振腹環(huán)揉法對(duì)PCPA失眠大鼠腦、腸組織中SP及GAL蛋白表達(dá)的影響

郅曉宇，劉 鵬，董 娜，張 野，張紅石*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021）

課題組在腹部推拿治療失眠的機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)了臟腑推拿治療失眠存在腦腸互動(dòng)現(xiàn)象，且與人體腦腸肽調(diào)節(jié)密切相關(guān)。因此，本研究通過前期實(shí)驗(yàn)篩選，確定了兩種與睡眠密切相關(guān)的腦腸肽SP與GAL，通過Western blot檢測二者在下丘腦及小腸中的蛋白表達(dá)，驗(yàn)證腹部推拿治療失眠存在腦腸互動(dòng)現(xiàn)象。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

64只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（吉）-2020-0002]，7周齡，體質(zhì)量（200±20）g左右。大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、推拿組、藥物組，每組16只。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

戊巴比妥鈉（Merck公司），PCPA（美國Sigma公司），戊巴比妥鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），碳酸氫鈉（成都市科龍化工試劑廠），阿拉伯膠（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司），PBS磷酸鹽緩沖液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），人參歸脾丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

電泳系統(tǒng)（型號(hào)：Mini-ProteanTetra，美國Bio-Red公司），轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：170-4150，美國Bio-Rad公司），成像分析系統(tǒng)（型號(hào)：FluorChemQ，美國Proteinample公司），離心機(jī)（ESCO MCR-88-8）。

2 方法

實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)審核通過（No：2021248），具體方法如下。

2.1 PCPA失眠模型大鼠制作

將加入阿拉伯膠的PCPA粉末研磨至泡沫狀，以氯化鈉溶液和碳酸氫鈉溶液配制成100 mg·mL-1混懸液，備用，于注射前震蕩搖勻。模型組、推拿組以及藥物組采用PCPA腹腔注射制作失眠大鼠模型，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按大鼠體質(zhì)量400 mg·mL-1計(jì)算PCPA使用量。每日上午8:00－10:00時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，每日1次，連續(xù)注射2 d。以30 mg·mL-1戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射對(duì)造模后大鼠進(jìn)行翻正反射實(shí)驗(yàn)，記錄翻正反射消失時(shí)間與睡眠持續(xù)時(shí)間，如與空白組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），則證明模型復(fù)制成功。

2.2 干預(yù)方法

1）空白組：不做任何處理。2）模型組：造模成功后正常飼養(yǎng)。3）推拿組：造模成功后行振腹環(huán)揉治療，將每只大鼠套裝于干凈襪子中，以震動(dòng)按摩器環(huán)揉腹5 min，并以震動(dòng)按摩器于腹部振動(dòng)5 min，每日1次，連續(xù)治療5～10 d。4）藥物組：按照人:大鼠=1:30的比例灌服人參歸脾丸（將藥物劑量按照體質(zhì)量轉(zhuǎn)化為毫升數(shù)），連續(xù)5～10 d。

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材

治療5 d后每組處死8只大鼠，治療10 d后處死剩余大鼠。使用異氟烷進(jìn)行氣麻后進(jìn)行斷頭處理，在冰盤上剝離下丘腦，并迅速放入液氮中；截取小腸5 cm，于預(yù)冷過的生理鹽水中清洗后，立即放入-80 ℃冰箱保存。

2.4 Western blot測定

1）取大鼠下丘腦以及小腸組織，稱重后加入預(yù)冷的RIPA 裂解緩沖液研磨。2）4℃ 12 000 r·min-1，離心15 min，提取上清液。3）BCA檢測法測蛋白濃度。4）聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)各目的蛋白從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移PVDF膜。5）5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗后過夜。6）將取出的膜在PBS溶液中洗滌5 min，重復(fù)3次，隨后將膜放入封閉的盒子中，加入合適濃度的二抗，室溫孵育1 h。7）將β-actin作為內(nèi)參，化學(xué)發(fā)光法顯影，觀察拍照。8）采用Image Pro Plus圖像分析軟件測算出SP、GAL蛋白表達(dá)條帶的光密度值，進(jìn)行蛋白表達(dá)水平分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間多重比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組翻正反射實(shí)驗(yàn)

見表1。

表1 各組造模后翻正反射消失時(shí)間及睡眠持續(xù)時(shí)間比較（±s，n = 16）min

表1 各組造模后翻正反射消失時(shí)間及睡眠持續(xù)時(shí)間比較（±s，n = 16）min

注：與空白組比較，# P＜0.05

組別 翻正消失時(shí)間 睡眠持續(xù)時(shí)間空白組 5.12±0.39 35.01±0.86模型組 10.18±0.84 # 22.15±0.21 #推拿組 10.18±0.76 # 23.22±0.43#藥物組 10.16±0.69 # 23.92±0.11 #

3.2 各組蛋白水平變化

振腹環(huán)揉法干預(yù)后，各組蛋白印跡圖（見圖1）；大鼠下丘腦中GAL的蛋白表達(dá)量上升（見表2、圖2），小腸中GAL的蛋白表達(dá)量下降（見表3、圖3）；下丘腦、小腸中SP的蛋白表達(dá)量上升（見表2、表3、圖2、圖3）。

