組合代謝工程改造提高生物除草劑thaxtomin A的產(chǎn)量

摘要：以thaxtomin A產(chǎn)生菌酸性瘡痂鏈霉菌S8為出發(fā)菌株，利用組合代謝工程的方法，通過增加S-腺苷甲硫氨酸還原酶MetK和途徑特異性正調(diào)控因子TxtR的基因拷貝數(shù)，使用組成型kasOp*啟動(dòng)子和RBS核糖體結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建了txtR和metK單基因以及兩基因共表達(dá)的重組質(zhì)粒。通過接合轉(zhuǎn)移的方法將質(zhì)粒整合至菌株基因組，篩選獲得陽(yáng)性基因工程菌。對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示菌株thaxtomin A的發(fā)酵單位比出發(fā)菌株分別提高了105%、38%和154%。組合表達(dá)調(diào)控元件和txtR和（或）metK基因的遺傳改造可顯著促進(jìn)菌株thaxtomin A的生物合成。

關(guān)鍵詞：生物除草劑；Thaxtomin A；酸性瘡痂鏈霉菌；txtR；metK

中圖分類號(hào)：R9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Combinatorial metabolic engineering modifications to improve the yield of the bioherbicide thaxtomin A

Wang Bing， Xu Dongmei， Chen Lixia， Zhang Lintao， and Li Mengyao

（Hebei Vocational University of Industry Technology， Shijiazhuang 050091）

Abstract Streptomyces acidscabies S8， a thaxtomin A-producing strain， was used as the starting strain. By increasing the gene copy number of S-adenosine methionine reductase MetK and positive regulatory factor TxtR， using the constitutive promoter element kasOp* and ribosome binding site （RBS）， respectively， the combinational metabolic engineering method was applied to construct the recombinant plasmides of txtR， metK and their co-expression. The plasmids were integrated into the genome of the strain by conjugation transfer， and the positive genetically engineered bacteria were screened. The fermentation products were analyzed by HPLC， and the results showed that the fermentation units of thaxtomin A were increased by 105%， 38% and 154%， respectively. The combination of gene expression regulatory elements and the genetic modification of txtR and （or） metK could significantly improve the biosynthesis of thaxtomin A.

Key words Bioherbicides; Thaxtomin A; Streptomyces acidscabies; txtR; metK

Thaxtomin是由酸性瘡痂鏈霉菌（Streptomyces acidscabies）等植物病原菌[1]產(chǎn)生的哌嗪二酮類化合物，具有抑制植物細(xì)胞壁生長(zhǎng)的作用，與已知纖維素合酶抑制劑異草胺（isoxaben）在患病植物組織中的表現(xiàn)類似，但其具體靶位點(diǎn)仍是未知的[2-4]。2014年該類化合物被美國(guó)環(huán)境保護(hù)局（U.S. Environmental Protection Agency， EPA）批準(zhǔn)用于多種農(nóng)作物的除草劑[5]，但是至今為止thaxtomin還未大規(guī)模使用，一個(gè)主要的原因是菌株發(fā)酵水平整體較低，使得成本較高。

目前，thaxtomin A的基因簇及生物合成途徑已經(jīng)得到解析，基因簇長(zhǎng)約18 kb，包含7個(gè)基因txtR、txtA、txtB、txtE、 txtD、txtC和txtH（圖1A）。研究發(fā)現(xiàn)，thaxtomin A的生物合成首先是L-4-硝基色氨酸底物（L-4-nitrotryptophan）的合成，即TxtD催化精氨酸發(fā)生氧化反應(yīng)，生成一氧化氮（NO）和瓜氨酸（citrulline）[6]，然后TxtE催化生成的NO和色氨酸反應(yīng)，生成L-4-硝基色氨酸[7]。其次，NRPS合成酶TxtA和TxtB以苯丙氨酸和4-硝基色氨酸為前體，催化合成2，5-二酮哌嗪化合物thaxtomin D[8]。最后，細(xì)胞色素P450酶TxtC負(fù)責(zé)對(duì)thaxtomin D進(jìn)行結(jié)構(gòu)上修飾，最終獲得產(chǎn)物thaxtomin A[9-10]。經(jīng)信息學(xué)分析txtH編碼蛋白屬于MbtH-like protein（MLP）家族，對(duì)該基因進(jìn)行缺失突變，會(huì)顯著降低菌株thaxtomin A的產(chǎn)生[11]。研究發(fā)現(xiàn)TxtR為正調(diào)控因子，其經(jīng)纖維二糖激活后可大幅提高thaxtomin A基因簇的轉(zhuǎn)錄水平[12]。此外，在thaxtomin A的分子結(jié)構(gòu)中含有二個(gè)甲基，猜測(cè)其同阿維菌素結(jié)構(gòu)中甲基的合成類似，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，而研究證實(shí)過表達(dá)S-腺苷甲硫氨酸還原酶基因metK可顯著提高阿維菌素的產(chǎn)量[13]。

