廣藿香-陳皮揮發(fā)油對(duì)功能性消化不良大鼠的作用機(jī)制研究

摘要：目的 研究廣藿香-陳皮揮發(fā)油（patchouli-citrus volatile oil， PCO）是否可以通過調(diào)節(jié)胃竇肌張力、腦腸肽和自噬，增強(qiáng)胃動(dòng)力和減輕不適感方面起到治療功能性消化不良（functional dyspepsia， FD）大鼠的作用。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為空白組（Control）、模型組（FD）、莫沙必利組（Mosapride）、廣藿香-陳皮揮發(fā)油低劑量組（PCOL， 100 mg/kg）和廣藿香-陳皮揮發(fā)油高劑量組（PCOH， 400 mg/kg）。給藥7 d后，測(cè)定各組大鼠體質(zhì)量、胃排空率（gastric emptying rate， GER）和腸推進(jìn)率（intestinal propulsion rate， IPR）；通過體外肌張力儀器檢測(cè)胃竇環(huán)形肌張力的變化，評(píng)估PCO對(duì)大鼠肌張力的作用；蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining， HE）觀察各組大鼠胃竇組織病理學(xué)改變；免疫組化檢測(cè)各組大鼠胃竇組織酪氨酸激酶受體（c-kit）的表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）檢測(cè)大鼠血清中腦腸肽胃動(dòng)素（motilin， MTL）、胃泌素（gastrin， GAS）、生長(zhǎng)激素釋放肽（ghrelin）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal polypeptide， VIP）、5-羥基色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）的含量；定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction， qPCR）檢測(cè)胃竇降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide， CGRP）mRNA的表達(dá)，蛋白免疫印跡法（western blot）檢測(cè)胃竇組織中自噬相關(guān)蛋白芐氯素1（beclin1）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）、p62的表達(dá)； 結(jié)果 PCO給藥后可作用于胃竇上的乙酰膽堿受體、腎上腺素受體和5-HT受體，調(diào)節(jié)胃竇肌張力； 還可以調(diào)節(jié)自噬相關(guān)p62、Beclin1和LC3的表達(dá)水平抑制ICC過度自噬以及調(diào)節(jié)FD大鼠腦腸肽（brain-gut peptides ， BGP）： 提高M(jìn)TL、GAS、Ghrelin水平，降低VIP、5-HT水平和胃竇CGRP mRNA表達(dá)，增強(qiáng)胃動(dòng)力，促進(jìn)消化功能以及減輕內(nèi)臟超敏反應(yīng)引起的疼痛。結(jié)論 PCO可通過調(diào)節(jié)胃竇肌張力、抑制自噬以及調(diào)節(jié)血清腦腸肽水平，起到增強(qiáng)胃動(dòng)力和調(diào)節(jié)腦腸軸方面起到治療FD的作用。

關(guān)鍵詞：功能性消化不良；廣藿香揮發(fā)油；陳皮揮發(fā)油；腦腸肽；自噬；胃竇平滑肌

中圖分類號(hào)：R9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on the mechanism of patchouli-citrus volatile oil on functional dyspepsia rats

Shen Changhong， Sun Chen， Yao Ziqing， Cheng Fang， Cheng Zefang， Liu Bo， and Zhang Ruoqi

