冷藏血小板輸注后的清除機制*

王璐 姚春艷

全球大部分血液中心均對采集的血小板產品采用（22±2）℃持續(xù)振搖的方式進行儲存，由于不可避免的細菌污染及其他相關因素的限制，血小板的儲存時間一般為3～7 d[1,2]。（22±2）℃儲存條件下，血小板的糖酵解過程增強、線粒體功能降低，細胞內葡萄糖消耗、乳酸堆積、產物酸化，最終導致血小板的生理功能降低。此外，血小板的聚集過程需要消耗能量，代謝減弱導致的腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）生成下降也會降低血小板的聚集能力[3]。常溫保存條件下，細菌生長風險與血小板儲存損傷都極大地限制了血小板的儲存時間，導致血小板資源的浪費，增加獻血者的招募壓力，這在全球范圍內都是一個嚴峻的問題[4]。

血小板在4℃條件下儲存可以延緩細菌生長，降低與存儲相關的血小板激活、葡萄糖消耗和乳酸堆積，有效保持血小板的聚集功能[5]，具有延長儲存時間和減少輸血后感染的優(yōu)勢。已有研究表明，冷藏儲存20 d的血小板與（22±2）℃儲存7 d的血小板的葡萄糖水平相當，在代謝參數(shù)上也具有一定的可比性[6]。研究人員一致認為，與（22±2）℃儲存的血小板相比，4℃儲存的血小板產品顯示出更好的pH穩(wěn)定性，低糖酵解率，和對二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、腎上腺素或膠原刺激的良好反應性，這都表明冷藏血小板具有更好的功能性[7]。在血小板減少癥患者中，輸注4℃冷藏48～72 h血小板的患者，63%的患者輸注后出血時間縮短，而輸注（22±2）℃儲存48～72 h血小板的患者，僅26%的患者輸注后出血時間得到改善，表明與室溫儲存血小板相比低溫儲存血小板能更有效地減少出血時間[8]。

（22±2）℃儲存的血小板在輸注到人體之后會面臨被機體清除，介導這種清除的關鍵是金屬蛋白酶ADAM17裂解GPIbα的Gly464-Val465鍵導致其胞外結構域脫落[9]。通過抑制金屬蛋白酶的活性能夠有效阻止血小板的清除[10]。與（22±2）℃儲存血小板相比，低溫儲存（1℃～6℃）血小板在體內的存活率顯著降低[11]。雖然冷藏導致血小板輸注后清除也與GPIbα密切相關，但具體的清除機制卻有所不同。冷藏后的血小板其表面糖蛋白GPIbα發(fā)生聚集，暴露出β-N-乙酰葡萄糖氨基殘基（β-N-GLcNAC）與半乳糖殘基，在輸注后易被肝細胞和巨噬細胞識別，從而導致清除。同時低溫會導致血小板儲存損傷，使血小板的形態(tài)從圓盤狀轉變?yōu)榍蝮w，并伴有偽足的伸出[12-13]。低溫還會誘導血小板外膜糖蛋白（GPIb、GPⅨ、GPⅡb和GPⅣ）豐度的降低，并導致高親合力整合素（αⅡbβ3和β1）以及活化和凋亡標記物（如CD62P、CD63和磷脂酰絲氨酸）的表達增加[14]。低溫儲存血小板還伴隨著α顆粒的釋放和P-選擇素的暴露，這都與血小板輸注后的快速清除密切相關[7]。另一方面，冷藏使血小板的凋亡信號通路發(fā)生改變，被激活的凋亡信號會導致血小板輸注后被不斷地清除，這些因素都極大地限制了冷藏血小板的推廣使用。目前已有大量文獻對冷藏血小板輸注后的清除機制進行了相關研究，本文就現(xiàn)有的研究成果進行總結，做一簡要綜述。

1 冷藏血小板輸注后的清除機制

1.1 去唾液酸化介導的血小板清除：血小板的GPIbα是一種Ⅰ型跨膜蛋白，是形成GPIb-Ⅸ復合物的主要亞單位，其胞外結構域由N-聚糖和O-聚糖修飾并被唾液酸覆蓋，高度糖基化的N端胞外結構域是多種配體（如血管性血友病因子、整合素αMβ2和凝血酶）的功能受體[15-17]。血管性血友病因子（von Willebrand Factor, vWF）是一種多聚體蛋白，存在于血漿、血小板和內皮細胞中。vWF的A1結構域中含有GPIb-Ⅸ-V復合體中GPIbα亞單位的結合位點[18,19]。在靜態(tài)或正常流動條件下，vWF中的A1結構域處于屏蔽狀態(tài)，以阻止其與血小板GPIbα膜蛋白結合。在高剪切力的情況下，vWF經(jīng)歷形態(tài)變化，暴露出與GPIbα相結合的A1結構域[20,21]。靜息血小板中存在唾液酸酶，冷藏后唾液酸酶活性上調，將膜糖蛋白胞外區(qū)的唾液酸殘基水解，暴露出倒數(shù)第二位的半乳糖[22,23]，即血小板糖蛋白的去唾液酸化。研究表明，vWF可與冷藏后血小板表面的GPIbα膜蛋白相結合，導致血小板上GPIbα糖蛋白胞外區(qū)的唾液酸殘基水解，半乳糖暴露，發(fā)生去唾液酸化[24]。這是導致冷藏血小板被快速清除的一個重要機制。

