重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)在植物病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

羅雪琮 安夢(mèng)楠 吳元華 夏子豪

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866）

在過(guò)去幾十年中，占植物病害數(shù)量第二位的植物病毒病一直制約著糧食、果蔬等作物的產(chǎn)量［1］。因此，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)植物病毒是病害防控工作中的重要部分［2］。常見的病毒檢測(cè)方法有生物學(xué)測(cè)定、電子顯微鏡觀察、血清學(xué)檢測(cè)與分子生物學(xué)技術(shù)等多種手段。其中，生物學(xué)測(cè)定技術(shù)是利用病毒的寄主范圍、傳播方式與侵染后寄主的反應(yīng)而檢測(cè)病毒的方法［3］。該方法具有直觀、可靠、反映病毒生物學(xué)特性的優(yōu)點(diǎn)，但選擇指示植物較復(fù)雜，目前已不再是植物病毒檢測(cè)的主要手段［4］。電鏡檢測(cè)主要通過(guò)觀察病毒結(jié)構(gòu)和宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化來(lái)確定病毒的種屬，需要價(jià)格高昂的電子顯微鏡，且不易分辨親緣關(guān)系近的病毒。血清學(xué)檢測(cè)法的原理則是抗原與抗體的特異性結(jié)合，常用方法包括酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA）、用硝酸纖維素膜取代酶聯(lián)板以簡(jiǎn)化程序的點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)定技術(shù)（dot immunobinding assay，DIBA）及膠體金標(biāo)記的抗體檢測(cè)技術(shù)。但血清學(xué)檢測(cè)法需要特異的抗體，且不能準(zhǔn)確鑒定病毒含量低和具有大量干擾物質(zhì)的樣品，易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果［5］。另外，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，核酸分子雜交技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、深度測(cè)序技術(shù)等逐漸發(fā)展成為常用的病毒檢測(cè)方法。分子生物學(xué)檢測(cè)法具有靈敏便捷、特異性強(qiáng)、檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，但也具有設(shè)備與材料成本高等局限性［6］。

近年來(lái)，學(xué)者們還開發(fā)出一些基于特殊酶類的等溫?cái)U(kuò)增方法，如：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、核酸序列擴(kuò)增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、單引物等溫?cái)U(kuò)增（single primer isothermal amplification，SPIA）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）和滾動(dòng)循環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）等，為病毒的檢測(cè)提供了技術(shù)支持［7］。其中，RPA技術(shù)是一種時(shí)間成本較低、適用于資源有限的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法，從眾多需要較復(fù)雜材料或儀器的檢測(cè)方法中脫穎而出，其優(yōu)點(diǎn)明顯，應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣。本文綜述了RPA技術(shù)的原理、研究進(jìn)展及存在的問(wèn)題，總結(jié)了目前RPA在植物病毒鑒定領(lǐng)域的發(fā)展情況，為其在植物病毒檢測(cè)中的應(yīng)用提供參考。

1 重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）

RPA是一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)［8］。與PCR類似，RPA的反應(yīng)體系中除核心酶外，還要加入引物與模板，另外還需Mg2+。RPA的檢測(cè)過(guò)程主要包括樣品核酸提取，引物設(shè)計(jì)與篩選，運(yùn)用反應(yīng)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增以及將結(jié)果可視化。目前研究人員運(yùn)用RPA檢測(cè)技術(shù)常用的試劑盒主要是其發(fā)明者TwistDx公司的TwistAmp 以及美國(guó)公司Agdia的AmplifyRP 系列產(chǎn)品。

