血小板類產(chǎn)品細(xì)菌污染的預(yù)防、控制相關(guān)研究進(jìn)展

董玉芳 李萌 陳雪

血液制劑細(xì)菌污染導(dǎo)致的輸血相關(guān)敗血癥一直是臨床輸血亟待解決的問題，尤其是血小板類產(chǎn)品（platelet concentrates，PCs）的輸注，包括單采血小板、混合濃縮血小板、去白細(xì)胞血小板等。這是由于血小板的儲存條件為室溫，這一溫度范圍有利于細(xì)菌的增殖，血小板采集袋采集血液時持續(xù)混合又提供了相對較豐富的氧氣供應(yīng)等，導(dǎo)致其被細(xì)菌污染的風(fēng)險遠(yuǎn)大于其他血液成分[1]。目前已有許多國家和地區(qū)報告了大量與PCs輸注相關(guān)的膿毒性反應(yīng)及其產(chǎn)生的致命結(jié)果[2-5]。

如何建立靈敏、特異、快速、經(jīng)濟(jì)、便于操作實施的檢測方法，來預(yù)防、控制和降低PCs制品的細(xì)菌污染，保障血小板的安全，是許多國家和地區(qū)血液機(jī)構(gòu)致力研究和改進(jìn)的重要技術(shù)問題，也是目前醫(yī)學(xué)臨床輸血領(lǐng)域中的一個研究熱點(diǎn)。本文對目前國內(nèi)外PCs細(xì)菌污染預(yù)防、控制的相關(guān)研究進(jìn)行調(diào)查和總結(jié)，以求提高其輸血的可靠性和安全性，探討相關(guān)措施實施的可行性。

1 PCs細(xì)菌污染的預(yù)防

1.1 嚴(yán)格篩查高危獻(xiàn)血者：嚴(yán)格篩查獻(xiàn)血者，排除無癥狀菌血癥者。通過獻(xiàn)血前的問卷調(diào)查進(jìn)行仔細(xì)評估，可以排除具有高菌血癥風(fēng)險的獻(xiàn)血者或有皮膚損傷細(xì)菌污染的獻(xiàn)血者[6]。這就意味著獻(xiàn)血者在獻(xiàn)血前的健康檢查和問詢十分重要，也要求體檢醫(yī)生有較高的專業(yè)素質(zhì)，足夠耐心和細(xì)心，在血液采集前詳細(xì)詢問病史，進(jìn)行嚴(yán)格體格檢查，觀察皮膚有無紅腫熱痛，局部淋巴結(jié)是否腫大，還應(yīng)注意白細(xì)胞計數(shù)情況，同時也需要獻(xiàn)血者的據(jù)實相告。

1.2 實施有效的皮膚消毒程序：日本紅十字會通常按照以下步驟進(jìn)行血小板采集前的皮膚消毒程序，靜脈穿刺部位先用浸泡在70%乙醇中的棉簽清洗一次，然后再用10%聚維酮碘棉簽對該部位第二次消毒，等其完全干燥后再進(jìn)行靜脈穿刺[6]。朱立葦?shù)萚7]報道聚維酮碘的殺菌效果＞90%，可達(dá)到較好的消毒效果。2012年美國獻(xiàn)血者皮膚消毒方法由聚維酮碘改為氯己定碘（即洗必泰），使細(xì)菌污染率由578/100萬降至105/100萬，P=0.0002，兩者差異具有顯著意義[8]。我國衛(wèi)生部2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定氯己定碘、碘酊法和聚維酮碘3種消毒方法可用于皮膚和黏膜的消毒[9]。皮膚消毒的效果取決于多個因素，如使用的化學(xué)消毒劑種類、其濃度和暴露時間、一步或兩步法、操作該過程的員工的培訓(xùn)以及使用方法等等。