本研究以產(chǎn)thaxtomin A的酸性瘡痂鏈霉菌為出發(fā)菌株，以正調(diào)控基因txtR和S-腺苷甲硫氨酸還原酶基因metK為研究對(duì)象，通過遺傳操作手段將靶基因與組成型啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及整合型表達(dá)質(zhì)粒等功能元件進(jìn)行重組，構(gòu)建并篩選高表達(dá)基因工程菌，通過對(duì)菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行HPLC檢測(cè)，評(píng)估thaxtomin A的產(chǎn)生情況，為后期深入的組合代謝工程改造提高菌株發(fā)酵單位提供科學(xué)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，更希望通過一步步的科研實(shí)踐逐漸找到提高thaxtomin產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的最優(yōu)途徑方法途徑。

1 材料

1.1 菌株與質(zhì)粒

酸性瘡痂鏈霉菌菌株S8（S. acidscabies S8）、Escherichia coli菌株、質(zhì)粒等見表1。

1.2 酶、試劑以及引物等

限制性內(nèi)切酶、pfu高保真酶、T4 DNA連接酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等購(gòu)自北京全式金生物公司，Gibson無縫克隆試劑盒等均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。Ampicillin、apramycin、chloramphenicol、kanamycin、nalidixic acid及thaxtomin A標(biāo)準(zhǔn)品等均購(gòu)自Sigma公司。核苷酸引物合成由金唯智生物科技有限公司合成，DNA測(cè)序由博邁德基因有限公司完成。

LB培養(yǎng)基參照分子克隆手冊(cè)[15]配制。TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.5%、大豆蛋白胨0.5%、NaCl 0.5%、pH7.2。種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.5%、大豆蛋白胨0.5%、NaCl 0.5%、pH7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基：燕麥1%、pH自然。2×孢子預(yù)萌發(fā)液：Difco酵母膏（10%）、Difco酪蛋白氨基酸（1%）、CaCl2 （0.01 mol/L）。2×YT培養(yǎng)基：Tryptone （16 g）、Yeast extract （10 g）、NaCl（5 g），加水至1 L。

1.3 主要儀器

高壓滅菌鍋（上海醫(yī)用核子儀器廠， YXQ-SG41-280），MG96+PCR儀（京孚， 上海），DYY-16D電泳儀（北京六一儀器），凝膠成像儀（美國(guó)伯樂Bio-Rad），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化儀器廠，SW-CJ-1B），全溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)THZ-C-1）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（精誠(chéng)儀器，JC-100-SE）、安捷倫高效液相色譜 （1260 Infinity II），ZMD Micromass質(zhì)譜（Waters），10 μm Diamonsil C18柱（Dikma），冷凍高速離心機(jī)（Thermo）。

2 方法

2.1 引物合成

普通PCR引物參照基因序列設(shè)計(jì)，無縫克隆及overlap引物設(shè)計(jì)參照Gibson無縫克隆試劑盒說明書及Ho[16]等方法，同時(shí)兼用Generuner軟件設(shè)計(jì)，所用引物見表2。

