半夏瀉心湯治療糖尿病胃輕癱的作用機制

張 燕，劉換新，邢德剛，張 宏，袁懷文

1 武警廣東省總隊醫(yī)院病理科，廣州 510507;2 廣州醫(yī)學(xué)院荔灣醫(yī)院病理科，廣州 510170;3廣東藥學(xué)院生理學(xué)教研室，廣州 510006

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis syndrome，DGP)由Kassander 于1958 年首次提出這個概念，DGP 的發(fā)病率大約有30%～50%，是糖尿病(DM)一個常見而重要的并發(fā)癥［1］，它不但引起消化道癥狀導(dǎo)致營養(yǎng)不良和水電解質(zhì)紊亂，還可削弱血糖的調(diào)控，改變口服藥物

的吸收，促進糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。本課題組前期實驗研究表明半夏瀉心湯無論對在體胃腸運動還是離體胃腸運動均具有雙向性調(diào)節(jié)作用［2］。以往的臨床應(yīng)用表明，半夏瀉心湯被廣泛運用于治療消化道運動障礙性疾病，尤其是在治療胃腸功能性消化不良、糖尿病胃輕癱方面療效卓著。本實驗采用免疫組化標記c-Kit 和Cx43 以及透射電鏡觀察ICC 的超微結(jié)構(gòu)變化，觀察半夏瀉心湯對豚鼠胃平滑肌的影響，并探討ICC 和Cx43 在半夏瀉心湯治療豚鼠糖尿病胃輕癱的過程中所起的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年EWG/B 型豚鼠160 只(廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供)，體重250～300 g 之間，雌雄不限。

1.2 制備含藥血清

實驗用中藥材購自廣州市二天堂大藥房，給藥劑量依照人單位藥方水煎劑的生藥劑量比例按原著根據(jù)文獻折算(半夏瀉心湯組方由半夏55.78 g、黃芩、干姜、人參、炙甘草各46.875 g、黃連15.625 g、大棗42 g 組成，依照人單位體重生藥量求得大鼠單位體重生藥量，擴大10 倍)。于煎煮容器內(nèi)，加相當于藥材量5 倍的冷水浸泡1 h，煮沸30 min，再加3 倍量水繼續(xù)煎煮20 min，煎煮液濃縮后，制成濃縮液。按照劑量，每日分上、下午兩次給藥。第3d 全量給藥后頸總動脈取血，立即注入無菌管中，室溫靜置，待血液凝固，血清析出后，吸取上清離心，再吸取上清即為含藥血清。滅活30 min，用微孔濾膜過濾除菌，經(jīng)培養(yǎng)實驗證實無微生物污染后，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 建立糖尿病胃輕癱模型

將豚鼠隨機分為兩組，糖尿病組120 只，正常對照組40 只。糖尿病組給予2%鏈脲佐菌素溶液80 mg/kg，腹腔注射，一周后測尿糖、血糖。尿糖(+++)以上，血糖濃度≥11.1 mmol/L，確定為糖尿病模型，不符合要求者予以剔除。正常對照組給予腹腔注射等量的生理鹽水，血、尿糖正常。兩月后通過記錄色素胃排空和腸道傳輸速度，確定糖尿病胃輕癱模型成功建立。

1.4 實驗動物分組及給藥方法

從糖尿病胃輕癱模型組豚鼠中挑選出80 只，隨機分成兩組，半夏瀉心湯治療組40 只，模型組40只，另設(shè)空白對照組40 只。自糖尿病胃輕癱模型造模成功后第8 d 起治療組豚鼠每日2 次給予半夏瀉心湯藥液灌胃，每次給藥1 mL/100 g 體重，連續(xù)服藥14 d;空白對照組自由飲用水;模型組每日灌服生理鹽水2 mg/100 g 體重，連續(xù)服用14 d。實驗共重復(fù)三次。

