馬齒莧多糖對(duì)細(xì)胞存活率的影響及其毒性測(cè)定方法的比較研究

韓 笑，吳光杰，李玉萍*，姚麗華，王晨曦，陳美琴

1 江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2 江西省生物加工過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330013

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人類生活水平的提高，肥胖癥的發(fā)病率也隨之增高。與之密切相關(guān)的胰島素抵抗、高脂血癥、II 型糖尿病、心血管疾病等代謝性疾病已成為威脅人類健康的重要因素，有關(guān)降脂減肥功能性食品或藥物的研發(fā)也因此越來越受到全社會(huì)的關(guān)注。研究表明，肥胖是由于脂肪細(xì)胞的數(shù)目增殖和分化異常，導(dǎo)致脂肪過度沉積所引起的一種病理改變;脂肪合成過程包括前脂肪細(xì)胞增殖和分化為成熟的脂肪細(xì)胞，而細(xì)胞的增殖是必需條件;抑制前脂肪細(xì)胞的增殖和分化可減少機(jī)體脂肪的沉積，是預(yù)防和治療肥胖癥的策略之一。因此，以脂肪細(xì)胞的增殖與分化為觀測(cè)靶點(diǎn)，對(duì)篩選具有降脂減肥功能的活性成分以及開發(fā)功能性食品或藥物都具有重要意義［1，2］。但由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，耗力，難以滿足不同濃度多糖的毒性實(shí)驗(yàn)，而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用時(shí)短，且重復(fù)性較好。3T3-L1 前脂肪細(xì)胞來源于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，在適當(dāng)誘導(dǎo)條件下可分化成脂肪細(xì)胞，且在形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞生長(zhǎng)、脂質(zhì)積聚及脂肪代謝相關(guān)酶的表達(dá)等方面都能充分展示體脂肪細(xì)胞的特點(diǎn)［3］，被廣泛用于體外篩選和評(píng)價(jià)調(diào)脂減肥功能性成分的模式細(xì)胞。

馬齒莧(Portulaca oleracea L.)是藥食同源植物，馬齒莧多糖(Portulaca oleracea L.polysaccharides，POPs)是馬齒莧中主要功能因子之一，具有抗菌消炎、降糖、調(diào)脂、抗氧化等多種功效，具有開發(fā)成調(diào)脂降糖功能食品或減肥藥物的潛力［4］。但用于細(xì)胞學(xué)的體外研究細(xì)胞存活的方法很多，而MTT 是最早報(bào)道且應(yīng)用最廣泛的方法。中性紅檢測(cè)方法受外界條件影響較小，因中性紅可以滯留溶酶體內(nèi)而不被細(xì)胞洗滌液洗脫。乳酸脫氫酶檢測(cè)方法分析靈敏、方便、精確，適用于許多種細(xì)胞毒性分析。本研究從體外以3T3-L1 前脂肪細(xì)胞和POP 為研究對(duì)象，對(duì)比四甲基偶氮唑鹽(methl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法、中性紅染料攝取(neutral red uptake，NRU)法和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放法，從細(xì)胞的細(xì)胞器、膜完整性、代謝能力等方面評(píng)價(jià)POP 抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞增殖的敏感性，為體外快速篩選調(diào)脂減肥多糖活性成分提供方法參考，并為探討POP 改善與肥胖相關(guān)的糖尿病、胰島素抵抗等疾病的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)理論依據(jù)，尚未見馬齒莧多糖對(duì)細(xì)胞毒性方面的相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的野生馬齒莧購(gòu)于南昌市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室鑒定;3T3-L1前脂肪細(xì)胞系由江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭國(guó)棟博士友好贈(zèng)送;胰蛋白酶、中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒和青霉素-鏈霉素溶液均購(gòu)于碧云天公司;Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)干粉購(gòu)于Gibco 公司;3-［4，5-dimethylthiazol-2-yl］-2，5-diphenyltetrazolium bromide thiazolyl blue(MTT)和二甲基亞砜購(gòu)于Amresco 公司;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司;其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HV-85 型高壓滅菌鍋 日本Hirayama 公司;生物安全柜(Forma class-II/A2)和Forma 3111 系列CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma Series-Ⅱ)美國(guó)Thermo 公司;96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)Corning 公司;IX-71 型倒置熒光顯微鏡 日本Olympus 公司;全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Multiscan Mk-3 型)美國(guó)Labsystems 公司;離心機(jī)(5804R 型)德國(guó)Eppendorf 公司;超純水系統(tǒng)(Milli-Q Synthesis Millipore)美國(guó)Millipore 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 馬齒莧多糖的提取、分離及純化