1.3 捐獻(xiàn)前留樣，最先采集的血小板分流至旁袋：研究發(fā)現(xiàn)[10]，大約1/3的血小板成分輸注后的膿毒性敗血癥的發(fā)生都涉及葡萄球菌，這些細(xì)菌通常是存在于皮膚上的正常菌群，其最佳生長條件類似于PCs的儲存條件（即在有氧環(huán)境中為20℃～24℃）。即使進(jìn)行再規(guī)范優(yōu)化的消毒程序也不能完全避免在皮膚表面有細(xì)菌殘留，獻(xiàn)血者的皮膚細(xì)菌可以通過刺穿部位皮膚組織的血液流動進(jìn)入收集系統(tǒng)[11]。OLTHUIS等人[12]在血漿分離前在開放系統(tǒng)中培養(yǎng)兩個10 mL血液樣本，結(jié)果表明最先留置的第一個樣本比后續(xù)樣本含有細(xì)菌的可能性更大。因此，在獻(xiàn)血開始時采集的血液中可能會更多地存在皮膚細(xì)菌，排除最初采集的幾毫升可能是降低血液成分細(xì)菌污染風(fēng)險的有效方法[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，捐獻(xiàn)時將第1 mL血液分流留樣，可使PCs污染率由0.17%降至0.05%[14]。日本紅十字會把最初采集的25 mL血小板轉(zhuǎn)移到微型旁袋中，以減少殘留的皮膚細(xì)菌對流入收集袋中剩余血小板的污染[6]。亦有其他文章研究發(fā)現(xiàn)，如果把最初20 mL血小板分流再加上改進(jìn)的兩步皮膚消毒方法，可使血小板細(xì)菌污染減少77%[15]。

1.4 濾除白細(xì)胞：血液中的白細(xì)胞也是引起PCs細(xì)菌污染的重要因素。白細(xì)胞的主要功能就是吞噬和破壞入侵到血液中的細(xì)菌，白細(xì)胞在離體的血液中死亡，若不去除白細(xì)胞，其可釋放出吞噬的活菌從而引起PCs細(xì)菌污染，因此濾除白細(xì)胞對預(yù)防血小板細(xì)菌污染十分重要。國外有報道[16]濾除白細(xì)胞可使匯集血小板的細(xì)菌污染率從0.51%降至0.16% 。同時姚根宏等[17]研究表明，PCs采集后濾除白細(xì)胞的時間并非越早越好，因為白細(xì)胞吞噬細(xì)菌一般需要8 h，故在血小板采集8 h之后再進(jìn)行濾除才有意義。但有研究[18]表明在某些情況下，儲存前的白細(xì)胞濾除對于PCs具有有益的效果，但解釋此研究結(jié)果的確切機(jī)制仍有待確定。

1.5 PCs的保存：目前，我國采供血及醫(yī)療機(jī)構(gòu)的PCs的常規(guī)保存條件均為（22±2）℃，振蕩保存。此條件下儲存PCs主要依賴血漿或血小板添加劑溶液（platelet additive solution，PAS）與血漿聯(lián)合作為介質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)PCs懸浮于PAS中儲存時，若存在細(xì)菌污染時則使其容易繁殖，有助于PCs儲存過程中細(xì)菌污染的檢測[19]。新一代PAS的研發(fā)能否有效減少或清除PCs中病原體污染也是值得研究的[20]。另外，亦有研究表明4℃冷藏儲存PCs能有效減少細(xì)菌污染，且無須振蕩保存[21]。但現(xiàn)階段我國尚無4℃冷藏保存PCs的技術(shù)規(guī)范和應(yīng)用指南，此儲存條件也未得到廣泛應(yīng)用[22]。

1.6 限制PCs保存時間，科學(xué)規(guī)劃血小板發(fā)放策略：與病毒污染相反，細(xì)菌具有增殖能力，隨著時間的延長，細(xì)菌的數(shù)量會急劇增加，故儲存時間是影響PCs細(xì)菌污染嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素之一。例如肺炎克雷伯氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌或熒光假單胞菌能夠在2 d內(nèi)，從幾個菌落形成單位（colonyforming unit，CFU）開始，濃度超過107cfu/mL。因此，目前歐洲一些國家血小板的存儲期限一般被限制在7 d[23]。

