茶樹原位轉(zhuǎn)化方法的建立

周承哲 常笑君 朱晨 程春振 陳裕坤 賴鐘雄林玉玲 郭玉瓊

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)茶產(chǎn)業(yè)研究院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；3. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福州 350002）

茶樹（Camellia sinensis（L.）O. Kuntze）系山茶科山茶屬多年生常綠木本植物，其葉片常用于加工成世界上銷量最大的無酒精飲料——茶［1］。茶因富含茶多酚、茶氨酸及咖啡堿等多種特征性次生代謝物，具有卓越的保健功效及優(yōu)異的風(fēng)味品質(zhì)［2］。在茶樹基礎(chǔ)生物學(xué)研究中，特征次生代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制是研究熱點(diǎn)［3-5］。為精確研究與茶樹優(yōu)良性狀相關(guān)基因的功能，提升突破性茶樹新品種的選育效率，亟需建立一套高效、穩(wěn)定的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系。

迄今，茶樹基因功能驗(yàn)證大多依賴擬南芥和煙草等模式植物的異源表達(dá)系統(tǒng)［6-8］。然而，生物合成網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和多樣性，往往使得異源表達(dá)系統(tǒng)不適用于茶樹特征基因功能鑒定。而茶樹基因功能基礎(chǔ)研究的缺失，也制約了生產(chǎn)上急需的突破性新品種定向選育。此外茶樹具有童期長(zhǎng)，優(yōu)良性狀難以早期鑒定等特點(diǎn)，導(dǎo)致依賴于系統(tǒng)選種和雜交育種的傳統(tǒng)茶樹育種手段效率低下［9］。2001年，Mondal等［10］首次建立了一種以茶樹子葉為外植體誘導(dǎo)體胚發(fā)生的遺傳轉(zhuǎn)化體系，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)基因茶樹。此后，陸續(xù)有基于組織培養(yǎng)成功在茶樹本物種上實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的案例［11-12］。

由于茶樹體胚富含多酚類物質(zhì)，且體胚的誘導(dǎo)、成熟和萌發(fā)時(shí)間較長(zhǎng)，使得茶樹組織培養(yǎng)過程中存在嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象，且可重復(fù)性差。因此，現(xiàn)階段依賴于組織培養(yǎng)的茶樹轉(zhuǎn)基因體系普遍實(shí)施周期長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化率低，難以獲得轉(zhuǎn)基因植株［13-14］。1987年，F(xiàn)eldmann和Marks建立了一種直接利用農(nóng)桿菌菌液浸泡萌發(fā)的擬南芥種子獲得轉(zhuǎn)基因植株的原位轉(zhuǎn)化方法［15］。該方法具有不依賴于組織培養(yǎng)、操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)周期短及轉(zhuǎn)化效率高等特點(diǎn)，已成功在 棉 花（Gossypium hirsutum）［16］、白 菜（Brassica campestris）［17］、番 茄（Solanum lycopersicum）［18］、沙 田 柚（Citrus maxima）［19］、伏 令 夏 橙（Citrus sinensis）［20］及龍眼（Dimocarpus longan）［21］等園藝植物上取得應(yīng)用，為建立高效穩(wěn)定的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系提供新的思路。

本研究以去頂芽和腋芽的茶樹實(shí)生幼苗為轉(zhuǎn)化受體，利用根癌農(nóng)桿菌侵染茶苗傷口，經(jīng)抗性篩選獲得陽性茶樹轉(zhuǎn)基因植株。該茶樹原位轉(zhuǎn)化方法將為茶樹基因功能研究和種質(zhì)創(chuàng)新奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟健康的‘鐵觀音’、‘白葉1號(hào)’和‘龍井43’茶樹實(shí)生幼苗來自福建農(nóng)林大學(xué)南區(qū)茶山試驗(yàn)基地。

根癌農(nóng)桿菌（EHA105）和pCAMBIA1301質(zhì)粒均由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所保存［22］。