采用水提醇沉法、Sevag 法脫蛋白、大孔樹脂AB-8 脫色(其中5 mg/mL 馬齒莧多糖溶液脫色工藝的最佳條件為:AB-8 大孔吸附樹脂用量為60 g/L、脫色時(shí)間為207 min、脫色溫度為50 ℃［5］。)等方法得到馬齒莧粗多糖(提取率為24.25%)，并用DEAE-52 纖維素柱層析分離和Sephadex G-100 凝膠過濾層析柱進(jìn)行純化。具體操作方法見本課題組吳光杰等的研究報(bào)道［6］。

1.3.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-L1 前脂肪細(xì)胞(2×104個(gè)/mL)接種于96 孔培養(yǎng)板，貼壁生長(zhǎng)48 h 后，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌，空白對(duì)照組更換新鮮DMEM 完全培養(yǎng)液(含10%FBS)，其余各實(shí)驗(yàn)組分別更換含有不同濃度POP 的DMEM 完全培養(yǎng)液(0.01、0.03、0.06、0.125、0.25、0.5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間(1、3、5 d)，分別平放在倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照及觀察。

1.3.3 MTT 比色法

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-L1 前脂肪細(xì)胞(2×104個(gè)/mL)接種于96 孔培養(yǎng)板，貼壁生長(zhǎng)48 h 后，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌，空白對(duì)照組更換新鮮DMEM 完全培養(yǎng)液(含10%FBS)，其余各實(shí)驗(yàn)組分別更換含有不同濃度POP 的DMEM 完全培養(yǎng)液(0.01、0.03、0.06、0.125、0.25、0.5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間(1、3、5 d)后，吸去培養(yǎng)上清液，添加新鮮DMEM 培養(yǎng)液，用MTT 法檢測(cè)POP 對(duì)細(xì)胞生存能力的影響。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光度(λ=492 nm)，與空白對(duì)照組相比較，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞相對(duì)增殖率。

1.3.4 NRU 檢測(cè)法

細(xì)胞的前培養(yǎng)同方法1.3.3。在更換不同培養(yǎng)液培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間(1、3、5 d)后，吸去培養(yǎng)上清液，用PBS 洗滌后，根據(jù)中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行中性紅攝取量的檢測(cè)。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(λ=540 nm)，通過計(jì)算中性紅攝取率間接反映細(xì)胞膜的完整性和細(xì)胞相對(duì)存活率。

1.3.5 LDH 釋放檢測(cè)法

細(xì)胞的前培養(yǎng)同方法1.3.3。用PBS 清洗后，各實(shí)驗(yàn)組更換含有不同濃度POP 的DMEM 培養(yǎng)液(1% FBS)。同時(shí)，設(shè)陰性對(duì)照組(未經(jīng)任何處理的對(duì)照細(xì)胞組)、陽性對(duì)照組(經(jīng)終濃度為10%的LDH釋放試劑處理1 h 組)，繼續(xù)培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)以400 g 離心5 min。輕輕吸取一定量的上清液至另一96 孔培養(yǎng)板中，根據(jù)乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行測(cè)定。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(λ=492 nm)，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)死亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用SPSS 17.0 進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)。P＜0.05 被認(rèn)為有顯著性差異并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 POP 影響3T3-L1 前脂肪細(xì)胞形態(tài)的顯微觀察

形態(tài)學(xué)觀察是最早用于定性細(xì)胞損傷的檢測(cè)方法。本研究中，不同濃度POP 處理3T3-L1 細(xì)胞后，1 d 內(nèi)POP 處理組和對(duì)照組的細(xì)胞一樣，貼壁、細(xì)胞呈梭形或多角形、無圓縮漂浮細(xì)胞;隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，空白對(duì)照組細(xì)胞大量增殖，排列密集，而POP 處理組細(xì)胞密度明顯減小，但無細(xì)胞固縮、漂浮等現(xiàn)象。然而，當(dāng)POP 濃度增加到0.5 mg/mL 時(shí)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)(3 d 和5 d)，可見部分細(xì)胞固縮、漂浮、裂解碎片，死亡細(xì)胞數(shù)明顯多于空白對(duì)照組和POP 低濃度處理組，5 d 后細(xì)胞幾乎漂浮死亡。