圖1 各組蛋白印跡圖

圖2 下丘腦中SP、GAL蛋白表達(dá)量

圖3 小腸中SP、GAL蛋白表達(dá)量

表2 各組下丘腦SP、GAL蛋白水平變化比較（±s ）pg·mL- 1

表2 各組下丘腦SP、GAL蛋白水平變化比較（±s ）pg·mL- 1

注：與模型組第5天比較，# P＜0.05；與模型組第10天比較，△P＜0.05

組別 n SP GAL空白組第5天 16 1.52±0.14# 0.81±0.10 #模型組第5天 16 0.86±0.15 0.44±0.08推拿組第5天 16 1.06±0.24 # 0.58±0.04 #藥物組第5天 16 1.09±0.21 # 0.57±0.10 #空白組第10天 8 1.51±0.21△ 1.06±0.07△模型組第10天 8 1.10±0.20 0.50±0.07推拿組第 10 天 8 1.21±0.15 0.73±0.08 △藥物組第 10 天 8 1.24±0.10 0.71±0.06 △

表3 各組小腸SP、GAL蛋白水平變化比較（±s ）pg·mL- 1

表3 各組小腸SP、GAL蛋白水平變化比較（±s ）pg·mL- 1

注：與模型組第5天比較，# P＜0.05；與模型組第10天比較，△P＜0.05

組別 n SP GAL空白組第5天 16 0.35±0.02# 1.40±0.19 #模型組第5天 16 0.17±0.02 3.86±0.28推拿組第5天 16 0.24±0.01 # 2.33±0.15 #藥物組第5天 16 0.26±0.03 # 2.58±0.23#空白組第10天 8 0.36±0.01 △ 1.44±0.15 △模型組第10天 8 0.27±0.01 3.17±0.27推拿組第10天 8 0.32±0.01 △ 1.69±0.29 △藥物組第10天 8 0.34±0.01 △ 1.72±0.27 △

4 討論

現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)與心理學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，失眠與大腦的生理功能改變，遺傳因素及情感因素密切相關(guān)[1]。隨著神經(jīng)生物學(xué)的發(fā)展，很多神經(jīng)肽類物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)參與了睡眠—覺醒調(diào)節(jié)[2]，如神經(jīng)肽Y（NPY），SP，膽囊收縮素（CCK）等，它們統(tǒng)稱為腦腸肽。作為既存在于腦中又存在于腸道中的雙重分布肽類[3]，目前已被發(fā)現(xiàn)60余種，大致分為神經(jīng)肽、胃腸肽、胃腸神經(jīng)肽3類[4]。腦腸肽在大腦與胃腸之間起著雙向調(diào)節(jié)作用，與睡眠—覺醒的調(diào)節(jié)有關(guān)[5]，是證明腹部推拿治療失眠存在腦腸互動(dòng)現(xiàn)象的首選物質(zhì)。腦腸肽是腦腸軸的橋梁性介質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)相互作用中起到雙向調(diào)節(jié)作用，其整合了腸道和大腦之間的神經(jīng)、激素和免疫信號(hào)[6]。因此，微生物—腸道—大腦軸（microbiota-gut-brainaxis，MGBA）的確立[7]，為腹部推拿治療失眠的機(jī)制研究開辟了新的研究思路。

SP可以通過神經(jīng)激肽受體發(fā)揮作用，從而改變非快速眼動(dòng)（NREM）睡眠，因此靶點(diǎn)在其受體的藥物可以被用作睡眠醫(yī)學(xué)的新療法[8]。SP是神經(jīng)激肽-1受體（NK-1R）的主要配體，遍布了包括皮層在內(nèi)的整個(gè)大腦。NK-1R存在于睡眠活躍的皮質(zhì)神經(jīng)元上，其活性與慢波睡眠相關(guān)[9]。SP在外周主要存在于交感神經(jīng)末梢，其變化水平可以在一定程度上反映中樞的變化[10]。它與胃腸運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，當(dāng)胃腸運(yùn)動(dòng)受到抑制時(shí)，機(jī)體會(huì)分泌大量的SP來促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)[11]。

GAL與睡眠、認(rèn)知、情感行為等密切相關(guān)[12]。其主要存在于延髓腹側(cè)表面、孤束核、三叉神經(jīng)尾核等。GAL可與DA、5-HT、NE等腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)共存，對(duì)神經(jīng)活動(dòng)具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)功能[13]。腹外側(cè)視前區(qū)在慢波睡眠的維持和產(chǎn)生中具有重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)存在于腹外側(cè)視前區(qū)的甘丙肽能神經(jīng)元通過表達(dá)結(jié)節(jié)乳頭體核組胺能神經(jīng)元上的GalR1增加慢波睡眠[14]。GAL在消化道中也有分布，對(duì)消化道具有調(diào)控作用，它可以抑制胃酸的分泌以及抑制進(jìn)食后的胃部運(yùn)動(dòng)，并且對(duì)小腸的收縮活動(dòng)具有抑制作用[15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，振腹環(huán)揉法干預(yù)后，PCPA失眠大鼠下丘腦及小腸中SP表達(dá)量均升高，表明振腹環(huán)揉法提高了兩個(gè)部位的SP蛋白活性，促進(jìn)了SP維持睡眠慢波狀態(tài)的生理作用，促進(jìn)了胃腸運(yùn)動(dòng)。而GAL在下丘腦內(nèi)表達(dá)升高，在腸道內(nèi)表達(dá)下降，表明腹部推拿對(duì)不同部位的GAL表達(dá)調(diào)控出現(xiàn)了差異性。其可使下丘腦內(nèi)GAL蛋白活性升高，維持睡眠周期內(nèi)腦電波慢波效應(yīng)，使腸道內(nèi)GAL蛋白活性下降，改善胃腸道的抑制狀態(tài)。振腹環(huán)揉法通過調(diào)節(jié)PCPA失眠大鼠SP及GAL的表達(dá)，改善失眠大鼠睡眠狀態(tài)及腸道蠕動(dòng)，這種現(xiàn)象驗(yàn)證了腹部推拿治療失眠存在腦腸互動(dòng)現(xiàn)象。