研究發(fā)現(xiàn)由血小板血液制品引發(fā)的輸血傳播細(xì)菌感染（transfusion-transmitted bacterial infections，TTBIs），血小板保存時間1/2以上都在3 d及以上[6]。日本規(guī)定血小板在血液采集單位保存的時間不超過85 h（第0 d 11:00～17:00采集，第3 d 24:00為限）。PCs保存期短，患者可以輸注更新鮮的血小板，從而發(fā)揮其最佳功能[6]。另外，由于儲存5 d的PCs引發(fā)輸血不良反應(yīng)的比例較多，自2008年起，德國血液中心將血小板的有效期由5 d縮短為4 d，該舉措的實施使血小板輸注相關(guān)的細(xì)菌感染減少了約50%。歐洲對細(xì)菌檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析后得出結(jié)論：血小板采集后12 h內(nèi)發(fā)放使用可不采取額外的保證措施[23]。

在波蘭、意大利等，血小板的標(biāo)準(zhǔn)儲存時間限制為從捐獻(xiàn)時起最多5 d，PCs若在這期間發(fā)放出去，都無需進(jìn)行細(xì)菌篩查[23]。日本通過血小板保存時間與細(xì)菌感染風(fēng)險相關(guān)性研究，結(jié)果表明保存時間為1、2、3 d的血小板發(fā)放比例為12%、62%和26%。該策略比全部在采集后第3 d發(fā)放細(xì)菌污染的風(fēng)險降低56%[6]。

1.7 輸血前目測評估PCs外觀情況：有研究證實了輸血前目測評估PCs外觀情況的重要性[24-25]。輸血前目測血小板狀態(tài)理論上可以防止2/3的TTBIs：如金黃色葡萄球菌污染容易引起血小板的聚集，漩渦形成很大程度上表明血小板功能受損，凝塊的產(chǎn)生，顏色的變化，氣體的產(chǎn)生，渾濁等等。

PCs污染的細(xì)菌濃度過低時不會引起外觀改變，而且并不是所有細(xì)菌污染的PCs都會呈現(xiàn)異常外觀，故目測檢查的靈敏度不足以檢測排除所有被細(xì)菌污染的PCs[6]。

1.8 病原體滅活技術(shù)：病原體滅活技術(shù)（pathogenreduction technology，PRT）策略旨在降低PCs受到細(xì)菌和病毒污染的風(fēng)險。病原滅活可同時去除細(xì)菌、病毒和寄生蟲等潛在病原體，對細(xì)菌DNA產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的破壞，阻止其核酸復(fù)制。比利時、瑞士和法國分別于2009、2011和2017年開始全面實施PCs的病原體滅活，自從此措施實施之后，他們的PCs微生物污染率分別從19/100萬、82.9/100萬和35.6/100萬例降至0[26-28]。

常用的PRT有：（1）Mirasol病原體減少技術(shù)（Mirasol PRT）是一種專為血漿和血小板產(chǎn)品設(shè)計的治療系統(tǒng)。這項技術(shù)使用核黃素，一種天然存在的維生素B2，當(dāng)暴露在紫外線下時，它與細(xì)菌或病毒的核酸相互作用，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[29]，此基于核黃素的光化學(xué)處理技術(shù)已被證明對多種病原體有效[30]。（2）為了防止與PCs相關(guān)的感染性輸血反應(yīng)，瑞士于2011年為所有PCs引入了Intercept?病原體滅活技術(shù)[31]。Intercept?病原體滅活技術(shù)，該技術(shù)基于將補(bǔ)骨脂素化合物添加到PCs中，插入病原體核酸的嘧啶堿基對之間。當(dāng)進(jìn)行長波紫外線照射時，它形成共價鍵，阻止進(jìn)一步復(fù)制，從而使病原體和殘余白細(xì)胞失活[32]。

但是PRT面臨三大科學(xué)和臨床挑戰(zhàn)：最大限度地降低病原體負(fù)荷；盡量減少PRT過程相關(guān)的細(xì)胞損傷；并避免使用化學(xué)品的毒性，以提高減少病原體的水平[33]。目前，雖然病原體減少的PCs的使用并沒有正式被世界各地所接受，但這些產(chǎn)品也逐漸在世界各地的輸血中心實施。