1.1 RPA的原理

RPA體系中含有3種重要的核心酶，包括重組酶、單鏈結(jié)合蛋白（single-stranded DNA-binding protein，SSB）和DNA聚合酶。重組酶可以與引物結(jié)合形成核酸蛋白復(fù)合體并定位模板，引發(fā)鏈交換反應(yīng)形成D環(huán)結(jié)構(gòu)，SSB穩(wěn)定被置換的DNA鏈，隨后DNA聚合酶識(shí)別重組酶解離后暴露出的引物3′端，由此開始擴(kuò)增［9］。DNA聚合酶在延伸引物的同時(shí)對(duì)模板進(jìn)行解螺旋，DNA的合成持續(xù)進(jìn)行，直至兩條引物擴(kuò)增完成即形成完整的擴(kuò)增子（圖1）［10-11］。通過(guò)使用一對(duì)引物，如果存在目標(biāo)序列，則可以在最佳溫度（37-42℃）下啟動(dòng)DNA的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，適用于病毒基因組DNA或RNA的快速檢測(cè)［7］。RPA擴(kuò)增體系中一般還含有促進(jìn)重組酶同源重組的成分：如T4 uvsY，更有利于RPA反應(yīng)的進(jìn)行［8］。

圖1 RPA原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of RPA principle［11］

1.2 RPA引物的設(shè)計(jì)要求

引物設(shè)計(jì)是RPA技術(shù)的關(guān)鍵步驟，為擴(kuò)增反應(yīng)的正常進(jìn)行奠定基礎(chǔ)。其設(shè)計(jì)過(guò)程主要由選擇靶區(qū)域、設(shè)計(jì)引物候選物與實(shí)驗(yàn)篩選3個(gè)步驟組成［11］。由于RPA引物的設(shè)計(jì)過(guò)程較為復(fù)雜，目前還沒(méi)有適用的設(shè)計(jì)軟件。不同于PCR引物的設(shè)計(jì)，為了方便重組酶與引物形成復(fù)合物，RPA引物的建議長(zhǎng)度一般在30-35 nt。過(guò)短的引物會(huì)降低反應(yīng)的重組率，過(guò)長(zhǎng)的引物則易產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)以及潛在的引物假象［12］。另外，引物應(yīng)沒(méi)有直接或倒置重復(fù)、回文序列以及二級(jí)結(jié)構(gòu)（包括環(huán)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)）等，且在5′端不應(yīng)有長(zhǎng)鏈鳥嘌呤，GC含量應(yīng)在30%-70%之間［7］。RPA技術(shù)發(fā)展至今，可擴(kuò)增dsDNA、ssDNA以及RNA或miRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA［13］。無(wú)論使用什么模板，為了獲得最佳結(jié)果，RPA引物應(yīng)擴(kuò)增較短的擴(kuò)增子，最好控制在100-200 bp。雖然RPA也曾報(bào)道過(guò)較長(zhǎng)的擴(kuò)增子（1.5 kb）［8］，但通常情況下，RPA的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)高于70 bp且低于500 bp。如果需要設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量RPA（real-time RPA）所使用的探針，則需在設(shè)計(jì)引物時(shí)留下足夠的空間［14］。

1.3 RPA的優(yōu)缺點(diǎn)

目前常用的植物病毒檢測(cè)方法中，PCR技術(shù)需要較昂貴的熱循環(huán)設(shè)備；ELISA需要的抗體制備時(shí)間較長(zhǎng)，易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果；LAMP引物設(shè)計(jì)復(fù)雜；實(shí)時(shí)熒光PCR快速、靈敏但設(shè)備成本較高［15］。在實(shí)地調(diào)查或條件比較有限的檢測(cè)環(huán)境下，PCR等技術(shù)應(yīng)用困難［16］。相比而言，RPA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)包括：（1）RPA檢測(cè)所需時(shí)間短，30 min左右即可完成反應(yīng)；（2）RPA樣品處理方法簡(jiǎn)單，適用于無(wú)法提取核酸的實(shí)地檢測(cè)，可以擴(kuò)增提取的DNA、RNA以及樣品粗提物；（3）常溫下重組酶也有活性，因此RPA技術(shù)不需要熱循環(huán)器，在常溫（37-42℃）條件下即可恒溫?cái)U(kuò)增，只需水浴、金屬浴或恒溫孵化器即可在現(xiàn)場(chǎng)條件下完成反應(yīng)；（4）與其他的核酸擴(kuò)增方法（PCR、RT-PCR等）相比，RPA的靈敏度更高或持平；（5）RPA具有較高的特異性，檢測(cè)時(shí)不易與其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)［17］；（6）RPA能夠耐受試驗(yàn)樣品中的各種擴(kuò)增反應(yīng)抑制劑［18］。