（State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137）

Abstract Objective To confirm the therapeutic effects of patchouli oil in combination with citrus oil （PCO） on functional dyspepsia （FD） in rats and explore its mechanism of action to enhance gastric motility and alleviate discomfort in terms of its action receptors regulating the muscle tone of the gastric sinusoidal circular muscle， brain-gut peptides， and autophagy. Methods SD rats were randomly divided into the blank （control） group， the model （FD） group， the mosapride group （mosapride）， the patchouli-citrus volatile oil low dose group （PCOL， 100 mg/kg）， and the patchouli-citrus volatile oil high dose group （PCOH， 400 mg/kg）. After seven days of administration， the body mass， gastric emptying rate （GER）， and intestinal propulsion rate （IPR） of rats in each group were measured; the changes in the ring muscle tone of the gastric sinus were detected by the in vitro muscle tone apparatus to evaluate the effect of PCO on the muscle tone of rats; the histopathological changes of the gastric sinus of the rats in each group were observed by hematoxylin-eosin staining （HE）; the expression of c-kit of the gastric sinus tissues of the rats in each group was detected by immunohistochemistry; and ELISA was performed to examine the expression of the gastric sinus tissues of the rats in each group. The serum levels of motilin （MTL）， gastrin （GAS）， ghrelin， vasoactive intestinal polypeptide （VIP）， and 5-hydroxytryptamine （5-HT） were detected by ELISA; the mRNA expression of calcitonin gene-related peptide （CGRP） in gastric sinus was detected by qPCR; and the expression of autophagy-related proteins （Beclin1， LC3 and p62） in gastric sinus tissue was detected by Western blotting. Results PCO could regulate the tone of the gastric sinus muscle by acting on the acetylcholine receptor， adrenergic receptor， and 5-HT receptor. It could also regulate the expression levels of autophagy-related p62， Beclin1， and LC3 to inhibit ICC over-autophagy as well as regulate brain-gut peptides （BGP） in FD rats， which could increase the levels of MTL， GAS， and Ghrelin， reduce VIP， 5-HT levels， and mRNA expression of sinus CGRP， enhance gastric motility， promote digestion， and reduce pain caused by visceral hypersensitivity. Conclusion PCO may have a role in treating FD by enhancing gastric motility and regulating the brain-gut axis. This was achieved by regulating sinus muscle tone， inhibiting autophagy， and modulating serum brain-gut peptide levels.

Key words Functional dyspepsia; Patchouli oil; Citrus oil; Brain-gut peptides; Autophagy; Gastric sinus smooth muscle

功能性消化不良（functional dyspepsia， FD）是一種常見的功能性胃腸疾病。其主要癥狀包括以下一種或多種：餐后早飽、不規(guī)則反流、上腹疼痛和燒灼感[1]。其發(fā)病機(jī)制主要與胃腸動(dòng)力障礙、內(nèi)臟超敏、腦-腸軸功能障礙、幽門螺桿菌感染和心理應(yīng)激有關(guān)[2]。目前對(duì)FD的治療主要以對(duì)癥治療為主，例如使用促動(dòng)力藥、幽門螺桿菌治療劑和抗抑郁藥。然而，大多數(shù)有效的治療藥物都有不良反應(yīng)。例如，多潘立酮和西沙必利都因心臟安全問題受到限制，胃復(fù)安可能引發(fā)錐體外系反應(yīng)，而三環(huán)抗抑郁藥可能導(dǎo)致頭暈、嗜睡，甚至可能引起自殺念頭[3-5]。因此，需要新的療效更穩(wěn)定、不良反應(yīng)更少的治療方法。中藥因其臨床療效好、安全性高以及不良反應(yīng)低的優(yōu)點(diǎn)，正逐漸成為FD治療的潛在候選藥物。

根據(jù)中醫(yī)理論，F(xiàn)D主要是由疲勞傷脾、飲食傷胃和情緒失調(diào)導(dǎo)致脾胃功能受損、胃腸動(dòng)力減弱等因素引起[6]。因此，臨床上常用健脾開胃、理氣疏肝的藥物進(jìn)行治療[7]。廣藿香作為芳香類中藥，主歸胃、脾、肺經(jīng)，有著芳香化濕，發(fā)表解暑，理氣止嘔的功效。宋代蘇頌的《本草圖經(jīng)》中認(rèn)為廣藿香是治療脾胃吐逆的要藥。陳皮，味苦辛性溫，主歸肺、脾經(jīng)，具理氣健脾、燥濕化痰的功效。在《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版）中提到的理氣健脾方劑如四正丸、平肝舒絡(luò)丸、香砂和中丸等方劑中，廣藿香與陳皮均作為理氣化濕健脾藥對(duì)進(jìn)行配伍使用，對(duì)濕濁中阻，脘痞嘔吐，食少納呆有較好地治療效果[8-9]?，F(xiàn)代藥理研究表明，揮發(fā)油作為廣藿香和陳皮的重要藥用部位，廣藿香揮發(fā)油、陳皮揮發(fā)油體外給藥時(shí)能夠抑制腸痙攣[10]，而體內(nèi)給藥時(shí)具有調(diào)節(jié)胃腸功能、保護(hù)胃黏膜、促進(jìn)消化液分泌的功效[11-13]。但是廣藿香揮發(fā)油和陳皮揮發(fā)油的配伍藥效和作用機(jī)制相關(guān)的研究不充分、不深入，所以本次研究中選用廣藿香和陳皮揮發(fā)油配伍，研究其對(duì)功能性消化不良的藥效和作用機(jī)制。