2.2 Gibson無縫克隆操作過程

（1）采用雙酶切將環(huán)形質(zhì)粒線性化；（2）使用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行目的DNA片段的PCR擴(kuò)增；（3）將目的DNA片段和線性化質(zhì)粒以摩爾比2：1加到試管中進(jìn)行重組反應(yīng)（反應(yīng)液15 μL、線性化質(zhì)粒0.5 μL、PCR片段2.5 μL、kasOp*-RBS-gapdh片段約6 μL、無菌超純水6 μL）；50 ℃孵育15 min，然后冰置。然后使用5 μL反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，通過抗性篩選獲得含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序驗(yàn)證獲得目的質(zhì)粒。詳見無縫克隆試劑盒說明書（Seamless Cloning Kit，D7010M）。

2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法

利用含有20 bp重疊的引物對(duì)，通過over-lap PCR[16]擴(kuò)增獲得“啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)”DNA片段，即含有kasOp*[17]和RBS[18]相關(guān)DNA片段。PCR反應(yīng)條件為95 ℃，5 min；（95 ℃，10 s；60 ℃，10 s；72 ℃，5 s）15循環(huán)；72 ℃，10 min。線性質(zhì)粒通過Xba I和BamH I雙酶切pSET152獲得。

2.3.1 重組質(zhì)粒pSET152txtR的構(gòu)建（圖2A）

以thaxtomin A菌株基因組DNA為模板，使用引物對(duì)txtRF/txtRR，通過高保真PCR擴(kuò)增獲得txtR基因片段；使用重疊的引物對(duì)txtRF1/txtRR1，通過overlap PCR擴(kuò)增獲得kasOp*-RBS-gapdh（EL）片段。將txtR基因片段、kasOp*-RBS-gapdh（EL）片段和線性質(zhì)粒pSET152片段進(jìn)行無縫克隆，獲得重組質(zhì)粒pSET152txtR。

2.3.2 重組質(zhì)粒pSET152metK的構(gòu)建（圖2B）

以阿維鏈霉菌基因組DNA為模板，使用引物對(duì)metKF/metKR，高保真PCR擴(kuò)增獲得S-腺苷甲硫氨酸還原酶metK基因片段。使用重疊的引物對(duì)txtRF1/metKR1，通過overlap PCR獲得kasOp*-RBS-gapdh（SG）片段。將metK基因片段、kasOp*-RBS-gapdh（SG）片段以及線性質(zhì)粒pSET152片段進(jìn)行無縫克隆，獲得重組質(zhì)粒pSET152metK。

2.3.3 重組質(zhì)粒pSET152txtR-metK的構(gòu)建（圖2C）

以重組質(zhì)粒pSET152txtR為DNA模板，使用引物對(duì)VF1/VR1，經(jīng)普通PCR擴(kuò)增獲得線性重組質(zhì)粒；以重組質(zhì)粒pSET152metK為模板，使用引物對(duì)metKF2/metKR2，經(jīng)普通PCR擴(kuò)增獲得kasOp*-RBS-gapdh（SG）-metK片段，然后經(jīng)無縫克隆操作將兩片段組裝，獲得重組質(zhì)粒pSET152txtR-metK。

2.4 遺傳轉(zhuǎn)化

參照分子克隆手冊(cè)[15]用CaCl2法制備大腸埃希菌感受態(tài)，堿裂解法提取質(zhì)粒。鏈霉菌基因組的小量提取、重組質(zhì)粒等在大腸埃希菌和鏈霉菌間的接合轉(zhuǎn)移參照鏈霉菌遺傳操作手冊(cè)[19]進(jìn)行。將構(gòu)建好的3個(gè)重組質(zhì)粒（圖2）以及pSET152（對(duì)照質(zhì)粒）分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌ET12567/pUZ8002感受態(tài)，通過大腸埃希菌與鏈霉菌的屬間接合轉(zhuǎn)移將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入S. acidscabies S8宿主細(xì)胞，經(jīng)安普霉素（Apr）抗性篩選獲得陽(yáng)性克隆，對(duì)轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，確認(rèn)后獲得目標(biāo)基因工程菌。

2.5 Thaxtomin A的發(fā)酵及HPLC檢測(cè)

基因工程菌發(fā)酵：將酸瘡痂鏈霉菌的3個(gè)重組菌R、K、RK和NC陰性對(duì)照菌進(jìn)行平板劃線，28 ℃培養(yǎng)7～10 d左右產(chǎn)孢。然后取少量孢子接種于50 mL種子培養(yǎng)基，28 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h制成種子液，以2%接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)8 d后，終止發(fā)酵。