圖1 馬齒莧多糖對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞相對(duì)增殖力的影響Fig.1 Effects of POPs on cell relative growth rate(RGR)of 3T3-L1 preadipocytes

2.2 不同方法檢測(cè)POP 對(duì)3T3-L1 細(xì)胞增殖的影響

2.2.1 MTT 比色法評(píng)價(jià)

MTT 比色法是一種通過檢測(cè)線粒體活性來間接反應(yīng)細(xì)胞存活和增殖的常用方法。由圖1 可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，POP 具有抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞相對(duì)增殖的能力(P＜0.05)，并顯示隨處理時(shí)間(1、3、5 d)延長(zhǎng)而抑制能力增強(qiáng)的趨勢(shì)，隨著多糖濃度的增加，整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。本研究結(jié)果再一次證實(shí)了一定濃度范圍的POP 對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。

然而，當(dāng)用0.5 mg/mL POP 處理細(xì)胞5 d 時(shí)，出現(xiàn)大量細(xì)胞漂浮、裂解、死亡，細(xì)胞相對(duì)增殖率顯著減小(P＜0.001)，說明了高濃度POP(≥0.5 mg/mL)對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用。

2.2.2 NRU 法評(píng)價(jià)

由圖2 可知:各個(gè)濃度的POP 處理1 d 時(shí)，3T3-L1 細(xì)胞攝入中性紅染料的量和對(duì)照組相比無顯著性差異，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)(3 d 和5 d)，3T3-L1 細(xì)胞攝入中性紅染料的量隨著細(xì)胞增殖抑制而減少(P＜0.001)。這個(gè)結(jié)果與MTT 法和顯微觀察法檢測(cè)結(jié)果存在較大差異。MTT 法和顯微觀察法均顯示，在處理時(shí)間內(nèi)(1、3、5 d)，各個(gè)濃度的POP 均能明顯抑制細(xì)胞增殖，且當(dāng)用0.5 mg/mL POP 處理細(xì)胞5 d 時(shí)會(huì)導(dǎo)致3T3-L1 前脂肪細(xì)胞大量死亡;而NRU 法卻未顯示出同樣的抑制增殖作用和細(xì)胞毒性。說明MTT 方法在檢測(cè)POP 與3T3-L1 前脂肪細(xì)胞反應(yīng)性方面較NRU 法更為敏感。

圖2 馬齒莧多糖對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞中性紅染料攝取率的影響Fig.2 Effects of POPs on NRU rate of 3T3-L1 preadipocytes

2.2.3 LDH 釋放法評(píng)價(jià)

圖3 馬齒莧多糖對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞致死率的影響Fig.3 Effects of POPs on relative death rate of 3T3-L1 preadipocytes

結(jié)果顯示:用LDH 釋放試劑處理3T3-L1 細(xì)胞1 h 后，在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)(1、3、5 d)均導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的LDH 顯著升高，分別超過空白對(duì)照組的2 倍、4 倍和5 倍。當(dāng)用0.01～0.25 mg/mL 的POP分別處理1 d、3 d 和5 d 時(shí)，LDH 的釋放率明顯低于空白對(duì)照組(P＜0.05)，說明POP 對(duì)3T3-L1 細(xì)胞的細(xì)胞膜具有保護(hù)作用;但當(dāng)濃度增加到0.5 mg/mL時(shí)，LDH 釋放明顯增多，在POP 處理細(xì)胞3 d 和5 d時(shí)，LDH 釋放率分別是對(duì)照組的2 倍和3 倍(P＜0.001)。結(jié)果表明:高濃度的POP 對(duì)3T3-L1 細(xì)胞存在毒性作用，對(duì)細(xì)胞膜有較強(qiáng)的損傷作用(圖3)。這個(gè)結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(細(xì)胞固縮、懸浮和死亡)和MTT 法檢測(cè)結(jié)果相符合。

2.3 三種毒性評(píng)價(jià)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

分別以三個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)(1 d、3 d、5 d)獲得了相應(yīng)的劑量-反應(yīng)關(guān)系(表1～4)。與中性紅法相比，LDH 法和MTT 法對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響更為敏感。隨著POP 處理濃度的升高，細(xì)胞增殖活性明顯降低，顯示POP 抑制脂肪細(xì)胞增殖的生物活性。如表1 所示，處理1 d 時(shí)，LDH 法測(cè)定0.25 mg/mL 劑量組的細(xì)胞存活率僅為63.58%，MTT 法測(cè)定結(jié)果為86.03%，而中性紅法的存活率達(dá)101.04%。