1.2 方法

1.2.1 茶樹實(shí)生幼苗去頂芽和腋芽處理 用單蒸水清洗成熟健康的‘鐵觀音’、‘白葉1號(hào)’和‘龍井43’茶樹種子，直播于含有營(yíng)養(yǎng)土（珍珠巖∶蛭石∶泥炭土=1∶1∶2）的塑料花盆中，置于光照培養(yǎng)箱25℃暗培養(yǎng)至含有4片真葉的茶樹幼苗，然后用消毒的切片刀切除頂芽和腋芽，保留真葉備用。

1.2.2 根癌農(nóng)桿菌侵染液的制備 將根癌農(nóng)桿菌菌液（攜帶pCAMBIA1301質(zhì)粒）加入25 mL YEB（Yeast Extract Mannitol Broth）液體培養(yǎng)基（含有50 mg/L Kan和50 mg/L HYG）中，于恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱（28℃、轉(zhuǎn)速200 r/min）中暗培養(yǎng)。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定農(nóng)桿菌菌液濃度，當(dāng)OD600值達(dá)0.6-0.8時(shí)，使用高速離心機(jī)（轉(zhuǎn)速4 000 r/min，離心5 min）收集菌體。利用25 mL的MS（Murashige and Skoog）液體培養(yǎng)基（含10 mmol/L的MgCl2和100 μmol/L的AS）重懸收集獲得的菌體，于28℃振蕩培養(yǎng)，測(cè)定菌液OD600值至0.6-0.8時(shí)，用于后續(xù)侵染茶樹實(shí)生苗。

1.2.3 農(nóng)桿菌侵染茶樹幼苗及共培養(yǎng) 用封口膜在切口周圍纏成漏斗狀，吸取根癌農(nóng)桿菌菌液注入漏斗狀封口膜，以侵染切口。侵染40 min后，棄盛有菌液的漏斗狀封口膜。為防止切口失水，立即用封口膜封住切口保濕，置于培養(yǎng)箱中于28℃暗培養(yǎng)2 d。利用雙蒸水以相同的方法侵染茶樹幼苗作為陰性對(duì)照。

1.2.4 抗性芽篩選 打開覆蓋切口的封口膜，用蘸有60 mg/L的HYG溶液的棉簽擦拭切口處2次，并留下一滴HYG溶液后，重新用封口膜封住切口，于25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。當(dāng)切口處長(zhǎng)出抗性芽后再補(bǔ)光繼續(xù)培養(yǎng)至2-3片真葉，用于后續(xù)鑒定。

1.2.5 再生抗性芽的分子生物學(xué)鑒定 分別取0.1g抗性芽及未轉(zhuǎn)化的再生植株葉片，采用改良后的CTAB法提取茶樹基因組DNA［23］。以抗性芽gDNA為模板，利用GUS標(biāo)記基因引物和HYG標(biāo)記基因引物（表1）進(jìn)行PCR檢測(cè)驗(yàn)證。參考陳裕坤等［21］建立的PCR反應(yīng)體系。以未轉(zhuǎn)化的再生植株gDNA為模板作為陰性對(duì)照。參照Zhou等［24］的基因克隆方法，將抗性芽擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、連接轉(zhuǎn)化后委托鉑尚生物技術(shù)（福州）有限公司測(cè)序。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequenle information

1.2.6 陽性再生抗性芽扦插 當(dāng)抗性芽長(zhǎng)至10 cm左右，木質(zhì)化程度約2/3時(shí)，用以扦插。剪取長(zhǎng)度約3 cm帶有一片成熟葉和一個(gè)飽滿腋芽的穂條，確保剪口平滑，與母葉呈平行的斜面。為提高插穗的成活率，將剪口浸在62.5 g/L的生根粉溶液中1min，然后斜插于被水浸潤(rùn)的穴盤營(yíng)養(yǎng)土中，深度為穗條長(zhǎng)度的2/3至葉柄與土層表面平齊。邊扦插邊將插穗附近的土稍壓實(shí)，扦插后立即澆水，置于25℃溫室中暗培養(yǎng)。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因植株回收處理 對(duì)轉(zhuǎn)基因過程中所使用的各類材料包括穴盤、封口膜、鑷子、侵染液和營(yíng)養(yǎng)土等進(jìn)行回收與滅菌處理，防止轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒向環(huán)境釋放。

