脂肽類化合物發(fā)酵條件的優(yōu)化及其分離工藝的初步研究

張曉慷，蔣愛忠，王海利，王瀅秀，張新剛

(山東省農藥科學研究院 山東省化學農藥重點實驗室，山東 濟南 250033)

脂肽類化合物是由芽孢桿菌、假單胞菌等細菌微生物代謝產生的次級代謝產物，廣泛存在于芽孢桿菌微生物農藥的生產過程中[1]。由于近年來化學農藥的濫用導致的殘留、毒性和污染問題日益凸顯，脂肽類化合物具有的環(huán)境友好、易降解、抗細菌[2-3]、抗真菌[4-5]等優(yōu)點日益得到人們的關注，并在食品工業(yè)[6]、環(huán)境保護[7]、化妝品行業(yè)[8]與生物制藥領域得到了不斷的研究與開發(fā)。

目前，脂肽類化合物的應用前景較為廣泛，具有較大的開發(fā)價值。但是，脂肽類化合物的分離工藝一直沒有大的突破，現在常采用的分離手段，如制備液相色譜、分子篩排阻層析、ODS反向分配層析等精致工藝大多適用于實驗室少量制備高純度樣品，難以進行工業(yè)化放大，無法滿足應用化研究的需要，所以急需要開發(fā)一種規(guī)?；闹苽涔に?。

本課題組從前期的工作中篩選出一株對黃瓜灰霉病[9]有防效的貝萊斯芽孢桿菌，通過對其有效成分的分析與鑒定，確認了其有效成分中存在脂肽類化合物。本文對F170062菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了研究，并對脂肽的分離純化工藝進行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

生產菌株：前期篩選出的生產脂肽的菌株F170062，系貝萊斯芽孢桿菌，由山東省農藥科學研究院保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

C4發(fā)酵培養(yǎng)基：10g可溶性淀粉、20g葡萄糖、25g花生粉、1g牛肉膏、4g酵母浸粉、2gNaCl、0.05gK2HPO4，水1000mL，調節(jié)pH值=7.2，分裝于250mL三角瓶中，每瓶約100mL，在121℃下濕熱滅菌25min備用。

Landy發(fā)酵培養(yǎng)基：20g葡萄糖、5g L-谷氨酸鈉、0.5gMgSO4、0.5gKCl、1g KH2PO4、0.15mg FeSO4、5mg MnSO4、0.16 mgCuSO4，水1000mL，調節(jié)pH值=7.2，分裝于250mL三角瓶中，每瓶約100mL，在121℃下濕熱滅菌25min備用。

1.2 方法

1.2.1 脂肽含量的測定

取生長有F170062菌的斜面接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃，轉速180r/min的恒溫搖床上培養(yǎng)數天。發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液4000r/min離心30min，收集上清液，并用6mol/L的鹽酸調節(jié)其pH值到2.0，4℃冷藏過夜，產生沉淀。離心收集沉淀，經甲醇浸提兩次，過濾、濃縮溶液，獲得脂肽粗提物。將脂肽粗提物定量配成甲醇溶液，采用高效液相色譜法定量測定其中脂肽含量(g/g)，或折算為脂肽在發(fā)酵液中的含量(mg/L)。

1.2.2 不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液中的脂肽含量測定

取生長有F170062菌的斜面接種于C4培養(yǎng)基中，在28℃，轉速180r/min的恒溫搖床培養(yǎng)48h，作為種子液，而后按5%的種子液量接入到新發(fā)酵培養(yǎng)基中，在相同條件下，繼續(xù)發(fā)酵，在第3，4，5，6，7天，每天取2L發(fā)酵液，按照1.2.1的方法測定發(fā)酵液中的脂肽含量。

1.2.3 溶劑沉淀試驗

將脂肽粗提物按照100mg/L的濃度配成甲醇溶液，待其溶解完全后，向溶液中瞬間加入4，6，8，10倍體積的的乙酸乙酯，而后磁力攪拌溶液30min，過濾沉淀，40℃烘干，對溶劑相進行脫溶處理，后將沉淀相與溶劑相分別定量溶解在甲醇溶液中，測定其中的脂肽含量。

1.2.4 水洗工藝試驗

1.2.4.1 沉淀溶解性試驗

將經溶劑沉淀試驗處理后的沉淀物溶解在甲醇溶液中，靜置過夜，將其中的不溶物過濾，40℃的烘箱中烘干，后取10mg分別溶解在3mL的正己烷、二氯甲烷、甲醇、乙醇、正丁醇、水、乙酸乙酯等7種溶劑中，觀察其溶解情況。