冷藏時間不同，血小板的清除機制也存在一定差異。在小于2 h的儲存條件下，GPIbα失去半乳糖殘基，暴露出β-N-乙酰葡萄糖氨基殘基（β-N-GLcNAC）識別位點，進而被肝巨噬細胞的αMβ2 整合素識別；在大于48 h的儲存條件下，GPIbα暴露在血小板上的半乳糖殘基可以被肝細胞表面的Ashwell-Morell受體（AMR）識別，隨后誘導去唾液酸化血小板的內部發(fā)生變化，并將其從循環(huán)中清除[25-27]。這一過程中，AMR主要與N-聚糖結合；唾液酸酶則介導GPIbα中的O-聚糖去唾液酸化，O-聚糖去唾液酸化不僅能夠促進其他糖蛋白如N-聚糖的去唾液酸化，還將顯著降低GPIbα膜蛋白機械感受域的展開閾值，從而誘導GPIbα亞單位的機械感覺域去折疊，導致GPIb-Ⅸ復合物介導信號傳導，引發(fā)鈣動員、磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）暴露，以及唾液酸酶向血小板表面的轉運；這一信號傳導效果促使更多N-聚糖上的β-N-GLcNAC暴露，最終被AMR和其他受體識別并清除[22,24,28]。實驗結果表明，冷藏儲存還會誘導小鼠血小板中的溶酶體唾液酸酶出現(xiàn)在質膜上，也會導致血小板輸注到受體小鼠體內后加速清除（圖1）[23,29]。

圖1 去唾液酸化介導的血小板清除

1.2 凋亡介導的血小板清除：14-3-3是一個由不同基因編碼的高度同源蛋白家族，在已知的哺乳動物內有7種亞型，14-3-3ζ作為其中的一種亞型，是一種重要的信號分子，可以調節(jié)含有特定磷酸絲氨酸中心結合基序的胞內蛋白[30]。14-3-3ζ能夠與細胞內的各種分子相互作用，在調節(jié)細胞周期進程、凋亡、代謝、胞內運輸和應激反應中發(fā)揮著關鍵作用。

在血小板中，14-3-3ζ能夠調節(jié)與PS暴露和促凝功能有關的線粒體呼吸儲備[31]。B淋巴細胞瘤-2基因相關啟動因子（Bad）是血小板內在凋亡通路的上游元素，通過與Bcl-xL和Bcl-2結合并抑制其抗凋亡作用而導致細胞死亡。14-3-3ζ能與Bad結合，阻止Bad與Bcl-xL和Bcl-2的相互作用，抑制Bad所誘導的細胞凋亡[30]。血小板冷藏儲存后，14-3-3ζ與Bad分離并與GPIbα結合增加，導致Bad去磷酸化激活，取代Bax-Bcl-xL復合體中的Bax，進一步導致Bax和Bcl-2發(fā)生構象改變。而Bax則轉移至線粒體引發(fā)線粒體內膜去極化并釋放細胞色素C，細胞色素C進一步激活caspase 9并誘導PS暴露，最終誘導血小板與成熟THP-1細胞結合并被吞噬（圖2）[32]。

圖2 凋亡介導的血小板清除

2 展望 目前的研究表明，GPIbα與vWF的相互作用會引起血小板內部信號變化以及GPIbα自身結構的改變，這是冷藏血小板輸注后快速清除的關鍵途徑。這些血小板最終通過與肝細胞Ashwell-Morell受體和巨噬細胞相互作用，導致清除。在這個過程中，唾液酸酶是關鍵因素，我們認為可以將它作為降低冷藏血小板輸注后清除率的突破點展開研究。目前，已有研究表明，通過在小鼠冷藏血小板保存劑中加入唾液酸酶抑制劑DANA ，能夠有效提高小鼠冷藏血小板輸注后的存活率和恢復率。但這僅僅是一種競爭性底物抑制劑，并不能完全阻止去唾液酸化，非競爭性唾液酸酶抑制劑還有待進一步開發(fā)[23]。 另一方面，對14-3-3ζ與Bad相互作用引發(fā)的血小板凋亡途徑進行研究是提高冷藏血小板存活率的又一方向。研究表明花生四烯酸與14-3-3ζ和Bad之間的相互作用密切相關，消耗冷藏時產生的花生四烯酸能提高冷藏血小板的存活率，雖然會影響輸血后的止血功能，但這種影響是可逆的，通過添加花生四烯酸可以恢復[33]。目前已有較多文獻對抑制血小板清除的方法進行報道，主要是利用抑制劑抑制特定因子的作用，從而阻斷血小板的清除，達到延長冷藏血小板輸注后存活時間的目的，但距離應用于臨床仍有一定的距離。因此在未來一段時間內，以上兩個途徑仍將會是延長冷藏血小板輸注后存活時間的主要研究方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突