啟動子PpetE與Pcpc560對集胞藻PCC 6803生物合成乙醇的影響

葉鵬林 Kwasi Kyere-Yeboah 高惡斌

（江蘇大學環(huán)境與安全工程學院，鎮(zhèn)江 212000）

隨著煤炭、石油等化石燃料的大量消耗，引起了一系列問題［1］。一方面，化石燃料的大量燃燒造成了嚴重的環(huán)境問題，如酸雨、溫室效應等［2］；另一方面，化石燃料作為不可再生資源，面臨著能源枯竭的問題［3］。因此，可再生生物燃料的開發(fā)引起了全世界的關注［4］。

隨著生物技術的發(fā)展，利用藍藻作為光合微生物細胞工廠生產各種化學燃料，吸引了越來越多學者的興趣［5］。其中乙醇作為重要的化工產品與清潔能源，通過在藍藻中引入外源合成途徑，雖被多次成功合成，然而產量卻并不樂觀［5］。

先前的研究表明，合成過程中啟動子的選擇對所合成的化合物產量有重大影響［6］。為進一步探究啟動子對工程集胞藻中乙醇合成的影響，并實現(xiàn)乙醇的高效合成。在本研究中首先選用來自運動型發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因（pdc）和來自大腸桿菌的NADPH依賴型醛還原酶基因（yqhD）于集胞藻PCC 6803的slr0168位點表達，實現(xiàn)以丙酮酸為合成前體，乙醇的生物合成（圖1）。

圖1 集胞藻PCC 6803的乙醇合成路線Fig.1 Ethanol synthesis route in Synechocystis sp. PCC 6803

在啟動子的選擇上，本實驗主要探究兩個啟動子對乙醇合成的影響。一是銅離子誘導啟動子PpetE，它被認為是一種強度中等的啟動子［6］。其表達受到銅離子濃度調節(jié)，已證明當銅離子濃度大于6 nmol/L時誘導啟動子的表達［7］。另一種超強啟動子Pcpc560是一種光強啟動子，Pcpc560受到光照驅動表達。Pcpc560含多個轉錄因子結合位點，已證明可以提高功能蛋白在大腸桿菌中的表達［8］。通過PpetE和Pcpc560兩個啟動子分別驅動外源pdc，yqhD基因表達，根據基因表達效果以及對乙醇產量的比較，從而具體了解啟動子對乙醇合成的影響，實現(xiàn)集胞藻PCC 6803中乙醇的高效合成。

1 材料與方法

1.1 材料

利用大腸桿菌DH5α構建質粒。將不同抗性的大腸桿菌菌株分別在含有相應抗生素的液體以及含有1.5% 瓊脂的固體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。野生型集胞藻PCC 6803和工程菌株在液體BG11培養(yǎng)基或含有1.5% 瓊脂的瓊脂平板上生長。利用限制性內切酶（NEB北京）構建質粒。除特別指出，所有試劑與材料均來自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)條件 大腸桿菌于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃。除優(yōu)化培養(yǎng)外，工程藍藻于BG11培養(yǎng)基中進行光自養(yǎng)，設置培養(yǎng)溫度為30℃，光強為100 μE/m2/s［9］。

1.2.2 質粒的構造 以pMD18-T為簡單載體（上海生工）構建質粒。利用PCR擴增片段，將擴增的片段與載體質粒進行雙酶切，T4連接酶（NEB 北京）連接來構建新的目標質粒。通過在pMD18-T簡單載體上擴增并克隆slr0168基因上游600 bp片段，壯觀霉素（SpR）基因片段，和slr0168基因下游600 bp片段組成slr0168基因敲除暗盒，獲得質粒pBE406。利用集胞藻PCC 6803基因組為模板擴增slr0168的上下游基因，以生工優(yōu)化合成的SpR序列為模板，擴增SpR基因。通過將PpetE-pdc-yqhD基因片段和TrbcL終止子擴增并克隆到質粒pBE406上，構建質粒pBE01。啟動子PpetE和終止子TrbcL以集胞藻PCC 6803基因組為模板進行PCR擴增。以生工優(yōu)化合成的核苷酸序列為模板，通過PCR擴增pdc、yqhD基因。將PpetE啟動子換成Pcpc560啟動子構建了質粒pBE02。具體方法如表1所示，生工合成的引物序列如表2所示。