發(fā)酵液預(yù)處理：取發(fā)酵液1.0 mL中加入4.0 mL甲醇，浸泡30 min，12000 r/min離心2 min，取上清用0.22 μmol/L濾膜過濾，制得待檢樣品。

HPLC檢測(cè)：采用安捷倫5 μm C18反相柱（4.6 mm×

250 mm），上樣量20 μL，以柱溫40 ℃、乙腈-水

（4： 6， V/V）為流動(dòng)相、流速1.0 mL/min條件下分離目標(biāo)產(chǎn)物，約4.4 min左右出峰，在380 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)目標(biāo)峰。將thaxtomin A標(biāo)準(zhǔn)品以甲醇溶解為25～200 μg/mL梯度的溶液，制作濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，將目標(biāo)產(chǎn)物的峰面積通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法轉(zhuǎn)換獲得產(chǎn)物的發(fā)酵單位。

3 結(jié)果與分析

3.1 基因工程菌的構(gòu)建

利用“2.1”所述方法設(shè)計(jì)引物，通過PCR克隆獲得目的DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3），kasOp*-RBS為87 bp的特異性DNA片段（圖3，條帶1），txtR基因片段為834 bp的特異性DNA片段（圖3，條帶2），metK基因片段為1209 bp的特異性DNA片段（圖3，條帶3），通過瓊脂糖凝膠試劑盒回收目的DNA片段送公司測(cè)序。

將測(cè)序正確DNA片段，按照“2.3”所述方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pSET152txtR、pSET152metK、pSET152txtR-metK。通過接合轉(zhuǎn)移的方法（見“2.4”）將3個(gè)重組質(zhì)粒和1個(gè)對(duì)照質(zhì)粒pSET152分別導(dǎo)入宿主菌S. acidscabies S8細(xì)胞，整合至菌株基因組，經(jīng)過安普霉素抗性篩選獲得陽(yáng)性基因工程菌R、K、RK和NC。

3.2 Thaxtomin A的HPLC檢測(cè)與分析

按照2.5所述方法對(duì)發(fā)酵樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，與出發(fā)菌株（S. acidscabies S8）相比，txtR過表達(dá)菌株、metK過表達(dá)菌株以及兩基因共表達(dá)菌株，經(jīng)發(fā)酵后thaxtomin A的發(fā)酵單位均出現(xiàn)明顯的提高。其中，出發(fā)菌株、過表達(dá)txtR菌株、過表達(dá)metK菌株以及共表達(dá)txtR和metK菌株分別用S8、R、K、RK表示，其中NC為陰性對(duì)照，S為標(biāo)準(zhǔn)品。

按照“2.5”所述的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各重組菌株thaxtomin A的發(fā)酵單位。結(jié)果顯示，出發(fā)菌株S8、過表達(dá)txtR菌株R、過表達(dá)metK菌株K，以及共表達(dá)txtR和metK菌株RK經(jīng)過發(fā)酵后，thaxtomin A的產(chǎn)量分別為187、383、258和476 g/L。其中，重組菌株的發(fā)酵單位分別比出發(fā)菌株提高了105%、38%和154%（圖5），說明txtR和metK基因在基因組上經(jīng)過多拷貝、組成型表達(dá)后，促進(jìn)了thaxtomin A的產(chǎn)生。從圖上可以看出兩基因共表達(dá)菌株thaxtomin A的發(fā)酵單位要比單一基因高表達(dá)菌株高，兩基因在thaxtomin A的生物合成過程中可能存在協(xié)同增效的作用。