1.5 實驗方法

實驗前動物禁食24 h，飲水不限。實驗時猛擊大鼠頭部致昏，迅速取材其全胃標本，沿胃小彎剪開胃，切成2×1.5×0.3 cm3大小的組織塊，10%福爾馬林液固定，常規(guī)組織脫水、石蠟包埋、石蠟切片、HE 染色、中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并比較對照組和實驗組用藥后胃平滑肌細胞的病理形態(tài)改變。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測胃竇組織中ICC 和Cx43 的數(shù)量和表達

采用免疫組織化學(xué)二步法測定。S-P 免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，試劑采用兔抗人c-Kit(Anti-Human CDll7)和Cx43 單克降抗休。取10%中性甲醛液固定后的胃竇組織，常規(guī)切取4 μm 厚度，脫蠟至水，經(jīng)H2O2 阻斷和抗原修復(fù)后嚴格按照試劑說明書進行操作。每批染色均設(shè)立陽性對照及陰性對照，用已知陽性組織切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為陰性對照。光學(xué)顯微鏡下計數(shù)染色陽性細胞，每張切片隨機各取6 個視野，通過HPIAS-2000 高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行計算機讀片和測量分析。

1.7 制作電鏡標本并觀察ICC 超微結(jié)構(gòu)

將大鼠胃體組織剪切成1 mm3小塊若干，置于2.5%戊二醛固定，0.1 mol/L 磷酸緩沖液(PBS)漂洗3 次，1%四氧化鋨固定1 h。再用0.1 mol/L 的磷酸緩沖液PBS 漂洗3 次，乙醇、丙酮梯度脫水。環(huán)氧樹脂(Epon)812 包埋，聚合37 ℃24 h，48 ℃24 h，60 ℃48 h。超薄切片機切片，厚約60～70 nm，200 目銅網(wǎng)撈片，酒精醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色，在日立H-600 型透射電鏡下觀察ICC 超微結(jié)構(gòu)的變化:包括ICC 細胞之間、與其他細胞之間的連接結(jié)構(gòu)、線粒體和細胞器的變化，染色質(zhì)及肌膜的改變等。每例標本觀察20 個以上銅網(wǎng)，并隨機攝片。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 實驗結(jié)果

2.1 一般情況

造模兩月后，糖尿病組大鼠血糖明顯升高，出現(xiàn)了明顯多飲、多尿、多食，大便性狀改變，大便干稀不等，精神倦怠，反應(yīng)遲鈍，體態(tài)瘦小，皮毛稀疏無光澤，皮膚潰瘍明顯高于對照組;糖尿病組大鼠的平均體重，明顯低于正常對照組大鼠;糖尿病組大鼠的血糖，明顯高于正常對照組;糖尿病組大鼠的胃排空率，顯著延遲于正常對照組，由此確定糖尿病胃輕癱模型建立成功。

表1 各組豚鼠體重、血糖和胃排空率變化(±s)Table 1 Changs of weight，blood glucose and gastric emptying rate in guinea pigs(±s)

表1 各組豚鼠體重、血糖和胃排空率變化(±s)Table 1 Changs of weight，blood glucose and gastric emptying rate in guinea pigs(±s)