如今RPA檢測(cè)方法應(yīng)用廣泛，優(yōu)勢(shì)明顯但也具有一定的局限性。RPA產(chǎn)物檢測(cè)方面，在瓊脂糖凝膠電泳之前需要進(jìn)行純化，因此造成時(shí)間和成本的增加；側(cè)流層析試紙條法（lateral flow dipstick，LFD）需要將產(chǎn)物稀釋后再使用試紙條進(jìn)行結(jié)果的檢測(cè)，以防反應(yīng)底物的干擾；在實(shí)時(shí)熒光定量RPA技術(shù)中，需要使用熒光檢測(cè)儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行監(jiān)測(cè)，因此也具有較高的儀器成本。另外，由于缺少RPA引物設(shè)計(jì)的軟件，需經(jīng)過(guò)大量的篩選才有可能獲得理想的引物，建立特定核酸檢測(cè)方法的開發(fā)時(shí)間與費(fèi)用成本較高。

2 RPA的發(fā)展

RPA在不斷的發(fā)展過(guò)程中，獲得了更多的研究和開發(fā)策略，也為資源較差的實(shí)驗(yàn)室提供合適的快速檢測(cè)方法。對(duì)于RNA病毒的檢測(cè)來(lái)說(shuō)，需在體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，將RNA作為模板合成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增，RPA結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄法形成逆轉(zhuǎn)錄RPA技術(shù)（reverse transcription-RPA，RT-RPA）。RPA與 其 他方法的結(jié)合也使其發(fā)展地更加豐富。

2.1 RPA結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳

RPA經(jīng)過(guò)擴(kuò)增得到的產(chǎn)物DNA可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳使結(jié)果可視化。需要注意的是，在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)時(shí)，由于RPA反應(yīng)的混合物中存在阻礙擴(kuò)增子可視化的蛋白質(zhì)，以致形成拖帶，所以RPA產(chǎn)物需經(jīng)過(guò)酚-氯仿抽提或產(chǎn)物純化等方法，去除酶等干擾成分才能進(jìn)行電泳，從而形成更好的成像結(jié)果。電泳后將瓊脂糖凝膠經(jīng)過(guò)溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色，通過(guò)凝膠成像儀在紫外光下獲得擴(kuò)增條帶的可視化結(jié)果［7］。RPA結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)植物病毒檢測(cè)常用的方法之一，已在多個(gè)植物病毒檢測(cè)中得到應(yīng)用。例如葡萄卷葉伴隨病毒3號(hào)（grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3）等［15］。

2.2 RPA結(jié)合側(cè)流層析試紙條

目前，利用RPA方法的部分研究中，將RPA擴(kuò)增反應(yīng)與側(cè)流層析試紙條相結(jié)合，以獲得可視化結(jié)果。與普通RPA體系不同，RPA-LFD需要額外加入核酸外切酶Ⅳ（nfo核酸酶）、帶有FAM熒光素標(biāo)記的nfo探針以及帶有生物素（biotin）標(biāo)記的下游引物［19］。RPA反應(yīng)過(guò)程中，重組酶與引物（正向引物和帶有生物素標(biāo)記的反向引物）形成復(fù)合物并結(jié)合同源鏈發(fā)生鏈置換反應(yīng)，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行擴(kuò)增；同時(shí)，帶有生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物能夠與nfo探針雜交，含有四氫呋喃（THF位點(diǎn)）的nfo探針被nfo核酸酶識(shí)別并切割，產(chǎn)生的羥基端與DNA聚合酶結(jié)合形成新的延伸底物，最終擴(kuò)增得到3′端含生物素、5′端含F(xiàn)AM的雙標(biāo)記擴(kuò)增子［20］。