表1 本文使用的質粒Table 1 Plasmids used in this study

表2 本文使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2.3 集胞藻PCC 6803的轉化 按之前文獻所述的方法［9］，具體來說，在藻細胞生長到指數(shù)生長階段后，用新鮮的BG11培養(yǎng)基收集細胞，并將質粒與新鮮的藻細胞混合?；旌衔镌?0℃下恒定光照孵育5 h，并定期搖動。然后吸取混合物轉移至BG11固體培養(yǎng)基上的無菌核孔膜（Whatman）上，并在30℃下恒定光照孵育24 h。孵育24 h后，將無菌核孔膜轉移到帶有相應抗性的固體BG11培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周后出現(xiàn)相應的單菌落。單菌落在逐步增加抗生素濃度的新的固體BG11培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以實現(xiàn)染色體分離，并在液體培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)進行分析。

1.2.4 HPLC分析 在乙醇分析試驗中，所有改造菌株保持初始OD730=0.1，在新鮮BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)。SYN01的BG11培養(yǎng)基含有50 nmol/L的銅離子，誘導PpetE的表達。利用高效液相色譜儀（HPLC）（AgilentTechnologies1200系列）進行乙醇產量檢測。高效液相色譜系統(tǒng)配備了示差檢測器（RID），使用BioradAminex HPX-87H柱（300 mm×7.8 mm）。設置溫度條件為50℃，以0.6 mL/min的流速使用0.5 mmol/L的H2SO4進行洗脫。HPLC實驗中所使用的流動相為0.5 mmol/L的硫酸溶液，固定相為聚苯乙烯二乙烯苯樹脂。

定期取1 mL藻細胞培養(yǎng)物在10 000 ×g條件下離心2 min（MRK MG1450），用0.22 μm（Sigma-Aldrich）的特殊濾膜過濾離心得到的上清液。過濾后的上清液直接用高效液相色譜法（HPLC）進行乙醇產量分析；過濾后獲得的沉淀進行細胞破碎后利用無菌水洗滌并離心，保留上清液，繼續(xù)過濾進行乙醇產量分析。最后的乙醇產量為工程藍藻上清液與沉淀所測的數(shù)值之和。

1.2.5 逆轉錄定量PCR分析 將藻細胞培養(yǎng)物（30mL，OD730≈0.6）于3 500×g（BIORIDGETGL-16M，上海，中國）條件下離心15 min，保留沉淀。保留的沉淀用于提取RNA和逆轉錄定量PCR分析［9］。用2-△△CT的計算方法可以估計不同mRNA分子的相對表達水平；△CT值越高，對應的mRNA表達水平越低［10］。本實驗選擇編碼16SrRNA的內源基因作為內參基因。

1.2.6 優(yōu)化培養(yǎng) 在設置光強為100 μE/m2/s的基礎上，向培養(yǎng)體系中分別通入5% CO2+95% 空氣與100% 空氣分別對兩種菌株進行曝氣培養(yǎng)。

1.2.7 PCR分析 選擇編碼16SrRNA的內源基因作為陽性對照，通過PCR擴增驗證基因組DNA提取的正確性。通過采用整合基因引物與整合位點轉基因編碼區(qū)引物相結合進行PCR擴增的方法，以驗證整合基因是否完整，整合基因位置是否正確以及原始基因是否完全消除。

1.2.8 數(shù)據統(tǒng)計分析 差異顯著性檢驗用單因素方差分析，比較兩組間差異用t檢驗法檢驗。采用origin 9.0作圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義［11］。

2 結果

2.1 工程藻株的成功構建

將質粒pBE01、pBE02分別轉入野生型集胞藻PCC 6803中。pBE01中slr0168上下游片段間的PpetE-SpR-pdc-yqhD-TrbcL經同源重組整合到集胞藻PCC 6803中slr0168基因位點上。通過抗性篩選，將含有壯觀霉素抗性的轉化子進行培養(yǎng)并驗證。菌株構建與驗證具體如圖2所示，以提取的轉化子和野生型集胞藻基因組DNA為模板分別擴增編碼16S rRNA的內源基因，結果均呈陽性（600 bp）。以提取的轉化子基因組DNA為模板，通過PCR整合擴增，成功擴增出符合整合基因預期大小的條帶（3.6 kb，2.9 kb，2 kb）。而以提取的野生型集胞藻PCC 6803基因組DNA為模板，均無法擴增。經PCR分析，擴增片段大小正確的轉化子即為成功轉化的菌株SYN01。同理，pBE02中slr0168上下游片段間的Pcpc560-SpR-pdc-yqhD-TrbcL經同源重組整合到集胞藻PCC 6803中slr0168基因位點上（圖3），驗證大小正確（3.9 kb，2.9 kb，2 kb）的轉化子為成功轉化的菌株SYN02。驗證正確的轉化子送生工測序進一步驗證后進行后續(xù)實驗。