4 總結(jié)與討論

基因表達(dá)水平的優(yōu)化是代謝工程設(shè)計(jì)過程的重要組成部分，對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件，如啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）進(jìn)行優(yōu)選，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝過程的優(yōu)良控制。kasOp*是近年來在鏈霉菌中使用頻率很高的啟動(dòng)子，來自天藍(lán)色鏈霉菌，負(fù)責(zé)啟動(dòng)kasO基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。2013年，Wang等[17]通過對(duì)天然啟動(dòng)子進(jìn)行隨機(jī)突變，篩選獲得kasOp*，其活性強(qiáng)于廣泛使用的紅霉素組成型啟動(dòng)子ermEp*。核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosome binding site， RBS）是實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)精細(xì)調(diào)控的生物控制元件，Zhang等[18]通過機(jī)器學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)、構(gòu)建并測(cè)試了450個(gè)RBS變體，獲得了翻譯起始效率提升34%的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，可見其在微生物代謝工程和合成生物學(xué)中具有廣泛的研究及應(yīng)用。優(yōu)化的啟動(dòng)子和RBS序列，為提高thaxtomin菌株的產(chǎn)量提供了優(yōu)越的調(diào)控基礎(chǔ)。為了獲得發(fā)酵產(chǎn)量提高的基因工程菌，選擇kasOp*啟動(dòng)子[19]、RBS序列[20]以及pSET152載體構(gòu)建重組質(zhì)粒[14]。從圖1可以看出，thaxtomin A結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)甲基基團(tuán)，因此本課題選擇常用的阿維鏈霉菌中S-腺苷甲硫氨酸還原酶基因作為DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。而TxtR為出發(fā)菌株thaxtomin A生物合成的正調(diào)控因子。因此，選擇兩基因進(jìn)行多拷貝重組菌株的構(gòu)建。

對(duì)thaxtomin A產(chǎn)量提高的相關(guān)研究廣泛而深入，2015年Francis等[21]發(fā)現(xiàn)txtB基因內(nèi)和txtA與txtR基因之間的間隔區(qū)，分別含有一個(gè)CebR的操縱序列cebO，CebR通過特異性結(jié)合在cebO位點(diǎn)抑制了相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。2019年Alkhalaf等[22]以S. scabies 97.22為出發(fā)菌，通過敲除cebR獲得了比野生菌產(chǎn)量高6倍左右的thaxtomin A突變株。在遺傳背景清晰的異源宿主中表達(dá)thaxtomin基因簇，同時(shí)結(jié)合基因簇的啟動(dòng)子優(yōu)化，可實(shí)現(xiàn)thaxtomin產(chǎn)量的提升。Zhao等[23]通過用強(qiáng)啟動(dòng)子替換原生啟動(dòng)子，大規(guī)模地改變了thaxtomin A基因簇中啟動(dòng)子的強(qiáng)度，得到27個(gè)重構(gòu)基因簇，經(jīng)過異源宿主表達(dá)后使thaxtomin A的產(chǎn)量大幅提升到504.6 μg/mL。通過人為添加信號(hào)分子等物質(zhì)可以干預(yù)抗生素的生物合成，Zhao等[24]設(shè)計(jì)了一套由胞質(zhì)外功能（ECF） sigma因子17及其同源啟動(dòng)子Pecf17構(gòu)成的ECF17轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，將其引入異源宿主菌S. venezuelae ISP5230和S. albus J1074中顯著提高了thaxtomin A的發(fā)酵單位。2019年，婁春波等[25]通過將基因簇進(jìn)行異源表達(dá)，改造啟動(dòng)子等方法提高thaxtomin的發(fā)酵產(chǎn)量。Li等[26]通過異源表達(dá)、抑制因子失活、激活因子過表達(dá)等對(duì)S. albidoflavus J1074菌株進(jìn)行改造，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后獲得比出發(fā)菌高出約36倍的thaxtomin發(fā)酵單位。

本論文為以產(chǎn)thaxtomin A突變菌S. acidscabies S8為出發(fā)菌株，通過重組kasOp*強(qiáng)啟動(dòng)子和高效的RBS片段，構(gòu)建了txtR和（或）metK高效表達(dá)的重組質(zhì)粒，通過遺傳改造的基因工程菌均顯著提升了thaxtomin A的發(fā)酵單位，且協(xié)同作用明顯，這為后期對(duì)菌株進(jìn)行組學(xué)研究，闡釋遺傳背景，利用合成生物學(xué)等技術(shù)手段進(jìn)行深入的組合代謝工程改造，提高產(chǎn)物發(fā)酵單位提供了優(yōu)良的物質(zhì)材料和科學(xué)數(shù)據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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