測(cè)流層析試紙條可利用膠體金免疫層析原理的“夾心法”進(jìn)行檢測(cè)［21］。LFD前端含有FAM熒光標(biāo)記，試紙條上有一條帶有生物素抗體的檢測(cè)線和一條包被固定抗體的對(duì)照質(zhì)控線［14］。當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物流過(guò)試紙條時(shí)，在擴(kuò)散過(guò)程中通過(guò)抗原抗體結(jié)合的原理與FAM抗體以及生物素抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物［22］。在測(cè)試區(qū)，含生物素的復(fù)合物于檢測(cè)線被生物素配體捕獲并顯出紅色，未被捕獲的免疫復(fù)合物擴(kuò)散至對(duì)照區(qū)，被固定抗體捕獲并形成紅色條帶［23］。RPA-LFD一般在30 min內(nèi)即可完成擴(kuò)增與可視化檢測(cè)，觀察檢測(cè)線和質(zhì)控線形成的條帶即可判斷檢測(cè)結(jié)果，若未顯示對(duì)照線（control line）則結(jié)果無(wú)效［20］。另外，反應(yīng)底物可能會(huì)干擾試紙上的抗體，因此需注意RPA產(chǎn)物應(yīng)經(jīng)過(guò)稀釋再進(jìn)行試紙條檢測(cè)［14］。

RPA-LFD在植物病毒檢測(cè)中的應(yīng)用較為常見。在紫云英矮縮病毒（milk vetch dwarf virus，MDV）的檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RPA結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳與測(cè)流層析試紙條時(shí)檢測(cè)限一致，并比PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳靈敏100倍。當(dāng)進(jìn)一步試驗(yàn)PCR結(jié)合測(cè)流層析試紙條時(shí)，其靈敏度與RPA相同。這表明測(cè)流層析試紙條在檢測(cè)MDV的PCR產(chǎn)物時(shí)比瓊脂糖凝膠電泳更靈敏［24］。測(cè)流層析試紙條操作快速簡(jiǎn)便，不需要精密儀器，其靈敏度等于或高于瓊脂糖凝膠電泳，十分適合植物病毒的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

2.3 RPA結(jié)合探針?lè)晒舛?/h3>

與熒光定量PCR（real-time PCR）的原理相同，為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)RPA擴(kuò)增的情況，可以將含有熒光標(biāo)記的探針加入擴(kuò)增體系中，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)中的熒光信號(hào)觀察擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)物積聚的變化情況。在傳統(tǒng)PCR常用的TaqMan探針?lè)ㄖ校琓aq酶具有5′-3′的外切酶活性，以此來(lái)切斷探針鏈產(chǎn)生熒光［25］。在RPA反應(yīng)過(guò)程中，Taq酶則會(huì)降解被置換的核苷酸鏈，因此這種探針影響DNA的擴(kuò)增，不適合熒光定量RPA的反應(yīng)［11］。在RPA檢測(cè)技術(shù)常用的探針中，Exo與Fpg探針一般應(yīng)用于實(shí)時(shí)熒光定量的檢測(cè)，LF探針則可以運(yùn)用在側(cè)流層析試紙以及凝膠電泳的檢測(cè)中。其中，Exo與LF探針一般建議在46-52個(gè)核苷酸之間，F(xiàn)pg 探針通常為35個(gè)核苷酸。在RPA反應(yīng)中可以對(duì)探針的濃度進(jìn)行優(yōu)化，其濃度范圍可在50-150 nmol/L，其推薦濃度為120 nmol/L［19］。

結(jié)合探針的RPA擴(kuò)增過(guò)程中需要來(lái)自大腸桿菌的核酸外切酶Ⅲ（exonuclease Ⅲ，exo）和exo熒光探針的加入。Exo探針與靶序列具有同源性，其上含有THF位點(diǎn)，THF兩側(cè)分別攜帶一個(gè)熒光基團(tuán)（fluorophore）和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)（quencher），3′端有阻斷物以防探針延伸。Exo探針能夠結(jié)合靶序列形成雙鏈雜合DNA結(jié)構(gòu)，隨后核酸外切酶Ⅲ識(shí)別THF位點(diǎn)并切割探針，兩基團(tuán)分離并產(chǎn)生熒光信號(hào)［26］。目前，結(jié)合exo探針?lè)ǖ臒晒舛縍PA在植物病毒檢測(cè)領(lǐng)域中已有應(yīng)用，例如利用RT-exoRPA檢測(cè)黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、玫瑰叢簇病毒（rose rosette virus，RRV）等［27-28］。該技術(shù)一般使用熒光定量PCR儀、Twista等能夠監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的裝置來(lái)完成定量檢測(cè)，反應(yīng)只需不到20 min，比瓊脂糖凝膠電泳更方便快捷，利于實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)植物病毒，具有較高的靈敏度與特異性［29］。未來(lái)研究將繼續(xù)開發(fā)適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的熒光定量RPA技術(shù)，以更好地控制和減少病毒的傳播。