胃消化功能與胃竇密切相關(guān)，胃竇有節(jié)奏的收縮可以更好地研磨食物，將食物推向小腸，促進(jìn)消化。因此，刺激胃竇上的感受器，增加胃竇肌張力，可以促進(jìn)胃運(yùn)動(dòng)。研究表明，胃腸起搏器細(xì)胞 （interstitial cell of Cajal， ICC）的自噬和分化與FD的發(fā)展密切相關(guān)[14]。過度自噬的發(fā)生會(huì)影響ICC的數(shù)量和生理功能，進(jìn)而影響胃動(dòng)力。此外，參與調(diào)節(jié)腦-腸軸功能的腦腸肽（BGP）與FD中的情緒調(diào)節(jié)和胃動(dòng)力高度相關(guān)，并在減輕與內(nèi)臟超敏反應(yīng)相關(guān)的不適和痛覺感受方面發(fā)揮重要作用[15]。所以通過調(diào)節(jié)腦腸肽也可起到治療FD的作用[16-17]。

因此，本研究擬通過檢測(cè)PCO給藥后大鼠體重、胃排空率和腸推進(jìn)率變化評(píng)價(jià)藥效，通過對(duì)胃竇平滑肌張力及其受體的影響、血清BGP水平和ICC自噬有關(guān)蛋白表達(dá)水平等方面評(píng)價(jià)PCO對(duì)FD大鼠的作用機(jī)制。

1 材料、儀器與動(dòng)物

1.1 材料

廣藿香（批號(hào)：220314）、陳皮（批號(hào)：220328）購(gòu)自四川省中藥飲片有限責(zé)任公司；碘乙酰胺（貨號(hào)：I811738），蔗糖（貨號(hào)：S818046），氯化乙酰膽堿、5-羥色胺、鹽酸酚妥拉明、六甲溴銨、鹽酸普萘洛爾和硫酸阿托品（批號(hào)：A800895、H875754、P914347、H862711、P902404和A822893）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；ELISA試劑盒（MTL、GAS、Ghrelin、VIP和5-HT）（上海江萊生物技術(shù)公司）；抗LC3，p62， Beclin1體（英國(guó)Affinity公司，批號(hào)：AF5402， AF5384，AF5128），β-actin，二抗羊抗兔 （武漢賽維爾生物科技有限公司， 批號(hào)：GB15003， GB23303） ，ECL顯影液（ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒，BL520B）；無水硫酸鈉（Na2SO4）羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（批號(hào)：20220801，2018022601）購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器

MP-160生理信號(hào)記錄分析系統(tǒng)（美國(guó)Biopac公司）；數(shù)字切片掃描系統(tǒng)（NanoZoomer S60， 日本Hamamatsu公司）；WIX-miniPRO電泳儀、WIX-miniBLOT4濕轉(zhuǎn)電泳槽（北京韋克斯科技有限公司）；RE6100型酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；e-Blot Tough Image顯影儀；醫(yī)用熒光定量PCR儀Archimed X4（鯤鵬基因（北京）科技有限責(zé)任公司）; T100TM" Thermal Cycle型反轉(zhuǎn)錄儀器（美國(guó)BioRad公司）；Nanophotometer N60型微量核酸測(cè)定儀（德國(guó)Imple公司）；QUINTIX35-1CN電子天平、BCE2241-1CCN電子天平、SECURA225D-1CN電子天平（德國(guó)Sartorius公司）; TGL-25M低溫離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3 動(dòng)物

7日齡SD大鼠72只（雄性，SPF級(jí)，帶母鼠） ，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010，飼養(yǎng)于室溫（25±2） ℃ 、光照周期12 h/12 h的環(huán)境，自由進(jìn)食、進(jìn)水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為2022-72。