圖2 SYN01菌株的構建示意圖與PCR分析Fig.2 Construction diagram and PCR analysis of the SYN01 strain

圖3 SYN02菌株的構建示意圖與PCR分析Fig.3 Construction diagram and PCR analysis of the SYN02 strain

2.2 乙醇合成基因的表達

從SYN01和SYN02中提取總RNA，并進行逆轉錄定量PCR分析，以確定SYN01和SYN02中乙醇合成基因的表達水平。用2-△△CT計算方法估計不同mRNA分子的相對表達程度（表3）。數(shù)據表明，與SYN01菌株相比，SYN02菌株的pdc和yqhD基因表達增加了2.55倍和2.31倍（圖4）。

圖4 外源乙醇合成基因的表達情況Fig.4 Expressions of exogenous ethanol-producing genes

表3 逆轉錄定量PCR的結果Table 3 Reverse transcription of quantitative PCR results

2.3 光自養(yǎng)條件下乙醇的合成

在乙醇測定試驗中，野生型PCC 6803在14 d培養(yǎng)周期內沒有產生任何乙醇。根據光自養(yǎng)條件下的乙醇生產曲線所示（圖5-圖6），菌株SYN01與SYN02均成功合成乙醇。在14 d的培養(yǎng)周期內其乙醇合成產量均逐步上升，且SYN02的乙醇合成產量一直領先于SYN01。根據3次平行實驗，同樣在光自養(yǎng)的第14天，SYN01合成的乙醇產量為389 mg/L（OD730≈1.12），而SYN02的乙醇合成產量為591.7 mg/L（OD730≈1.08）。因此，在相同的14 d培養(yǎng)周期內，菌株SYN02的乙醇產量約為菌株SYN01的1.5倍。

圖5 乙醇的液相色譜檢測Fig.5 HPLC detection of ethanol

圖6 乙醇的生產情況Fig.6 Production of ethanol under the autotrophic conditions

2.4 光自養(yǎng)條件下突變株之間的生長比較

在光自養(yǎng)過程中，觀察了兩株工程菌株SYN01和SYN02的生長狀態(tài)，繪制了周期為14 d內的生長曲線并與野生型集胞藻PCC 6803的生長狀態(tài)進行比較。在恒定光照條件下，整個實驗周期內，構建的菌株在遺傳上是穩(wěn)定的。生長比較顯示（圖7），在光自養(yǎng)14 d的周期內，基于OD730測量的生長無明顯差異（P＞0.05），兩株產乙醇的突變體生長正常，外源產乙醇基因的導入與乙醇的合成并沒有對集胞藻PCC 6803細胞代謝產生影響。

圖7 自養(yǎng)條件下菌株的生長情況Fig.7 Growth condition of the strain under the autotrophic conditions

2.5 優(yōu)化培養(yǎng)下的藻株的生長與乙醇合成情況

在優(yōu)化培養(yǎng)條件下觀察藻株生長情況并記錄乙醇產量。結果如圖8所示，向培養(yǎng)體系中，通入5%CO2（實線）相較于只通空氣（虛線）更有助于藻細胞的生長且藻細胞繁殖速度更快。如圖9所示，根據乙醇合成情況，繪制了優(yōu)化培養(yǎng)下的乙醇合成曲線。結果顯示，隨著藻細胞密度的增大，乙醇產量相對于光自養(yǎng)情況下并沒有顯著升高，最高產量仍保持在600 mg/L左右，且通空氣與通5% CO2+95%空氣最終乙醇合成產量結果相近，說明在僅僅優(yōu)化啟動子的情況下，突變株乙醇的合成可能已經達到了上限。

圖8 優(yōu)化培養(yǎng)下菌株的生長情況Fig.8 Growth condition of the strains under the optimized culture

圖9 優(yōu)化培養(yǎng)下菌株的乙醇生產情況Fig.9 Ethanol production of the strains under the optimized culture