1.2.4.2 水洗處理試驗

將經溶劑沉淀試驗處理后的沉淀物放在40℃的烘箱中烘干，然后定量向其中加入蒸餾水，攪洗30min，過濾不溶物，40℃烘干，將水相脫溶，后將不溶物相與水相分別定量溶解在甲醇溶液中，測定其中的脂肽含量。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對脂肽含量的影響

選擇合適的發(fā)酵培養(yǎng)基對脂肽的生產與分離純化至關重要。營養(yǎng)成分豐富的培養(yǎng)基能夠提高芽孢桿菌的發(fā)酵效率，增加脂肽在發(fā)酵液中的含量，但是發(fā)酵液中較多的外源性雜質會增大脂肽的分離難度；而有利于脂肽分離的培養(yǎng)基往往成分比較單一，有利于脂肽的分離卻不利于其發(fā)酵生產。

選擇脂肽發(fā)酵常用的Landy發(fā)酵培養(yǎng)基[10]與本實驗室自用的C4培養(yǎng)基，按照

1.2.1 脂肽含量的測定方法對比兩種發(fā)酵培養(yǎng)基對脂肽發(fā)酵的影響，結果如表1所示。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基對脂肽發(fā)酵的影響Table 1 Effects of fermentation medium on lipopeptide fermentation

如表1所示，F170062菌在兩種培養(yǎng)基中均能發(fā)酵生產脂肽。但是通過對比發(fā)現，C4培養(yǎng)基的脂肽發(fā)酵效率要明顯高于文獻中常使用的Landy培養(yǎng)基，脂肽在C4發(fā)酵液中的含量大約是Landy發(fā)酵液的5.6倍。但是分析脂肽在脂肽粗提物中的含量，兩次甲醇浸取，Landy培養(yǎng)基分別高C4培養(yǎng)基50%及67%。通過分析兩種培養(yǎng)基的主要營養(yǎng)成分可以得知，C4培養(yǎng)基有豐富的碳源、氮源以及其他營養(yǎng)成分，能夠為菌株提供充足的營養(yǎng)物質，而Landy培養(yǎng)基的碳源較為單一，且有機氮源缺失，這使得菌株發(fā)酵很不充分，造成發(fā)酵產生的脂肽總量較低。然而，Landy培養(yǎng)基的成分以單糖及各種無機鹽為主，成分簡單，有利于脂肽的分離，所以，兩次甲醇浸取操作脂肽在其粗提物中的的含量，Landy培養(yǎng)基均高于C4培養(yǎng)基。綜上所述，考慮到脂肽總量較高會有利于其后續(xù)的分離操作，決定選擇C4培養(yǎng)基為其發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2 發(fā)酵時間對脂肽含量的影響

脂肽一般在芽孢桿菌生長的對數期開始合成，含量增長速度穩(wěn)定，在穩(wěn)定期大量合成，含量增長速度加快，到了衰亡期脂肽總量基本穩(wěn)定，含量不再增長[11]。所以，為了達到最大的脂肽發(fā)酵量，又不過多的浪費時間，需要確定菌株由穩(wěn)定期轉到衰亡期的時間點。圖1反映了發(fā)酵時間與脂肽含量之間的關系。

本試驗考察的發(fā)酵時間為3天至7天。當發(fā)酵時間在第3天時，測定發(fā)酵液中的脂肽含量僅為7.55mg/L，含量較低，到發(fā)酵第四天，脂肽含量也僅增長到9.62mg/L，增長速度十分緩慢，此時說明F170062菌正處于對數增長期，營養(yǎng)物質主要用于芽孢桿菌的增長，發(fā)酵生產的脂肽的量較少。當發(fā)酵時間到4～6天時，脂肽含量從9.62mg/L猛增到44.63mg/L，含量增長了近4倍，此時說明芽孢桿菌進入了增長穩(wěn)定期，在此階段，芽孢桿菌分泌了大量的蛋白酶，促進了營養(yǎng)成分的分解和吸收，合成了大量的脂肽[11]。當發(fā)酵天數到達第7天時，發(fā)酵液中的脂肽含量趨于穩(wěn)定，說明此時芽孢桿菌處在穩(wěn)定期與衰亡期，脂肽的合成開始減弱。綜合以上分析，考慮到時間成本，發(fā)酵時間確定為6天。

圖1 發(fā)酵時間對脂肽含量的影響Fig.1 Effects of fermentation time on lipopeptide content

2.3 溶劑沉淀工藝對脂肽含量的影響

高純度脂肽本身并沒有酸化沉淀的特性，但當發(fā)酵液中可酸化的雜質較多時，脂肽就會被吸附在其中跟隨雜質一塊沉淀下來，表現出可以被酸化沉淀的特征[12]。根據“相似相溶”原理，利用雜質與脂肽在溶液中溶解性差異，通過向脂肽粗提物的甲醇溶液中加入乙酸乙酯，瞬間降低溶液的極性，可以使脂肽從雜質中沉淀出來，從而達到分離提純的效果。表2為乙酸乙酯與甲醇的體積比與脂肽含量之間的關系。