2 結(jié)果

2.1 茶樹抗性芽再生

約3周齡茶樹實(shí)生幼苗長(zhǎng)至含有4片真葉，且尚未木質(zhì)化時(shí)可進(jìn)行去頂芽和腋芽處理，利用根癌農(nóng)桿菌菌液侵染傷口，共培養(yǎng)2 d后，即利用HYG進(jìn)行抗性篩選，最終抗性芽再生率超過90%，共獲得299個(gè)抗性芽（圖1）。暗培養(yǎng)2-3周后，所有抗性芽均從茶苗腋芽的傷口處再生，且每株都只能長(zhǎng)出一個(gè)抗性芽，去頂芽的傷口處無一長(zhǎng)出再生芽。當(dāng)植株長(zhǎng)出抗性芽之后，再對(duì)茶苗進(jìn)行光照培養(yǎng)。約2-3周后，抗性芽逐漸長(zhǎng)大，當(dāng)擁有2-3片葉時(shí)，可對(duì)其進(jìn)行陽性鑒定。

2.2 轉(zhuǎn)基因茶樹再生芽陽性鑒定

獲得的299個(gè)抗性芽中，‘鐵觀音’、‘白葉1號(hào)’和‘龍井43’再生芽分別為86、134和79個(gè)，分別取所有再生芽的葉片0.1 g用以提取gDNA后進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明，不同茶樹品種轉(zhuǎn)化率有所不同，‘鐵觀音’轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到8.14%（7/86）；‘白葉1號(hào)’次之，轉(zhuǎn)化率為2.99%（4/134）；‘龍井43’的轉(zhuǎn)化率最低，為2.53%（2/79）。所有陽性再生芽中，GUS和HYG標(biāo)記基因經(jīng)多次PCR檢測(cè)仍為陽性（圖2），且PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GUS和HYG片段序列一致，表明PCR檢測(cè)結(jié)果可信度高。

圖2 轉(zhuǎn)基因植株的標(biāo)記基因檢測(cè)Fig. 2 Detection of marker genes in the transgenic plants

2.3 轉(zhuǎn)基因植株扦插

當(dāng)再生芽長(zhǎng)至10 cm左右，且有2/3木質(zhì)化時(shí)，即可剪取穂條進(jìn)行短穗扦插（圖1-I，J），扦插后的轉(zhuǎn)基因插穗的生長(zhǎng)和發(fā)育狀況正常，能長(zhǎng)出新芽。插條生長(zhǎng)過程中，又對(duì)其進(jìn)行多次標(biāo)記基因的PCR鑒定，結(jié)果依舊為陽性，表明利用茶樹原位轉(zhuǎn)化獲得陽性再生芽后，可通過扦插方式快速獲得茶樹轉(zhuǎn)基因植株。

圖1 茶樹轉(zhuǎn)基因植株的獲得Fig. 1 Process of obtaining transgenic tea plants

3 討論

迄今，茶樹基因功能研究主要通過體外試驗(yàn)或依賴于擬南芥、煙草等模式植物的異源表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證［25］。然而，生物合成網(wǎng)絡(luò)具有復(fù)雜性、多樣性及特異性。例如，茶樹富含兒茶素、茶氨酸及咖啡堿等多種特異代謝物［1］，在擬南芥或煙草體內(nèi)往往缺乏相關(guān)合成底物，使得異源表達(dá)系統(tǒng)不適用于茶樹特征基因功能鑒定及調(diào)控關(guān)系研究。與模式植物相比，茶樹基礎(chǔ)分子理論的研究相對(duì)薄弱，這也制約了突破性茶樹新品種定向選育。針對(duì)以上問題，Zhou等［26］建立了一種高效、簡(jiǎn)便的茶樹葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體提取方法，可廣泛應(yīng)用于茶樹特征次生代謝物合成調(diào)控基因的瞬時(shí)表達(dá)研究。然而，茶樹仍舊缺乏一套高效穩(wěn)定的永久轉(zhuǎn)化體系。