2 方法

2.1 廣藿香和陳皮揮發(fā)油的制備

廣藿香和陳皮粉碎后，取100 g粉末與800 mL蒸餾水混合，用水蒸餾法提取6 h，然后用Na2SO4脫水。陳皮揮發(fā)油得率為1.93%，廣藿香揮發(fā)油得率為0.30%。

2.2 FD大鼠建模、分組與給藥

采用碘乙酰胺聯(lián)合夾尾法建立大鼠FD模型[18-19]。將7日齡乳鼠分為兩組：模型組（n=56）和對(duì)照組（n=16），10日齡時(shí)，模型組大鼠每日灌胃含0.1%碘乙酰胺的2%蔗糖溶液0.2 mL，對(duì)照組大鼠灌胃含2%蔗糖溶液，持續(xù)6 d[20-21]。然后正常飼養(yǎng)至7周齡。模型組采用手術(shù)鉗夾尾，夾在尾后三分之一處。每4 h一次，一次30 min，3次/d，持續(xù)7 d[22]。造模結(jié)束后，造模組大鼠隨機(jī)分為模型組（FD），陽(yáng)性組（Mosapride），PCO低劑量組（PCOL），PCO高劑量組（PCOH），每組8只。Control和FD組給予0.5%CMC-Na， Mosapride組每只鼠每日給予1.35 mg/kg莫沙必利，PCOL，PCOH組每只鼠每日分別給予100 mg/kg，400 mg/kg的PCO（以陳皮揮發(fā)油和廣藿香揮發(fā)油為原料，1：1混合溶于0.5% CMC-Na，即得PCO）。給藥7 d。

2.3 胃排空率和腸推進(jìn)率檢測(cè)

最后一次給藥后，禁食不禁水24 h。每只大鼠灌胃3 mL半固態(tài)營(yíng)養(yǎng)糊（10 g羧甲基纖維素鈉、16 g奶粉、8 g淀粉、2 g活性炭溶解于250 mL蒸餾水）[23]。30 min后，用2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取腹主動(dòng)脈采血。測(cè)量胃排空（gastric emptying rate， GER）時(shí)，取下整個(gè)胃，用濾紙擦干水分，稱重，記錄胃的總重量。然后切開胃，用冰生理鹽水沖洗胃內(nèi)容物，擦干水分，記錄胃的凈重。

GER（%）=[1-（胃總重量-胃凈重量）/灌胃量]×100%（1）

測(cè)量腸推進(jìn)（intestinal propulsion rate， IPR）時(shí)，將小腸（幽門至回盲部段）切除并展開，不需牽引。測(cè)量幽門至回盲腸和幽門至半固態(tài)糊前的總長(zhǎng)度。計(jì)算IPR。

IPR%=（半固態(tài)膏體推進(jìn)長(zhǎng)度/小腸總長(zhǎng)度）×100%（2）

2.4 Hamp;E 染色

采用蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠胃組織形態(tài)學(xué)特征。將大鼠胃竇組織用4%多聚甲醛固定，脫水、包埋、切片、染色，封片。數(shù)字病理掃描儀掃描后觀察胃竇組織形態(tài)。

2.5 PCO對(duì)大鼠胃竇平滑肌條運(yùn)動(dòng)活動(dòng)及其作用受體的影響

頸椎脫位處死大鼠。取胃，使用冰Krebs緩沖液進(jìn)行沖洗，沿胃大彎切開，取胃竇環(huán)形肌，約8 mm ×2 mm。平衡后分別加入氯化乙酰膽堿、5-羥基色胺（5-hydroxy tryptamine， 5-HT）、鹽酸酚妥拉明、溴化六甲銨、鹽酸普萘洛爾和硫酸阿托品（10-4 mol/L，使用純水進(jìn)行配制）。用肌張力傳感器測(cè)量并記錄肌條的收縮曲線。

2.6 免疫組化

取大鼠胃竇組織，使用多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、包埋、切片、免疫組織化學(xué)染色、封片，數(shù)字病理掃描儀采集圖像。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)200倍視野，使用Image J軟件計(jì)算出每個(gè)視野的平均光密度值，取3個(gè)視野的平均值用于分析胃竇組織c-kit蛋白的表達(dá)。