2 PCs細(xì)菌污染的控制 美國、荷蘭、愛爾蘭、芬蘭、英國、丹麥、葡萄牙等國家強(qiáng)制性開展常規(guī)細(xì)菌檢測[34]。例如，英國進(jìn)行PCs細(xì)菌檢測后，血小板輸注導(dǎo)致的細(xì)菌感染由16.4/100萬降至5.4/100萬例，有效地將細(xì)菌傳播導(dǎo)致的輸血不良反應(yīng)次數(shù)減少了90%[35]。由于微生物污染物的初始濃度較低，在最初的24 h內(nèi)檢測細(xì)菌時存在抽樣錯誤和假陰性結(jié)果的風(fēng)險，因此需增菌后再進(jìn)行細(xì)菌檢測，日本也正在評估細(xì)菌培養(yǎng)策略的可行性。

2.1 PCs污染的細(xì)菌種類：Puckett A等[36]研究發(fā)現(xiàn)，2/3的血液細(xì)菌污染是由皮膚深層細(xì)菌引起的，1/3則是由無癥狀但有短暫菌血癥感染的獻(xiàn)血者造成的。常規(guī)的皮膚消毒并不能殺滅存在于皮膚深層、毛囊和皮脂腺中的細(xì)菌，細(xì)菌通過血液進(jìn)入血袋中，從而造成細(xì)菌污染。國內(nèi)有報道大約56%的細(xì)菌經(jīng)鑒定為G+菌，大多為需氧菌[37]。PCs細(xì)菌污染檢出的微生物包括葡萄球菌屬（如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、大腸埃希菌、棒狀桿菌屬、沙門氏菌、鏈球菌屬、沙雷氏菌等，厭氧菌有產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌等，還有許多細(xì)菌病原體是兼性厭氧菌，在有氧和無氧的條件下都可以生長，其中包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌。

2.2 PCs細(xì)菌檢測的方法和操作：檢測細(xì)菌的方法有很多種，PCs細(xì)菌檢測通常采用兩種方式進(jìn)行，即使用細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行早期檢測，在接近發(fā)放或輸血時使用一些快速檢測系統(tǒng)進(jìn)行后期檢測[38]。細(xì)菌培養(yǎng)法，目前公認(rèn)的最準(zhǔn)確的細(xì)菌檢測方法，被視為“金標(biāo)準(zhǔn)”，如自動微生物檢測系統(tǒng)（BacT/ALERT）、增強(qiáng)型細(xì)菌檢測系統(tǒng)（PalleBDS）等。

2.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)取樣時間：目前為止，尚未明確PCs細(xì)菌污染的初始細(xì)菌負(fù)荷。根據(jù)細(xì)菌篩選數(shù)據(jù)，預(yù)計其感染的PCs中存在＜60 cfu/袋的細(xì)菌計數(shù)[3，38]，這種極低的細(xì)菌濃度很容易出現(xiàn)采樣錯誤，尤其是在捐贈后不久采集樣本時，此時細(xì)菌負(fù)載量遠(yuǎn)低于1 cfu/mL，并且細(xì)菌傾向于聚集生長，在溶液中分布不均勻，因此，與“早期采樣”策略相關(guān)的假陰性結(jié)果令人震驚：只有10%～50%的受感染的PCs血培養(yǎng)被檢測為陽性[39-40]。細(xì)菌培養(yǎng)的取樣時間沒有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，只能列舉以下國家/地區(qū)的取樣時間作為參考[8,23,41-45]。見表1。

表1 各個國家/地區(qū) PCs細(xì)菌培養(yǎng)的取樣時間

2.2.2 培養(yǎng)時間、接種量、接種培養(yǎng)瓶種類：即使高濃度細(xì)菌污染，至少在培養(yǎng)4 h后才出現(xiàn)陽性信號。在血小板樣本中分別加入多種低濃度細(xì)菌分離物（包括低致病性和高致病性菌種），在培養(yǎng)24 h內(nèi)所有陽性樣本均被檢出。將檢測時間縮短至12 h以內(nèi)，低致病力組細(xì)菌檢出率僅為59%，而高致病力菌株檢出率為100%。如果檢測時間延長到18 h，低致病性細(xì)菌檢出率顯著提高至97%以上[46]。美國FDA建議培養(yǎng)時間不得低于12 h[8]，歐洲建議培養(yǎng)時間不低于18 h[23]。2019年FDA《采供血和輸血機(jī)構(gòu)提高血小板安全性和可及性的細(xì)菌風(fēng)險控制策略》建議同時進(jìn)行需氧和厭氧培養(yǎng)。