目前，茶樹轉(zhuǎn)基因主要通過依賴組織培養(yǎng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，但大量研究發(fā)現(xiàn)茶樹體內(nèi)富含抑菌性多酚類物質(zhì)是建立高效、穩(wěn)定茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的主要障礙［11-12，27-28］。一方面，茶樹組織培養(yǎng)過程中，外植體組織會(huì)釋放大量酚類物質(zhì)，進(jìn)而聚合成暗黑色的大分子化合物，導(dǎo)致外植體產(chǎn)生嚴(yán)重褐化，影響再生植株誘導(dǎo)［29］；另一方面茶多酚具有強(qiáng)力的抗菌作用，在轉(zhuǎn)化過程中會(huì)抑制農(nóng)桿菌活性，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化率［30］。此外，茶樹組織培養(yǎng)誘導(dǎo)體胚難度較大、體胚成熟和萌發(fā)所需時(shí)間較長(zhǎng)，也嚴(yán)重影響了轉(zhuǎn)基因效率［11］。綜上，現(xiàn)有的茶樹轉(zhuǎn)基因體系仍舊無法突破轉(zhuǎn)化效率低，再生能力差的瓶頸。本研究建立的茶樹原位轉(zhuǎn)化方法無需準(zhǔn)備茶樹無菌試管苗，無需誘導(dǎo)胚狀體，無需繼代轉(zhuǎn)接抗性芽，與現(xiàn)有的茶樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，具有操作步驟簡(jiǎn)便，實(shí)施成本低，試驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)。

茶樹原位轉(zhuǎn)化具體實(shí)施過程中，抗性芽再生率是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的原位轉(zhuǎn)化能否成功的關(guān)鍵因素。本研究利用可拉伸的封口膜，在茶樹切口處纏繞成漏斗形后進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，可使菌液既不外漏又可與傷口充分接觸，提高了轉(zhuǎn)化效率。在共培養(yǎng)階段，維持植株被侵染傷口的濕度對(duì)抗性芽再生至關(guān)重要［31］。在沙田柚的原位轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)，傷口被封口膜包裹的幼苗能比傷口沒有被包裹的幼苗再生更多的抗性芽［19］。其次，農(nóng)桿菌侵染植株傷口后進(jìn)行暗培養(yǎng)也是促進(jìn)抗性芽再生的重要措施，研究表明暗培養(yǎng)有助于柑橘轉(zhuǎn)基因抗性芽再生［31-32］。因此，本研究利用封口膜包裹經(jīng)HYG篩選后的茶樹幼苗傷口同樣可起到保濕的效果，并且在共培養(yǎng)之初，同樣采用暗培養(yǎng)，在此基礎(chǔ)上茶樹抗性芽再生率可達(dá)到90%以上。待到長(zhǎng)出再生芽之后再進(jìn)行光照培養(yǎng)可加快再生芽的生長(zhǎng)速度。此外，本研究發(fā)現(xiàn)茶樹抗性芽只能從去腋芽的傷口處再生，推測(cè)是由于去腋芽的傷口處生長(zhǎng)代謝旺盛，芽的再分化能力強(qiáng)，容易誘導(dǎo)不定芽。因此，對(duì)去腋芽處的傷口進(jìn)行侵染有利于提高轉(zhuǎn)化率。

扦插是利用植物“細(xì)胞的全能性”進(jìn)行快速無性繁殖的方法，也是現(xiàn)階段茶樹育苗的主要手段，具有繁殖系數(shù)大，發(fā)根成苗快的優(yōu)點(diǎn)［33］。建立原位轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)基因再生芽后，通過短穗扦插可獲得生長(zhǎng)和發(fā)育狀況正常的扦插苗，因此，每一個(gè)陽性的再生芽即為一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，與依賴組培的傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法相比，大大加速了獲得轉(zhuǎn)基因植株的周期。綜上所述，本研究建立的茶樹原位轉(zhuǎn)化方法為茶樹基因功能研究和種質(zhì)創(chuàng)新奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)茶樹缺乏高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系問題，建立了一種不依賴組織培養(yǎng)的茶樹原位轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因方法。經(jīng)過抗性篩選，成功獲得轉(zhuǎn)基因再生芽。‘鐵觀音’、‘白葉1號(hào)’和‘龍井43’的轉(zhuǎn)化率分別為8.14%、2.99%和2.53%。剪取轉(zhuǎn)基因再生芽進(jìn)行短穗扦插，插穗的生長(zhǎng)和發(fā)育狀況正常，可成功獲得茶樹轉(zhuǎn)基因植株。