脂肪酶水解L－亮氨酸異丁酯的工藝

田 中 樂，吳 文 忠，張 春 枝，吳 迪

(1.大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034；2.大連醫(yī)諾生物有限公司，遼寧 大連 116600)

0 引 言

亮氨酸屬于支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸中的一種。L－亮氨酸的生產(chǎn)方法有蛋白水解法、化學合成法、酶催化法、微生物發(fā)酵法等[1]。國內(nèi)L－亮氨酸的生產(chǎn)主要在天然蛋白水解液中提取，微生物直接發(fā)酵目前也已經(jīng)有中試生產(chǎn)的報道[2]。工業(yè)化的L－亮氨酸需要分離提純，一般的方法有離子交換法、沉淀法、乳狀液膜法及膜分離技術法[3－4]?？紤]到這些方法的處理量、純度、成本等問題，本文著重利用酶液水解L－亮氨酸異丁酯的方法來獲得高純的L－亮氨酸產(chǎn)品，并通過進行正交試驗對工藝參數(shù)的優(yōu)化來提高L－亮氨酸收率。

1 材料與方法

1.1 主要原料、試劑

L－亮氨酸(w＞98.5%)，湖北新生源生物工程公司；L－亮氨酸異丁酯，由L－亮氨酸制得；脂肪酶粉A，來源于試驗室；脂肪酶DF“天野”15、脂肪酶G“天野”50、脂肪酶A“天野”6，日本天野酶公司；胰酶，國藥集團化學試劑有限公司；木瓜蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、無水甲酸、高氯酸、冰醋酸、無水乙醇，分析純；甘氨酸，生化試劑。

1.2 酶液的制備

按不同pH配制緩沖液體系，將脂肪酶粉A投入到緩沖液中(m(脂肪酶粉A)／V(緩沖液)＝0.075g／mL，脂肪酶粉酶活為100 000U／g)，轉子攪拌提取20min，3 000r／min離心20min，傾倒出上清液即得試驗所需脂肪酶液，4℃冰箱冷藏。

1.3 L－亮氨酸的制備

稱取L－亮氨酸異丁酯2.0g和適量的酶液，放置于一定溫度的搖床中，用L－亮氨酸的溶解度提前飽和反應液，封口膜封口，170r／min搖床中反應，反應結束冷卻至室溫，過濾，無水乙醇洗滌，烘箱干燥得L－亮氨酸，稱量后計算L－亮氨酸收率。

1.4 L－亮氨酸含量測定

取試驗所得L－亮氨酸約0.1g，精密稱定，加無水甲酸1mL溶解后加冰醋酸25mL，按照電位滴定法[5]，用高氯酸滴定液(0.1mol／L)滴定，并將滴定的結果用空白試驗校正。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同酶對L－亮氨酸異丁酯水解效果的影響

分別用3種天野脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰酶以及脂肪酶粉A的水提酶液對L－亮氨酸異丁酯進行水解試驗，反應條件為：L－亮氨酸異丁酯質量為2.0g，加入不同酶制成酶液25mL，反應前用L－亮氨酸飽和(添加的溶解度按在25℃、100mL水中的溶解度2.3g，即每25mL酶液溶解0.575g L－Leu)，46 ℃、170r／min 搖 床 中 反 應8h。由表1知，6種酶僅有胰酶及脂肪酶A對L－亮氨酸異丁酯具有水解作用。脂肪酶 A 水解L－亮氨酸異丁酯得到的L－亮氨酸收率最高，胰酶是混合酶，部分酶起作用時可能會伴隨副反應，故選擇脂肪酶A進行L－亮氨酸異丁酯的水解試驗。

表1 不同酶對L－亮氨酸收率的影響Tab.1 Effect of different enzymes on the yield of L－leucine

2.1.2 緩沖液體系對L－亮氨酸收率的影響

在純水及 KH2PO4－NaOH、KH2PO4－K2HPO4、Gly－NaOH緩沖液體系條件下分別對脂肪酶粉A進行溶解離心，物料比為1∶12.5，酶液先用L－亮氨酸飽和，加入L－亮氨酸異丁酯2.0g，48℃、170r／min搖床中反應8h，考察緩沖液體系對L－亮氨酸收率的影響。如表2所示，4種緩沖體系所提酶液中，Gly－NaOH緩沖液體系水解L－亮氨酸異丁酯效果最好，用純水提取的酶液收率次之，并且反應后生成的L－亮氨酸溶液中因沒有離子存在使其部分黏壁，處理較困難。選擇Gly－NaOH緩沖液體系(pH 9.4)水解L－亮氨酸異丁酯。

表2 緩沖液體系對L－亮氨酸收率的影響Tab.2 Effect of different buffer systems on the yield of L－leucine