表2 乙酸乙酯加入體積對脂肽含量的影響Table 2 Effects of ethyl acetate volume on lipopeptide content

當乙酸乙酯與甲醇的體積比由4增加到8時，沉淀相中脂肽含量由5.70%增加到7.91%，而溶劑相中的脂肽含量由2.85%降低到了0.85%。這說明向脂肽粗提物溶液中加入乙酸乙酯，確實起到了脂肽與雜質有效分離的作用，符合前期的理論推測，脂肽粗提物中大量低極性雜質被溶解在混合溶液中，而脂肽和一部分高極性雜質則從溶液體系中沉淀出來，脂肽在沉淀相中的含量明顯得到了提升。但當加入的乙酸乙酯與甲醇的體積比由8增加到10時，沉淀樣品中脂肽的含量反而有所下降，這可能是由于脂肽粗提物中的一部分低極性雜質與脂肽的親和力較強，將脂肽包裹在其中一起溶解在了溶液相，妨礙了兩者的分離。所以，經過上述分析，最佳的乙酸乙酯與甲醇的體積比為8。

為了驗證溶劑沉淀工藝對脂肽分離的有效性，試驗中增大了脂肽粗提物的質量，并進行了三批次的重復試驗，結果如下表所示。

表3 溶劑沉淀工藝驗證試驗Table 3 The validation test of solvent precipition

由表可知，通過對溶劑沉淀工藝進行了3次重復試驗，增加了脂肽粗提物的質量，脂肽的分離效果與前期的試驗結果基本一致。通過對重復試驗分析發(fā)現，脂肽粗提物中低極性雜質含量較高，分離出的雜質質量占脂肽粗提物的40%～60%。通過溶劑沉淀處理，可有效去除這部分雜質，為后面的分離打下基礎。

2.4 水洗處理工藝對脂肽含量的影響

經觀察發(fā)現，溶劑沉淀試驗處理后的沉淀相，再重新用甲醇溶解后，會有沉淀析出，這與脂肽粗提物在甲醇中的溶解性有差異。將沉淀過濾后，按照1.2.4.1的方法對其進行溶解性測試。結果發(fā)現沉淀物在正丁醇、甲醇、乙醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯中溶解性較差，在水中能充分溶解。對此沉淀的脂肽含量進行測定，沉淀中不含有脂肽。根據上述結果，對溶劑沉淀試驗處理后的沉淀樣品進行了水洗工藝探索，按照1.2.4.2方法進行了試驗，試驗結果如表4所示：

表4 水洗處理工藝對脂肽含量的影響Table 4 Effects of water washing process on lipopeptide content

由表4可知，通過水洗工藝處理后，較沉淀相相比，未溶解相中的脂肽含量有了大幅提升，增長了100%，而在水相中幾乎沒有脂肽，雜質質量去除了近30%。對上述試驗結果的分析推測，由于溶劑沉淀試驗分離掉了脂肽粗提物中的大部分的低極性雜質，使得雜質中的高極性雜質暴露了出來，這部分雜質由于缺少了低極性雜質的結合，其溶解性發(fā)生了改變，進而從甲醇的溶液體系中沉淀出來。利用這部分高極性雜質與脂肽溶解性之間的差異，可以非常方便的去除這部分雜質，從而提升脂肽的含量。

3 結論與討論

脂肽類化合物由于存在產量低，難分離等問題，一直阻礙其進行實用化開發(fā)。本文通過從發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵時間、分離工藝等方面對脂肽類化合物的工業(yè)化進行初步探索，著力解決其存在的問題。通過對比C4培養(yǎng)基與Landy培養(yǎng)基的脂肽發(fā)酵效率及脂肽的分離難度發(fā)現，文獻報道的Landy培養(yǎng)基雖然有助于脂肽分離，但是發(fā)酵效率低的缺點限制了其進一步的工業(yè)化應用，C4培養(yǎng)基成分復雜，難以分離，但也具有脂肽發(fā)酵效率高，產量大的優(yōu)勢，有利于其工業(yè)化的應用。通過考察C4培養(yǎng)基發(fā)酵時間與脂肽含量之間的關系，確定了最佳的發(fā)酵時間，同時也從側面推測了菌株的生長與衰亡過程。探索了溶劑沉淀工藝及水洗工藝在脂肽分離上的應用，大幅提升了脂肽的含量，而且在處理過程中盡量避免了使用柱層析、分子篩排阻層析或ODS反向分配層析等精致工藝，有利于其在工業(yè)化的應用。