2.2 胃ICC 和Cx43 的免疫組化表達情況

ICC 的陽性表達情況:1)正常對照組:c-Kit 陽性細胞呈棕黃色顆粒，著色鮮艷，定位于細胞膜和細胞質(zhì)，密集地分布在胃體和胃竇部環(huán)形肌層和縱形肌層之間，主要集中于環(huán)形肌層內(nèi)及附近，肌間神經(jīng)叢之間和黏膜下內(nèi)環(huán)肌層表面也有密集的ICC 分布，胃底肌間神經(jīng)叢未見ICC 分布(圖1A);2)糖尿病胃輕癱模型組:c-Kit 陽性細胞分布密度和著色強度明顯弱于對照組，非常稀疏地分布在環(huán)形、縱形肌層間，而且無環(huán)形肌層內(nèi)及附近主要分布的特點(圖1B);3)半夏瀉心湯治療組:陽性細胞同正常對照組一樣主要分布在胃體和胃竇部環(huán)形肌層內(nèi)及附近，數(shù)量較多(圖1C)。Cx43 的陽性表達情況:Cx43以細胞膜和細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性，正常對照組和半夏瀉心湯治療組Cx43 陽性表達密集分布在胃體和胃竇部環(huán)形肌層中，主要集中于環(huán)形肌層內(nèi)及附近，陽性表達的強弱與ICC 的陽性分布具有一致性;糖尿病胃輕癱模型組:Cx43 的數(shù)量明顯比對照組少。

2.3 胃ICC 超微結(jié)構(gòu)的變化

圖1 正常對照組(A)、糖尿病胃輕癱模型組(B)及半夏瀉心湯治療組(C)中豚鼠胃ICC 免疫組化的陽性表達分布情況Fig.1 Distribution of ICC’s positive express in guinea pigs of control group(A)，diabetic gastroparesis group(B)and Banxiaxiexin decoction group(C)

表2 各組豚鼠胃竇ICC、Cx43 數(shù)量的比較(±s，%)Table 2 Changes of ICC and Cx43’s numbers in guinea pigs(±s，%)

表2 各組豚鼠胃竇ICC、Cx43 數(shù)量的比較(±s，%)Table 2 Changes of ICC and Cx43’s numbers in guinea pigs(±s，%)

電鏡觀察結(jié)果顯示:1)正常對照組:大鼠胃ICC主要分布于胃竇環(huán)形肌與縱形肌之間的肌問神經(jīng)叢周圍，由許多縫隙連接緊密地連接在一起，ICC 之間及其與平滑肌細胞、神經(jīng)細胞之間多見由緊密并置的質(zhì)膜形成的縫隙連接，細胞超微結(jié)構(gòu)改變不明顯，線粒體豐富(圖2D)。2)糖尿病胃輕癱模型組:胃竇ICC 與其它的ICC、平滑肌和神經(jīng)末梢之問的縫隙連接均顯著減少，尚存的細胞問連接的結(jié)構(gòu)也有破壞，結(jié)構(gòu)不清，連接松散且問隙增大;ICC 細胞內(nèi)細胞器數(shù)量明顯少于正常對照組;ICC 細胞的基膜結(jié)構(gòu)不完整，缺乏連續(xù)性，有的基膜與細胞膜分離，形成空洞;ICC 細胞內(nèi)的胞質(zhì)廣泛溶解，有大量的胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，空泡大多沿質(zhì)膜分布;線粒體腫脹、空泡樣變、甚至溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也有擴張(圖2E)。3)半夏瀉心湯治療組:可見胃竇ICC 與平滑肌和神經(jīng)末梢之間的縫隙連接均明顯增多，有較發(fā)達的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體，偶見基底膜不完整、線粒體輕度腫脹;胃ICC 的數(shù)量較胃輕癱模型組增多，較正常對照組稍減少。ICC 形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，細胞表面突起增多，可見細胞連接，胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量較胃輕癱模型組增多，嵴清晰可見，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，數(shù)量較多，表面核糖體顆粒均勻。大鼠胃竇部lCC 的數(shù)量較模型組為多。胃ICC 之間、ICC 與平滑肌細胞及神經(jīng)末梢間連接的病理損害較胃輕癱模型組輕，其結(jié)構(gòu)較清晰而緊密。壁內(nèi)神經(jīng)及Icc 的分布及突起連接的病理損害較胃輕癱模型組為輕(圖2F)。

圖2 正常對照組(D)、糖尿病胃輕癱模型組(E)及半夏瀉心湯治療組(F)中豚鼠胃ICC 的超微結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Changes of ICC ultrastructure in guinea pigs of control group(D)，diabetic gastroparesis group(E)and Banxiaxiexin decoction group(F)