表1 馬齒莧多糖處理1 d 后三種毒性試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活性結(jié)果Table 1 The cell viability results of the three cytotoxicity assays after 1 d exposure to POPs

表2 馬齒莧多糖濃度與三種檢測(cè)方法的相關(guān)性Table 2 The correlation of concentration of POPs and results of 3 cytotoxicity assays after 1 d exposure to POPs

由表1 和表2 方差分析可以看出，不同濃度下的馬齒莧多糖作用3T3-L1 前脂肪細(xì)胞24 h，三種方法均有顯著性差異。

從表3 中可以看出，當(dāng)POP 處理至3 d 時(shí)，0.25 mg/mL 劑量組的細(xì)胞存活率中MTT 法、LDH 法和NRU 法分別下降至40.88%、56.86%和50.59%。但是，當(dāng)處理濃度繼續(xù)增大(≥0.5 mg/mL)時(shí)，LDH值顯著高于空白對(duì)照組，顯微鏡下可見3T3-L1 前脂肪細(xì)胞出現(xiàn)明顯的固縮、漂浮、裂解現(xiàn)象，呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性作用。從表4 中也可看見類似的結(jié)果。

表3 馬齒莧多糖處理3 d 后三種毒性試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活性結(jié)果Table 3 The cell viability results of the 3 cytotoxicity assays after 3 d exposure to POP

表4 馬齒莧多糖處理5 d 后三種毒性試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活性結(jié)果Table 4 The cell viability results of the three cytotoxicity assays after 5 d exposure to POP

3 討論

在預(yù)防或治療肥胖以及與肥胖高度關(guān)聯(lián)的胰島素抵抗、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和Ⅱ型糖尿病等疾病時(shí)，常把抑制前脂肪細(xì)胞的增殖和分化、抑制脂肪蓄積作為策略之一。因此，許多研究者致力于從天然產(chǎn)物中篩選具有調(diào)控脂肪細(xì)胞增殖及分化、抑制脂肪蓄積功能的化合物［4］。在快速篩選試驗(yàn)中，3T3-L1 前脂肪細(xì)胞作為模式細(xì)胞被廣泛應(yīng)用。通過觀察待測(cè)物對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞增殖及分化、代謝能力等的影響，以此來初步判斷待測(cè)物是否具有調(diào)控脂肪細(xì)胞分化異常和減肥的作用。

利用體外細(xì)胞培養(yǎng)法因其具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、敏感度高、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于抗癌、減肥、降糖等生物活性成分的功能及安全性評(píng)價(jià)的初篩［7-9］。目前常用的細(xì)胞培養(yǎng)毒性試驗(yàn)包括:細(xì)胞形態(tài)及化學(xué)染料法、細(xì)胞代謝活性(MTT 法)、細(xì)胞膜效應(yīng)(LDH法、NRU 法)等。但是，在實(shí)際應(yīng)用過程中，每種方法對(duì)不同細(xì)胞和不同毒性敏感度不同，導(dǎo)致細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)得到不少彼此矛盾的結(jié)果。孫健等［9］用MTT 法、CCK-8 法等五種方法評(píng)價(jià)綠原酸和白藜蘆醇對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞毒性時(shí)，也發(fā)現(xiàn)不同方法在相同濃度下所得結(jié)果之間有顯著性差異，MTT 法的變異系數(shù)分別為5.54%和5.04%。本次研究旨在對(duì)比三種目前常用的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法(MTT 法、LDH 法和NRU 法)，以期為研究脂肪細(xì)胞增殖檢測(cè)提供較為敏感的檢測(cè)方法，同時(shí)為進(jìn)一步的作用機(jī)制研究提供參考。