2.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

取腹主動(dòng)脈血，4 ℃， 3000 r/min離心15 min，收集血清，保存在-80 ℃冰箱中。使用ELISA試劑盒測(cè)定血清胃動(dòng)素（motilin， MTL）、胃泌素（gastrin， GAS）、胃饑餓素（ghrelin）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal polypeptide， VIP）和5-HT水平。

2.8 定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）

取保存于-80 ℃冰箱中的大鼠胃竇組織，按照試劑盒的說明，在RNase-free環(huán)境提取總RNA。使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。引物序列見表1。采用基于SYBR的定量PCR檢測(cè)基因擴(kuò)增情況。PCR擴(kuò)增循環(huán)包括以下步驟：50 ℃ 2 min，

95 ℃ 2 min，然后95 ℃ 15 s， 60 ℃ 15 s， 72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）作為內(nèi)參。

2.9 蛋白質(zhì)免疫印跡法（western blotting）

取保存于-80 ℃冰箱中的胃竇組織，使用RIPA緩沖液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑裂解大鼠胃竇組織，獲得蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)過上樣、SDS-PAGE電泳、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜、封閉（用5% w/v脫脂奶粉）、孵育一抗（4 ℃搖床過夜）、TBST洗脫3次（每次10 min）、孵育二抗（室溫1 h）、再用TBST洗脫3次（每次10 min），最后使用ECL進(jìn)行顯影，記錄條帶數(shù)據(jù)。使用Image J軟件分析條帶的灰度值，并歸一化。

2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析與處理，均用x±s（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）予以表示，使用GraphPad Prism 9.0對(duì)各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。Plt;0.05認(rèn)為數(shù)據(jù)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 PCO對(duì)大鼠的體重、胃排空率和腸推進(jìn)率的影響

造模期間，模型組大鼠毛發(fā)稀疏、嗜睡、動(dòng)作遲緩、體重增加減慢。PCO處理后，大鼠體重顯著增加（圖1A）。另外，GER和IPR在FD大鼠PCO治療后顯著增加（圖1A）。組織病理學(xué)檢查顯示各組胃竇組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整清晰 （圖1B）。由此可見，PCO可恢復(fù)FD大鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)功能，其中PCOL的作用最為顯著。

3.2 PCO對(duì)胃竇肌張力的影響及其機(jī)制研究

各組大鼠離體胃竇環(huán)形肌條收縮幅度測(cè)量顯示，與Control相比，模型組的平均收縮幅度（mean），最大幅度（max）和最低收縮幅度（min）均降低（Plt;0.05）。與FD組相比，PCO和Mosapride處理后均能提高大鼠胃竇環(huán)形肌收縮幅度，其中PCO收縮幅度顯著提高（Plt;0.05）（圖2）。

為探討PCO調(diào)節(jié)胃竇平滑肌張力的作用受體，往已平衡的肌條中分別加入乙酰膽堿、5-羥色胺、硫酸阿托品、六甲溴銨、鹽酸酚妥拉明和鹽酸普萘洛爾。比較各試劑加入前后胃竇平滑肌收縮幅度的均值、最大值和最小值（CE-mean、CE-max、CE-min）。

結(jié)果表明，與FD組相比，PCO能夠增強(qiáng)離體胃竇平滑肌的自發(fā)收縮；與FD組相比，給予ACh后，PCO組的收縮幅度和效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)；加入煙堿型乙酰膽堿受體阻滯劑溴化六甲銨后，PCO組整體呈現(xiàn)出舒張作用，而給予毒蕈堿受體阻滯劑阿托品后，PCO組的舒張效果低于FD組，表明PCO給藥后能夠一定程度上抑制拮抗阿托品和溴化六甲銨的作用，表明PCO中存在與ACh結(jié)構(gòu)相似的成分，能夠促進(jìn)平滑肌收縮。加入酚妥拉明阻斷α受體后，PCO組收縮效應(yīng)整體減弱，但是強(qiáng)于FD組，表明PCO能夠一定程度上拮抗10-4 mol/L酚妥拉明引起的胃腸平滑肌收縮作用，舒張胃腸平滑肌。除此之外，加入非選擇性β腎上腺素受體阻滯劑普萘洛爾后，PCO組收縮效應(yīng)強(qiáng)于FD組，表明PCO能夠激活β2受體，能夠一定程度上拮抗10-4 mol/L普萘洛爾的作用，引起平滑肌舒張。而加入10-4 mol/L 5-HT后，PCO表現(xiàn)出與mosapride一樣的效果，通過作用于5-HT受體促進(jìn)胃腸平滑肌收縮。