2.4 RPA結(jié)合金納米粒子（AuNP）探針與比色法

近年來(lái)，基于DNA的新型便攜式生物傳感器作為一種快速而靈敏的診斷工具被用來(lái)定性或定量檢測(cè)病原物［30］。研究人員將RPA與金納米粒子（AuNP）探針相結(jié)合開發(fā)出一種新的視覺(jué)診斷方法，利用肉眼進(jìn)行AuNP聚集的比色檢測(cè)，成為一種可靠手段以促進(jìn)AuNP探針在DNA檢測(cè)中的應(yīng)用［31］。該視覺(jué)診斷方法主要包括3個(gè)步驟：RPA、AuNP探針雜交以及視覺(jué)檢測(cè)。首先利用RPA擴(kuò)增目的片段，然后將AuNP探針加入到RPA反應(yīng)體系中，并與H2NOH和HAuCl4混合促進(jìn)AuNP的生長(zhǎng)。DNA的數(shù)量和序列相似性會(huì)影響AuNP的生長(zhǎng)與其大小形狀，而它們大小和形狀的不同會(huì)擁有不同的顏色與紫外或可見光譜［32］。

用生物傳感器AuNP探針識(shí)別RPA擴(kuò)增子能夠形成不同顏色的可見溶液，如紫紅色，紫色，藍(lán)紫色，深藍(lán)色［31］。RPA結(jié)合AuNP探針與比色法應(yīng)用于番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）的檢測(cè)中，方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間較短（共20 min），通過(guò)觀察AuNP的顏色變化快捷簡(jiǎn)便地用肉眼完成DNA的可視化檢測(cè)，且具有較高的靈敏度［31］。這種技術(shù)提供了一種植物病毒檢測(cè)結(jié)果可視化的新方法，可以提高AuNP聚合的比色檢測(cè)在定性和定量分析中的可靠性，從而促進(jìn)AuNP探針在DNA檢測(cè)中的應(yīng)用，在植物病毒檢測(cè)的發(fā)展過(guò)程中具有一定潛力。

2.5 RPA結(jié)合CRISPR/Cas系統(tǒng)

研究人員最初在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了規(guī)律間隔成簇的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）的 存 在，后 來(lái)又發(fā)現(xiàn)了CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR associated protein，Cas）。近年來(lái)，CRISPR/Cas系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于基因工程、分子免疫以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控中［33-35］。如今，RPA可與CRISPR/Cas技術(shù)結(jié)合起來(lái)，用于快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)病毒核酸，且RT-RPA-CRISPR/Cas12a已被開發(fā)并應(yīng)用于植物RNA病毒的檢測(cè)［36-37］。該技術(shù)首先通過(guò)RT-RPA于等溫條件在單獨(dú)離心管中擴(kuò)增目標(biāo)序列，而后將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入含有Cas12a、crRNA等檢測(cè)試劑的新管中，CRISPR/Cas12a激活核酸酶活性并進(jìn)行檢測(cè)［37］。將RPA與CRISPR/Cas12a相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)具有高特異性與敏感性，在植物病毒檢測(cè)領(lǐng)域還屬于有待發(fā)展的新技術(shù)。

3 RPA在植物病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

近年來(lái)，RPA技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物研究等許多領(lǐng)域的各類核酸的檢測(cè)中［38］。RPA于2006年首次報(bào)道，直到2014年才開始運(yùn)用在植物病毒檢測(cè)領(lǐng)域，發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)量在發(fā)展初期沒(méi)有明顯增長(zhǎng)，2017年之后文獻(xiàn)數(shù)量逐年呈上升趨勢(shì)?？梢娫诟黝愌芯恐幸寻l(fā)展成熟的RPA在植物病毒檢測(cè)方向還是一個(gè)新興的技術(shù)，直到近幾年才產(chǎn)生較大影響并逐漸成為熱點(diǎn)。