在本研究中，三種檢測(cè)方法的測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)明顯的差異性。在POP 處理1 d 時(shí)，LDH 法和MTT 法測(cè)定的結(jié)果為，POP 對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞具有明顯的濃度依存性抑制作用;而NRU 法測(cè)定結(jié)果則顯示，隨著處理濃度的增加，細(xì)胞增殖率與空白對(duì)照組相比無明顯變化，無抑制作用，說明LDH 及MTT 法均比NRU 法較為敏感。但是隨著POP 處理時(shí)間延長(zhǎng)至3 d 時(shí)，三種測(cè)定方法的結(jié)果很接近，均顯示POP 對(duì)脂肪細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。而且當(dāng)POP 濃度≥0.5 mg/mL 時(shí)，LDH 釋放率顯著高于空白對(duì)照組，表現(xiàn)出和陽性對(duì)照組(LDH 釋放劑處理組)同樣的細(xì)胞毒性作用，說明LDH 釋放法敏感性＞MTT 法。而NRU 法在POP 處理5 d 時(shí)才顯示細(xì)胞毒性作用。由此可知，不同濃度的POP 作用于3T3-L1 前脂肪細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)，用NRU 法沒有檢測(cè)出和MTT 法及LDH 法相似的結(jié)果，說明NRU 法針對(duì)POP 實(shí)驗(yàn)材料和3T3-L1 前脂肪細(xì)胞作用對(duì)象而言不敏感或者不適合。三種檢測(cè)方法的敏感度順序?yàn)?LDH 釋放法＞MTT 法＞NRU 法。此外，通過細(xì)胞顯微形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)和MTT 法及LDH 法相似的結(jié)果，為待檢化合物的細(xì)胞安全性提供直觀的證據(jù)。

本研究采用三種不同的細(xì)胞毒性試驗(yàn)測(cè)定不同濃度的POP 作用于3T3-L1 前脂肪細(xì)胞不同時(shí)間的結(jié)果有明顯差異，造成這種結(jié)果的原因可能是因?yàn)槿N細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)的毒性指標(biāo)的不同。LDH法通過檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性來測(cè)定死亡細(xì)胞的數(shù)量。當(dāng)特定環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷時(shí)，存在胞漿中的LDH 會(huì)快速透過細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞外，故可通過測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活性來間接反映細(xì)胞膜受損程度，培養(yǎng)液中LDH 釋放率與死亡細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)。MTT 法根據(jù)線粒體琥珀酸脫氫酶與MTT 的結(jié)合能力來測(cè)定細(xì)胞活性?；罴?xì)胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶能使黃色的MTT 還原成不溶于水的藍(lán)紫色甲瓚沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。DMSO 可使甲瓚結(jié)晶溶解顯色，其顏色的深淺與活細(xì)胞數(shù)目和代謝活性呈正相關(guān)。NRU 法通過胞吞作用來測(cè)定活細(xì)胞溶酶體中攝入染料的量間接表示存活細(xì)胞數(shù)量。中性紅染料可被活細(xì)胞攝入，并在溶酶體中積累，而死細(xì)胞無此功能。通過定量檢測(cè)所攝入中性紅的水平，間接判定活細(xì)胞的數(shù)量。Weyermann等［8］對(duì)MTT 法、LDH 法和NRU 法三種試驗(yàn)方法進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LDH 試驗(yàn)對(duì)于細(xì)胞膜完整性的破壞較敏感，而對(duì)于影響細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)的一些毒性物質(zhì)反應(yīng)不敏感;MTT 比色法主要對(duì)影響線粒體酶活性的毒性反應(yīng)敏感，NRU 法主要對(duì)于導(dǎo)致溶酶體破壞的細(xì)胞毒性反應(yīng)靈敏。通過比較本研究中各試驗(yàn)結(jié)果的差異及三種檢測(cè)方法的敏感度順序，可以推斷POP 對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的短期作用機(jī)制與細(xì)胞膜和線粒體功能有關(guān)，且可影響3T3-L1 前脂肪細(xì)胞內(nèi)溶酶體的功能。至于這種影響是通過何途徑調(diào)控，尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，POP 對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的增殖抑制或毒性作用可以通過MTT 試驗(yàn)、LDH 釋放檢測(cè)和中性紅攝入試驗(yàn)這三種體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)來表示。但不同檢測(cè)方法顯示出了不同的敏感性。因此，在評(píng)價(jià)毒性作用機(jī)理尚不明確的待檢化合物時(shí)，可根據(jù)“最接近應(yīng)用狀況、多種評(píng)價(jià)方法結(jié)合應(yīng)用”的原則，合理地選擇樣品濃度、處理時(shí)間、細(xì)胞類型、與細(xì)胞的接觸方式和檢測(cè)生物學(xué)終點(diǎn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)或評(píng)價(jià)方法，綜合評(píng)價(jià)功能因子或藥物先導(dǎo)化合物的功效或毒性，以增加結(jié)果的可信度。

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