樣本量是影響陽性檢測率的重要因素之一。BacT/ALERT最大接種量為10 mL/瓶，據(jù)研究分析，理論檢測下限將為0.1 cfu/mL[47]。雖然通過增加接種量提高陽性檢出率能力有限，但與接種8 mL和4 mL相比，真陽性結(jié)果顯著增加了57%[48]。固定體積接種的另一種方法是所謂的比例樣本體積法[49]，根據(jù)泊松模型分析，接種血小板產(chǎn)品總體積的3.8%細(xì)菌污染真陽性檢出率比固定接種8～10 mL高2倍[50]。雖然各個國家/地區(qū)的細(xì)菌培養(yǎng)法的培養(yǎng)時間、接種量、接種培養(yǎng)瓶種類略有不同，但也大致相似，總結(jié)見表2[8,23,41-45,51]。

2.3 血小板細(xì)菌培養(yǎng)的局限性：目前可選擇使用的細(xì)菌檢測系統(tǒng)，對不同細(xì)菌的檢測時間離散程度較大，耗時長。這是因為細(xì)菌生長動力學(xué)比較復(fù)雜，生長率差異也很大，還存在起始滯后期，對于PCs污染相關(guān)的皮膚定植菌群來說更是明顯[52]。這種情況下，某些細(xì)菌污染就需要較長時間才可以被檢出，這就對現(xiàn)行的細(xì)菌培養(yǎng)篩查方式造成一定的困難[53]。另外，任何篩選方法都會受到靈敏度和特異性的限制，即受到假陰性或假陽性結(jié)果的限制[54]。由于PCs細(xì)菌培養(yǎng)檢測所需時間較長，實時熒光PCR技術(shù)憑借其快速、靈敏等特點(diǎn)，也被國內(nèi)一些研究引入到PCs細(xì)菌污染的檢測中來，如細(xì)菌基因組16S DNA 改良[55]檢測法、16s核糖體RNA基因快速檢測[56]等。為提高采供血機(jī)構(gòu)工作人員血液成分中細(xì)菌污染的檢測能力，確保細(xì)菌檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可靠性，2013年中國國際輸血感染預(yù)防和控制項目組（CITIC）建立了血液成分細(xì)菌檢測能力驗證項目。

3 結(jié)語 實際上，我國的PCs細(xì)菌檢測技術(shù)水平還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于歐美國家，大部分采供血機(jī)構(gòu)未將其作為常規(guī)檢測項目，只是抽檢，2019版《血站技術(shù)操作規(guī)程》要求，采供血機(jī)構(gòu)每月對成分血進(jìn)行無菌試驗的質(zhì)量控制檢查，抽樣量為每月制備量的1%或至少4袋。預(yù)防和控制血小板制品細(xì)菌污染是當(dāng)前輸血醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一個重點(diǎn)研究工作。隨著血小板成分在臨床使用的日益增加，血小板制品的細(xì)菌污染問題日益受到關(guān)注，并成為輸血安全的重要課題。研究血小板在采集制備過程中細(xì)菌污染的風(fēng)險, 為提高輸血安全性并為制定血小板細(xì)菌污染預(yù)防措施提供依據(jù)。做好血小板的質(zhì)控，對保障血小板的質(zhì)量, 預(yù)防血小板細(xì)菌污染, 防止細(xì)菌污染的血小板發(fā)放到臨床具有重要的意義。目前單一的細(xì)菌篩查方法和策略都存在一定的局限性，盡管實施了上述措施，但仍然會存在安全漏洞，建議各采供血機(jī)構(gòu)結(jié)合自身實際情況，引入多種方法聯(lián)合應(yīng)用，建立一套快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)、易于操作的血小板細(xì)菌檢測方法，最大限度降低PCs細(xì)菌污染的殘余風(fēng)險，進(jìn)一步保障臨床用血安全。

利益沖突本文所有作者均聲明不存在利益沖突