3 討論

為了使光合藍藻盡可能的合成所需的化合物，大多數(shù)生物合成途徑都是以中間代謝產物乙酰輔酶A或丙酮酸為初始前體進行設計［12］。這些代謝物在藍藻細胞生長過程中常常被生理性活動的內源性途徑所消耗（例如氨基酸合成、脂肪酸合成、TCA循環(huán)）［13］。因此，藍藻中乙醇合成前體的含量大小可能是決定乙醇生產的重要因素。多項研究結果表明，以乙酰輔酶A作為乙醇合成的前體，是一種效率較低的方案［12，14］。與乙酰輔酶A相比，丙酮酸作為糖酵解途徑產生的中間代謝物，在藍藻碳代謝途徑中占據中心位置，與CO2中心固定點僅僅距離4個反應［15］。因此，我們認為以丙酮酸作為代謝前體的生物合成途徑將更有效地合成乙醇。

基于丙酮酸為合成前體合成生物乙醇，丙酮酸脫羧酶和醛還原酶的組合是最簡便的方案。來自于運動型發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因（pdc）普遍應用于催化丙酮酸的脫羧，生成乙醛和CO2［16］。因此在本研究中，繼續(xù)選擇來自運動型發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶催化內源性丙酮酸，轉化生成乙醛。通過選擇醛還原酶，脫羧生成的乙醛在醛還原酶和 NAD（P）H 為輔酶催化下，生成目標乙醇。目前研究普遍認為藍藻的NADPH/NADP池大于其NADH/NAD池，除此之外NADPH/NADP比值高于NADH/NAD比值［17］。大量的實驗例證，引入的“發(fā)酵反應”與NADPH聯(lián)系，是增加藍藻生成產物的驅動力的有效途徑［15，18］。因此選用NADPH依賴型醛還原酶被認為比選擇NADH依賴型醛還原酶能更有效率地合成乙醇。通過對各種NADPH依賴型醛還原酶的篩選，我們發(fā)現(xiàn)來自大腸桿菌的醛還原酶yqhD相對于其他NADPH醛還原酶如slr1192，slr0942等具有更高的催化活性［18］。因此組合表達來自運動型發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶和來自大腸桿菌的NADPH依賴型醛還原酶，能更好地合成乙醇。

過去多個啟動子用來驅動外源乙醇合成基因，如PsbA［19］、Prbc［9］和NblA［20］。啟動子的選擇對外源基因的表達水平至關重要。首先選擇Cu2+誘導啟動子PpetE驅動乙醇合成基因。根據以往的研究，Cu2+誘導啟動子PpetE的強度被歸類為“中等”［6］。中等啟動子誘導的乙醇合成基因的低表達可能導致生物乙醇的低產率。另一方面，高濃度的金屬離子可能導致關鍵酶活性的降低［21］。為了促進外源基因的表達，采用光敏超強啟動子Pcpc560來排除SYN02菌株中這些可能的不良影響［22］。RT-qPCR分析表明，與SYN01菌株相比，SYN02菌株的pdc和yqhD基因表達增加了2.55倍和2.31倍。同時SYN02的乙醇產量約為SYN01的1.5倍，而SYN02和SYN01的唯一區(qū)別是啟動子。結合以上的結果，強啟動子促進了乙醇合成基因的表達，并促進乙醇合成。因此，使用天然超強啟動子Pcpc560來驅動外源乙醇合成基因是一個更好的選擇。

考慮到工程菌株中乙醇的合成同時受到光照與營養(yǎng)條件的影響。研究證明在光照條件為100 μE/m2/s時，集胞藻PCC 6803的生長條件最佳且完全驅動Pcpc560啟動子的表達［23-24］。因此在設置光照條件為100 μE/m2/s的基礎上，進一步進行曝氣優(yōu)化實驗。在優(yōu)化實驗中合成的乙醇與光自養(yǎng)檢測的乙醇產量相比沒有明顯的變化，且不同的優(yōu)化方式最后獲得的乙醇產量接近。這很可能是由于改造菌株的乙醇合成達到了上限。因此，為了利用集胞藻PCC 6803合成更高產量的乙醇，需在高效選擇啟動子的基礎上進一步優(yōu)化合成方法。例如，在集胞藻PCC 6803中，通過過表達乙醇合成基因同時阻止儲存聚合物（糖原和PHB）的產生來增加PCC 6803中合成的生物乙醇產量［25］。在以強啟動子驅動外源乙醇合成基因的基礎上，通過基因工程進行進一步的優(yōu)化，可以在未來更高效地合成乙醇。

4 結論

在集胞藻乙醇生物合成過程中，超強啟動子Pcpc560的選擇可以促進乙醇的合成。同時外源乙醇合成基因的引入對集胞藻的生長沒有影響，合成過程中產生的乙醇并沒有對集胞藻的生長產生明顯的抑制。