由此可見，PCO能夠作用于乙酰膽堿受體、β-腎上腺素能受體和5-HT受體共同調(diào)節(jié)平滑肌舒張和收縮，在一定程度上能夠糾正FD大鼠離體胃竇環(huán)形肌的紊亂收縮（圖3～4）。

3.3 PCO對(duì)大鼠胃竇c-kit表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)D組胃竇c-kit表達(dá)水平明顯低于Control組。在PCO治療后，PCOL組大鼠胃竇c-kit表達(dá)水平明顯升高。提示PCOL可改善大鼠胃竇c-kit的表達(dá) （圖5A）。

3.4 PCO對(duì)MTL、GAS、Ghrelin、VIP和5-HT水平的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)D大鼠血清MTL、GAS、Ghrelin水平顯著降低，VIP、5-HT水平顯著升高。與FD組相比，PCOL組MTL、GAS、Ghrelin水平顯著升高，VIP、5-HT水平顯著降低。此外，PCOL組對(duì)胃動(dòng)力的恢復(fù)作用強(qiáng)于PCOH組（圖5B）。

3.5 PCO對(duì)胃竇降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide， CGRP） mRNA表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果顯示，F(xiàn)D大鼠胃竇CGRP mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，而PCO處理后能夠降低CGRP mRNA表達(dá)水平，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，PCOH組CGRP mRNA表達(dá)水平較FD組顯著降低，結(jié)果見圖6。

3.6 PCO對(duì)p62、Beclin1和LC3表達(dá)的影響

為探討PCO對(duì)自噬的影響，檢測(cè)p62、Beclin1和LC3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，PCO處理增加了p62的表達(dá)，抑制了Beclin1的表達(dá)，抑制了LC3I向LC3II的轉(zhuǎn)化。這說明PCO治療可以抑制過度自噬，將自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)到正常水平（圖7）。

4 討論

FD是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，其典型的病理特征是由胃運(yùn)動(dòng)障礙引起的遲發(fā)性胃排空障礙，導(dǎo)致早飽、反流、腹痛或腹脹等癥狀。中醫(yī)認(rèn)為可以通過使用健脾理氣藥起到理氣促進(jìn)消化來緩解這些病理癥狀，如疏肝和胃湯聯(lián)合莫沙必利片治療功能性消化不良伴焦慮及抑郁狀態(tài)患者有效率為89.06%[24]；加味香砂六君子湯可以減輕患者臨床癥狀，改善患者胃腸功能[25]；陳皮茯苓粥能夠提升患者的睡眠質(zhì)量，降低焦慮、抑郁評(píng)分[26]。在理氣和中、健脾疏肝的藥方中，廣藿香與陳皮作為健脾化濕藥對(duì)配伍比例多為1：1。現(xiàn)代藥理研究表明，廣藿香揮發(fā)油、陳皮揮發(fā)油具有一定促進(jìn)胃腸活動(dòng)、保護(hù)胃黏膜的作用[11-13] ，所以本次研究中選用廣藿香和陳皮揮發(fā)油進(jìn)行1：1配伍研究其藥效和作用機(jī)制。

