 產(chǎn)黑色素。脂肽對B.cereus CMCC63301 的6h 生長抑制率為75%。

圖2 C-1 脂肽在不同溫度處理下對B.cereus CMCC63301(A)、B.cereus MS10362R(B)及E.coliO157∶H7 CDC157(C)的抑制活性Fig.2 Inhibition effect of C-1 lipopeptide with different treatment temperatures on the growth curve of B.cereus CMCC63301(A)，B.cereus MS10362R(B)and E.coli O157∶H7 CDC157(C)

2.3 解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens C-1 脂肽的穩(wěn)定性

2.3.1 溫度處理對C-1 脂肽抑菌活性的影響

為了驗證C-1 抑菌脂肽對溫度的敏感性，對其分別進行了50、80、120 ℃的處理，處理后的B.amyloliquefaciens C-1 脂肽溶液對受試菌進行抑菌活性試驗，分析數(shù)據(jù)繪制折線圖并計算其抑菌率，如圖2、表2 所示。C-1 脂肽的抑菌活性并未受到高溫的影響，其抑菌活性基本維持在處理前的94%～97%。

2.3.2 蛋白酶處理對C-1 脂肽抑菌活性的影響

用4%胃蛋白酶、10%胰蛋白酶和2%蛋白酶K(使用濃度為0.1%)于37 ℃處理C-1 脂肽溶液1 h后，進行抑菌活性試驗，計算抑菌率。分析數(shù)據(jù)說明經(jīng)蛋白酶處理過C-1 脂肽仍然具有抑菌活性，抑菌活性幾乎不受影響，保持在原有活性的90%以上。結(jié)果見圖3、表2。

圖3 C-1 脂肽在不同蛋白酶處理下對B.cereus CMCC63301(A)、B.cereus MS10362R(B)及E.coliO157∶H7 CDC157(C)的抑制活性Fig.3 Inhibition effect of C-1 lipopeptide with different protease treatment on the growth curve of B.cereus CMCC63301(A)，B.cereus MS10362R(B)and E.coli O157∶H7 CDC157(C)

2.3.3 有機溶劑處理對C-1 脂肽抑菌活性的影響

分別用甲醇、乙腈、丙酮溶解脂肽，配成10 mg/mL 脂肽溶液，對處理后的脂肽溶液進行抑菌活性試驗，分別計算C-1 脂肽對3 種測試菌株培養(yǎng)6 h 后的抑菌率。分析數(shù)據(jù)說明有機溶劑對C-1 脂肽的抑菌活性幾乎沒有影響，有機溶劑處理后的脂肽仍具有抑菌活性，并且可以保持原有活性的90%以上，結(jié)果見表2。

表2 不同處理的B.amyloliquefaciens C-1 脂肽對B.cereus CMCC63301、B.cereus MS10362R、E.coli O157∶H7 CDC157 生長的抑制率Table 2 Inhibition rate of C-1 lipopeptide with different treatments on the growth of B.cereus CMCC63301，B.cereus MS10362R and E.coli O157∶H7 CDC157

3 討論與結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌分布廣泛，菌種資源豐富，代謝產(chǎn)物種類豐富，具有廣泛的細菌真菌抑菌活性，但由于分離株眾多，抑菌譜不一，發(fā)酵效率一般，某些代謝產(chǎn)物低毒性［9］(尚無致病性報道)等原因，還沒有得到廣泛的應(yīng)用，隨著代謝工程的發(fā)展，解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵效率，毒性產(chǎn)物與抑菌活性等能得到很好的調(diào)和，其在生物防治方面的應(yīng)用可行性將得到很好的提升。

本實驗室自行分離的B.amyloliquefaciens C-1菌株發(fā)酵液上清具有一定的抑菌活性，并且從發(fā)酵液上清中分離除了具有抑菌活性的粗脂肽。該脂肽對食源性致病菌有較強抑菌活性，0.1 mg/mL 的脂肽對指示菌產(chǎn)黑色素B.cereus MS10362R、B.cereus CMCC63301 和E.coli O157∶H7 CDC157 的6h 生長抑制率分別96%、75%、93%;同時該脂肽性質(zhì)穩(wěn)定，在不同溫度處理、蛋白酶處理和有機溶劑處理后均可保持較強的抑菌活性，均可保持原有活性的90%以上，抑菌活性非常穩(wěn)定，具有很好的開發(fā)應(yīng)用潛力。與已報道的脂肽相比，其不具有拮抗真菌的作用(結(jié)果未顯示)［5，10］。這可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，目前已知的脂肽類物質(zhì)有表面活性素(Surfactin)［11］、芬薺素(Fengycin)［12］、制磷脂菌素(Plipastatin)［13］、伊枯草菌素(Iturins)［14］等。目前已知表面活性素具有抑制細菌的功能，不具有抑真菌的活性。而C-1 粗提脂肽經(jīng)過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測，發(fā)現(xiàn)只有1 組較集中的物質(zhì)峰，預(yù)測分子量與伊枯草菌素較為接近。但是該脂肽為混合物，需經(jīng)過進一步純化才可確定分子組成。因此C-1 的脂肽有可能是新的具有抑制細菌活性的伊枯草菌素，也可能是和伊枯草菌素分子量差異不大的新型脂肽類抗生素。

另外，實驗所用的細菌為食源性致病菌［7］，與之前報道的解淀粉芽孢桿菌脂肽類物質(zhì)作為生物防治活性物質(zhì)不同，這提示我們C-1 脂肽可作為潛在的生物型防腐劑應(yīng)用于食品生產(chǎn)過程，延緩微生物生長，延長食品的貨架期，具有較好的應(yīng)用前景。

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