3 討論

糖尿病胃輕癱(DGP)是近年來研究的一個熱點，目前認為它是一個多因素疾病，其具體病理生理機制尚不十分清楚。因此，研究中藥治療糖DGP 的作用機制能為胃動力障礙疾病的防治提供理論依據(jù)，具有重要臨床意義。消化道通過胃腸道平滑肌細胞的舒縮運動來完成對食物的機械性消化，并推動食物的前進。平滑肌細胞是胃腸道運動的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，在80 年代末，Bitar 和Makhfou 首先建立了測量豚鼠分離胃平滑肌細胞技術(shù)，許文燮等將其技術(shù)做出相應(yīng)調(diào)整，成功制備了豚鼠游離單個胃平滑肌細胞，并應(yīng)用于實驗研究［3］。胃腸道Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是一類具有獨特功能的間質(zhì)細胞，由西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家Cajal于1893 年首次發(fā)現(xiàn)，這些細胞呈網(wǎng)狀分布在胃腸道神經(jīng)末梢與平滑肌細胞之間，對控制胃腸動力功能起關(guān)鍵作用。ICC 是胃腸慢波的起搏細胞，主要參與胃腸基本電節(jié)律(BER)調(diào)控和神經(jīng)遞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，近年來進行的一系列研究表明這種細胞在胃腸電及動力發(fā)生和運動障礙機制中有重要作用［4］，研究證實ICC 數(shù)量減少或網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞可造成胃慢波消失或節(jié)律失常，胃排空延遲［5］。Jameson 等發(fā)現(xiàn)糖尿病患者胃活體組織切片顯示ICC 明顯減少，甚至缺失。ICC 表達原癌基因c-kit，c-Kit 表達一種受體酪氨酸激酶CD117/c-Kit 蛋白，它是干細胞因子(stem cell facter，SCF)受體，可被特異性的抗體檢測出來［6，7］。應(yīng)用針對c-kit 的免疫組化標記抗體可以特異性識別ICC［8］，在顯微鏡下觀察ICC 的分布和密度。

ICC 網(wǎng)絡(luò)與平滑肌細胞間通過縫隙連接(gap junctions)相連，是其發(fā)揮生理功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，Connexin43(Cx43)是最重要的縫隙連接蛋白。實驗證明糖尿病胃輕癱大鼠胃壁內(nèi)ICC 明顯減少，Cx43 表達也明顯減低。張亞萍等用透射電鏡發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠ICC 與其他細胞間的連接結(jié)構(gòu)顯著破壞，線粒體腫脹，空泡樣變，細胞器數(shù)量減少，異染色質(zhì)明顯，肌膜分離形成空洞，ICC 超微結(jié)構(gòu)的改變造成其功能改變，這可能是糖尿病胃腸功能紊亂的病因之一。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對胃腸動力障礙性疾病的機理研究較深入，但在治療上卻進展不大，西藥促動力藥由于明顯的副作用及療效的不確定，限制了其臨床應(yīng)用。而中醫(yī)藥治療胃腸動力疾病具有明顯的優(yōu)勢，由于療效確切、副作用小及臨床應(yīng)用廣泛，故運用中藥治療胃動力障礙疾病正越來越受到人們親睞。祖國醫(yī)學(xué)非常重視脾胃(包括現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的胃腸)的功能，在長期的臨床實踐中積累了豐富的治療經(jīng)驗。近年來人們對中藥對胃動力的影響及其調(diào)節(jié)機制做了進一步的研究，并提出了“胃動力中藥”這一概念，從中醫(yī)中藥中尋找治療胃動力障礙的有效藥物，有著重要意義。半夏瀉心湯出自東漢著名醫(yī)學(xué)家張仲景所撰的《傷寒論》，全方由半夏、干姜、黃芬、黃連、人參、大棗、甘草七味藥組成，具有辛開苦降、寒溫并用、攻補兼施的功能，為調(diào)節(jié)胃腸運動障礙之良方。以往大量臨床和基礎(chǔ)研究表明半夏瀉心湯具有明顯的調(diào)節(jié)胃腸運動作用，而長期的臨床治療經(jīng)驗也表明半夏瀉心湯對嘔吐、腹瀉、消化不良等消化系統(tǒng)疾病具有明顯療效，但以往的研究大多停留在系統(tǒng)與器官水平，很少利用現(xiàn)代化研究方法對半夏瀉心湯的作用機制進行研究，由于缺乏細胞與分子水平的研究，不能從根本上闡明其藥理學(xué)作用機制。