胃竇作為胃腸道運(yùn)動(dòng)起搏部位，增強(qiáng)胃竇的收縮能力可以有效促進(jìn)消化。胃腸道平滑肌上存在許多受體，如乙酰膽堿受體、腎上腺素α和β受體、5-HT受體等，刺激這些受體可引起平滑肌的收縮或抑制，例如激動(dòng)乙酰膽堿受體可誘導(dǎo)平滑肌收縮[14]，而M受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑阿托品可抑制胃腸運(yùn)動(dòng)[27]。β受體的激動(dòng)可導(dǎo)致平滑肌舒張和胃運(yùn)動(dòng)障礙[28]。α受體的刺激對(duì)胃腸道平滑肌收縮能力的影響較小[29]。5-HT受體激動(dòng)劑已被用于治療胃腸運(yùn)動(dòng)障礙[30]。本研究結(jié)果顯示，PCO中存在與ACh結(jié)構(gòu)相似的成分，能夠促進(jìn)平滑肌收縮，只是可能由于PCO或者ACh給藥量的不合適，導(dǎo)致結(jié)果并不十分顯著，以后可以通過調(diào)整給藥量來進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)結(jié)果；PCO與mosapride表現(xiàn)一致，能夠通過激活5-HT受體促進(jìn)胃竇平滑肌收縮；除此之外，PCO還能通過激動(dòng)α和β受體，舒張平滑肌。PCO對(duì)胃竇平滑肌調(diào)節(jié)呈現(xiàn)如此復(fù)雜的作用，可能其復(fù)雜的成分構(gòu)成有關(guān)。但是同時(shí)也是由于多成分的特點(diǎn)，才能在胃腸動(dòng)力調(diào)節(jié)中達(dá)到平衡。

FD是一種典型的腦-腸交互障礙疾病。BGP在腦-腸軸交互中發(fā)揮著重要作用，是重要的物質(zhì)基礎(chǔ)和靶點(diǎn)，能有效維持和調(diào)節(jié)胃腸功能[31-34]。MTL、GAS和Ghrelin都是興奮性BGP，能刺激胃酸分泌，促進(jìn)胃腸收縮，加速胃排空[35-37]。VIP是一種抑制性BGP，分泌增加會(huì)抑制胃排空和腸道運(yùn)動(dòng)[16]。除此之外， Ghrelin能夠穿過血腦屏障，影響控制焦慮和壓力的大腦區(qū)域，調(diào)節(jié)抑郁和恐懼狀態(tài)[38-39]。5-HT則在調(diào)整胃腸動(dòng)力及腸道敏感性方面都起著重要作用[40]，5-HT水平升高能夠增強(qiáng)胃動(dòng)力，但是同時(shí)也會(huì)增加內(nèi)臟超敏性[41-42]，增強(qiáng)疼痛感。而CGRP也與內(nèi)臟超敏反應(yīng)引起的不適高度相關(guān)[43]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PCO治療可提高M(jìn)TL、GAS、Ghrelin水平，降低VIP、5-HT水平，促進(jìn)胃排空，同時(shí)也降低了胃竇CGRP mRNA的表達(dá)水平，減輕了內(nèi)臟超敏反應(yīng)。

越來越多的研究顯示，F(xiàn)D與自噬的過度發(fā)生密切相關(guān)[44]。細(xì)胞自噬作為一種清除細(xì)胞中受損細(xì)胞器和大分子的動(dòng)態(tài)循環(huán)機(jī)制，可以促進(jìn)細(xì)胞更新和能量循環(huán)[45]。然而過度自噬會(huì)引起細(xì)胞過度死亡和清除，影響其參與的生理過程。PCO給藥后能夠引起自噬小體膜上下游自噬相關(guān)蛋白Beclin1和標(biāo)志性蛋白LC3的表達(dá)下降，以及自噬底物蛋白p62的表達(dá)增加，表明其能夠抑制過度自噬的發(fā)生。

綜上所述，PCO可以通過調(diào)節(jié)BGPs水平、ICC過度自噬和胃竇乙酰膽堿、腎上腺素受體和5-HT受體，這3方面結(jié)合作用恢復(fù)胃節(jié)律性運(yùn)動(dòng)和正常蠕動(dòng)，改善胃動(dòng)力障礙和內(nèi)臟超敏性，從而起到治療FD的作用。本研究的局限在只是對(duì)PCO在FD治療中的作用和機(jī)制進(jìn)行了初步探索，其中PCOL組各項(xiàng)表現(xiàn)較好，而PCO的最佳配比和更詳細(xì)的機(jī)制需要進(jìn)一步研究才能確定。

參 考 文 獻(xiàn)

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