不斷發(fā)展的RPA與其他檢測(cè)手段相結(jié)合，逐漸成為代表性的恒溫?cái)U(kuò)增方法，已應(yīng)用于多種植物病毒的檢測(cè)中（表1），并在不斷改進(jìn)中成為一種被許多研究學(xué)者運(yùn)用的重要手段。截至2021年1月31日，通過(guò)在NCBI PubMed以及知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，將RPA在植物病毒及類病毒中應(yīng)用的中文與外文文獻(xiàn)總結(jié)成表，共包含46篇文獻(xiàn)（圖2），檢測(cè)出35種植物病毒及4種類病毒。

圖2 植物病毒領(lǐng)域發(fā)表的RPA相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)量Fig. 2 Number of RPA-related literature published in the field of plant viruses

表1 RPA在植物病毒檢測(cè)中的應(yīng)用Table 1 Application of RPA in plant virus detection

續(xù)表 Continued

在植物病毒檢測(cè)中，溫度與反應(yīng)時(shí)間是RPA技術(shù)最常見的優(yōu)化方向，大多數(shù)研究都將溫度控制在37-42℃的范圍內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間則主要集中在20-40 min。在靈敏度方面，RPA技術(shù)的檢出限能夠達(dá)到10-7稀釋度的RNA、1拷貝的DNA或1 fg的RNA體外轉(zhuǎn)錄物。RPA技術(shù)的一大優(yōu)勢(shì)是在樣品的準(zhǔn)備過(guò)程中，除利用核酸提取試劑盒提取RNA或DNA之外，還可使用較為便捷的粗提物作為模板，避免復(fù)雜的樣品制備過(guò)程，減少時(shí)間成本，適合應(yīng)用于條件有限的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)［74］。

經(jīng)過(guò)十幾年的發(fā)展，RPA技術(shù)已經(jīng)在世界上成功應(yīng)用于動(dòng)植物病原體、轉(zhuǎn)基因生物等多領(lǐng)域的分子檢測(cè)與鑒定中。植物病毒為害農(nóng)作物并在世界范圍內(nèi)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，許多基于RPA的方法被開發(fā)用于檢測(cè)不同植物病毒，這些報(bào)道已成為植物病毒學(xué)發(fā)展的重要基石。相比需要核酸提取等試劑盒與熱循環(huán)儀器的PCR等分子檢測(cè)手段，作為一種成功的替代方法，RPA不但特異性、靈敏度高，還能加快植物病毒檢測(cè)的過(guò)程，顯著降低時(shí)間與人力成本，有助于減少植物病毒的傳播并限制病毒的流行［41，69］。不過(guò)，RPA還存在一些問(wèn)題有待進(jìn)一步發(fā)展，如引物設(shè)計(jì)軟件的開發(fā)等。即便如此，RPA作為一種簡(jiǎn)單快捷的檢測(cè)技術(shù)，已成為植物病毒檢測(cè)研究中一筆寶貴財(cái)富。

4 結(jié)語(yǔ)

RPA技術(shù)最大的潛力是方法相對(duì)直接簡(jiǎn)便，不具備相關(guān)技能的人員也能迅速掌握，未來(lái)在田間植物病毒檢測(cè)應(yīng)用中具有廣闊的前景?；谄浞€(wěn)定性、靈敏性、便捷性，RPA被稱為有望替代甚至超越PCR的技術(shù)，已經(jīng)進(jìn)入飛速發(fā)展時(shí)期。雖然目前RPA試劑成本比PCR高，但其時(shí)間與人力成本相對(duì)較低，相信在不斷深入研究后可降低試劑成本，獲得更加完善的反應(yīng)裝置與技術(shù)，在植物病毒檢測(cè)領(lǐng)域更好地應(yīng)用與發(fā)展。