為了深入研究半夏瀉心湯的作用機制，明確其藥理作用靶點，本課題實驗通過采用免疫組化標記c-kit 和Cx43，透射電鏡觀察ICC 的超微結(jié)構(gòu)等多種分子病理學(xué)技術(shù)方法，觀察并比較半夏瀉心湯含藥血清治療前后糖尿病胃輕癱動物模型胃平滑肌細胞、ICC 和Cx43 的變化，從而探討其治療作用及機制。實驗結(jié)果表明半夏瀉心湯含藥血清能明顯增加實驗豚鼠ICC 的數(shù)量并修復(fù)其受損結(jié)構(gòu)，進而增強實驗豚鼠的胃動力并恢復(fù)其功能，從而起到治療實驗豚鼠糖尿病胃輕癱的作用。這不僅從細胞和分子水平初步闡明了半夏瀉心湯治療實驗豚鼠糠尿病胃輕癱的作用機制，也為臨床防治胃腸運動障礙性疾病提供了重要的理論依據(jù)，由此成為中藥現(xiàn)代化研究一個新的突破口。

1 Ji JL(季建隆)，Zhao YY(趙云燕).Chinese and Western medicine study on gastroparesis of diabetes mellitus.J Chin Modern Tradit Chin Med(中華現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)雜志)，2008，4:322-325.

2 Xing DG(邢德剛)，Wei FX(魏鳳香)，Liang YL(梁燕玲)，et al.Effect of Banxiaxiexin decoction on spontaneous contraction of gastric antral circular muscle in rat.Chin J Public Health(中國公共衛(wèi)生)，2010，9:1150-1151.

3 Xing DG，Huang X，Li CH，et al.Muscarinic activity modulated by C-type natriuretic peptide in gastric smooth muscles of guinea-pig stomach.Regul Pept，2007，143(1-3):83-89.

4 Yao T(姚濤)，Yuan XZ(袁秀珠).Function of the gastric smooth muscles contraction induced by interstitial Cajal cell in diabetic rats.Chin J Clin Gastroenterol(臨床消化病雜志)，2011，23(3):156-159.

5 Ding XL(丁曉玲)，Chen J(陳捷)，Wu C(吳琛)，et al.The influence of athletes powder on Leydig cells in gastric antrum Cajal anorexia.Zhejiang J Tradit Chin Med(浙江中醫(yī)雜志)，2012，47:205-207.

6 Xu Y(徐寅)，Guo X(郭璇)，Er YH(弭艷紅)，et al.lnfluenction of Shuwei decoction on substance P and interstitial cells of Cajal in functional dyspepsia rat.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學(xué)雜志)，2012，18:207-209.

7 LU GX(盧光新)，Hu JH(胡俊華)，Yang YG(楊艷果)，et al.Role of interstitial cells of Cajal in experimental rats with gastric ulcer and gastric motility disorders of the esophagus.Chin J Digestion(中華消化雜志)，2012，32:126-127.

8 Liu DQ(劉登群)，Long S(龍爽)，Wang JP(王軍平)，et al.Isolation，culture and identification of interstitial cells of Cajal of adult C57BL/6 mice jejunum.Chin J Gastroenteroland Hepatol(胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志)，2011，20:538-541.