2.1.3 物料比對L－亮氨酸收率的影響

通過確定底物L－亮氨酸異丁酯的質量、改變酶液用量的方法來調(diào)整物料比。L－亮氨酸異丁酯質量為2.0g，分別加入15，18，20，25，30mL的酶液，即L－亮氨酸異丁酯與水的物料比為1∶7.5，1∶9，1∶10，1∶12.5及1∶15。酶液先用L－亮氨酸溶解度飽和，反應溫度為48℃，170r／min搖床中反應8h，考察物料比對L－亮氨酸收率的影響。由圖1可知，當物料比從1∶10到1∶12.5時，L－亮氨酸的收率由低到高的過程，在物料比增至1∶15時，收率增加不大?？紤]到最優(yōu)的酶液總量，需滿足最適的底物濃度，選擇L－亮氨酸異丁酯的水解反應的物料比為1∶12.5。

圖1 物料比對L－亮氨酸收率的影響Fig.1 Effect of material ratio on the yield of L－leucine

2.1.4 反應時間對L－亮氨酸收率的影響

L－亮氨酸異丁酯初始被水解時，很長時間都保持油狀，為了獲得較為準確的數(shù)據(jù)，選擇從8h開始。在L－亮氨酸異丁酯為2.0g、物料比為1∶12.5、酶液先用L－亮氨酸飽和、48℃、170r／min的條件下，考察不同的反應時間下L－亮氨酸收率。由圖2可知，L－亮氨酸異丁酯在水解過程中，隨著時間的增加，L－亮氨酸的收率逐漸增加，12h時收率達到89.23%。繼續(xù)增加時間，L－亮氨酸收率基本不增加，所以選擇最佳反應時間為12h。

圖2 反應時間對L－亮氨酸收率的影響Fig.2 Effect of reaction time on the yield of L－leucine

2.1.5 反應溫度對L－亮氨酸收率的影響

在L－亮氨酸異丁酯為2.0g，加入25mL的L－亮氨酸飽和后酶液，搖轉速為170r／min，反應溫度分別為44、46、48、50、54℃條件下反應12h，考察反應溫度對L－亮氨酸收率的影響。如圖3所示，在44～50℃時，L－亮氨酸收率呈增加趨勢，溫度到達54℃時，L－亮氨酸的收率大幅度減小。溫度過低時，脂肪酶水解速率較慢，溫度過高時酶容易加快變性，所以選擇反應溫度為50℃較合適。

圖3 反應溫度對L－亮氨酸收率的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the yield of L－leucine

2.2 正交試驗結果

2.2.1 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，采用L9(34)正交表，以L－亮氨酸收率為指標，因素水平和正交試驗結果及分析分別見表3、4。從表3、4可以看出，影響L－亮氨酸收率的因素順序為料液比、反應溫度、反應時間，最佳的組合為C3A2B3，即料液比為1∶13，反應溫度為50℃，反應時間為13h。

2.2.2 驗證性試驗

采用正交試驗確定最佳的脂肪酶A水解L－亮氨酸異丁酯的工藝條件，以L－亮氨酸收率為指標，進行驗證性試驗。3個平行反應結果表明，在此條件下L－亮氨酸的收率為95.23%。

表3 正交試驗因素水平表Tab.3 Level table of orthogonal exprimental design

表4 正交試驗結果及分析Tab.4 Result of analysis of orthogonal exprimental

3 結 論

通過不同酶作催化劑水解L－亮氨酸異丁酯，發(fā)現(xiàn)脂肪酶A對L－亮氨酸異丁酯水解效果最好。通過單因素及正交試驗獲得了最佳的工藝參數(shù)：以L－亮氨酸異丁酯為原料，選擇Gly－NaOH緩沖液體系提取脂肪酶液，用L－亮氨酸溶解度的質量飽和酶液，搖床轉速為170r／min，物料比為1∶13，反應溫度為50℃，反應時間13h。L－亮氨酸的收率為95.23%。對所得到的L－亮氨酸進行含量測定，測定其純度為99.80%。該方法制備的L－亮氨酸產(chǎn)品色澤光亮，純度好，L－亮氨酸收率高。

[1]劉建軍，趙祥穎，田延軍，等.L－亮氨酸的性質、生產(chǎn)及應用[J].山東食品發(fā)酵，2005(1)：3－6.

[2]李桂甫，陳寧，徐慶陽.L－亮氨酸的發(fā)酵中試生產(chǎn)[J].現(xiàn)在食品科技，2010，26(12)：1367－1369.

[3]謝希賢，曹華杰，杜軍，等.采用膜分離技術高效分離提取L－亮氨酸[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(12)：180－182.

[4]朱澄云，莫鳳奎，葛曉玲，等.乳狀液膜法提取亮氨酸(Ⅱ)[J].膜科學與技術，2001，21(1)：59－61.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：第二部[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010：1301－1302.