鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗中通過吸光度值測定菌液濃度的方法研究

周 謖 ，李 睿，朱鴻雁，張志超，方 靜，唐黎明，

(1．上海市食品藥品檢驗所，上海 201203；2．化妝品監(jiān)測評價重點(diǎn)實驗室，上海 201203)

鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗，也稱作Ames試驗，由Bruce Ames教授于1970年建立[1]。Ames試驗是一個廣泛應(yīng)用的通過細(xì)菌檢測化合物突變性的試驗，通常使用營養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)。它可以檢測90%的化學(xué)致癌物和非致癌物[2]。由于此試驗方便、快捷、檢出率高，因此已被各大實驗室廣泛應(yīng)用。

Ames試驗中最主要的試驗材料就是過夜培養(yǎng)的菌液，菌液的濃度、活性對試驗的結(jié)果影響很大。諸多試驗規(guī)范和參考文獻(xiàn)中列出了對菌液濃度的要求為活菌數(shù)(1～2)×109個/mL[2-3]，雖然作出了這項規(guī)定，但如何獲得此濃度的菌液仍是一個問題，有規(guī)范標(biāo)示37℃、100 r/min培養(yǎng)10 h或37℃靜置16 h即可達(dá)到這一濃度[4-5]，但是卻沒有任何試驗證明，且不同實驗室菌液擴(kuò)增的體系不同、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱的型號不同也會導(dǎo)致不同的結(jié)果，即使按上述條件操作也未必能獲得上述濃度的菌液。由于菌液的濃度在一定的范圍內(nèi)和其吸光度值[D(λ)值，λ為波長數(shù)值]呈正比，因此本試驗中，擬尋找出通過吸光度值測定鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗中菌液濃度的方法。

1.1 材料

1.1.1 菌種 營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA102購于美國Moltox公司。

1.1.2 試劑 2號營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購于英國Oxoid公司，瓊脂粉購于美國BD公司，0.9%生理鹽水購于華裕(無錫)制藥有限公司，L-組氨酸和D-生物素購于美國Sigma公司。

1.1.3 儀器 LA2-6AX生物安全柜購于新加坡ESCO公司，BD240恒溫培養(yǎng)箱購于德國Binder公司，Vortex-Genie2漩渦混合器購于美國Scientific Industries公司，INNOVA 40R恒溫培養(yǎng)搖床購于德國Eppendorf公司，數(shù)顯恒溫金屬浴購于美國Boekel公司，CKX41SF倒置顯微鏡購于德國Leica公司，Spectra Max Plus384酶標(biāo)分析儀購于美國Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 測定波長的確定取培養(yǎng)過夜的營養(yǎng)肉湯和菌液，按每孔100μL加入96孔板，每個樣本加8個復(fù)孔，用酶標(biāo)儀測定540和600 nm波長下菌液的吸光度值，選取吸光度值較大的波長數(shù)值。

1.2.2 菌液擴(kuò)增時間取頂層瓊脂500 mL，加熱融化后，加入50 mL組氨酸-生物素，混勻，按每管2 mL分裝，再每管加入0.5 mL PBS，備用。

從-80℃冰箱中取出凍存的菌液，37℃融化后，按每25μL菌液加入5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的比例擴(kuò)增，放入旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱，于37℃、100 r/min條件下培養(yǎng)，選取接種后0、2、4、6、8、10、12、14 h共8個時間點(diǎn)，取出菌液，按每孔100μL加入96孔板，每個時間點(diǎn)加8個復(fù)孔，同時將培養(yǎng)相同時間的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為本底對照，用酶標(biāo)儀于540 nm波長下測定D(540)值。

同時取上述8個時間點(diǎn)的菌液，進(jìn)行平板菌落計數(shù)。取每個時間點(diǎn)的菌液1 mL，加入9 mL生理鹽水，混勻，此稀釋倍數(shù)為1×101倍；再從此稀釋倍數(shù)中吸取菌液1 mL，加入9 mL生理鹽水，混勻，此稀釋倍數(shù)為1×102倍；按此10倍稀釋的方法逐步稀釋成1×101～1×1010倍共10個稀釋倍數(shù)。每個稀釋倍數(shù)取0.1 mL加入已準(zhǔn)備好的頂層瓊脂，在振蕩器上混勻，澆入營養(yǎng)肉湯平板，鋪勻。每個稀釋倍數(shù)重復(fù)制作3皿，待冷凝后，倒置放入培養(yǎng)箱，24 h后選取1×101～1×1010共10個個稀釋倍數(shù)中平皿總菌落數(shù)在30～300范圍內(nèi)的平皿進(jìn)行計數(shù)，計算3皿菌落數(shù)均值，將菌落數(shù)均值乘以稀釋倍數(shù)，得到各時間點(diǎn)的菌液濃度。菌液濃度的計算公式為：菌液濃度(個/mL)=菌落數(shù)均值×進(jìn)行菌落計數(shù)的稀釋倍數(shù)×10。以菌液擴(kuò)增時間為橫坐標(biāo)，菌液濃度和D(540)值為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長曲線，確定菌液最佳擴(kuò)增時間。

1.2.3 菌液D(540)值和平板菌落計數(shù)法測定菌液濃度取頂層瓊脂500 mL，加熱融化后，加入50 mL組氨酸-生物素，混勻，按每管2 mL分裝，再每管加入0.5 mL PBS，備用。

根據(jù)1.2.2中確定的最佳擴(kuò)增時間擴(kuò)增菌液，取擴(kuò)增好的菌液5 mL，加入5 mL營養(yǎng)肉湯，混勻，此稀釋倍數(shù)為1×21倍；再從此稀釋倍數(shù)中吸取菌液5 mL，加入5 mL營養(yǎng)肉湯，混勻，此稀釋倍數(shù)為1×22倍；按此2倍稀釋的方法逐步稀釋成1×21～1×29倍共9個稀釋倍數(shù)；未進(jìn)行任何稀釋的菌液記為1×20倍(見表1)。取1×20～1×29共10個稀釋倍數(shù)的菌液，按每孔100 μL加入96孔板，每個稀釋倍數(shù)加8個復(fù)孔，同時將培養(yǎng)相同時間的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為本底對照，測定D(540)值。

表1 菌液D(540)值測定和平板菌落計數(shù)時的稀釋倍數(shù)

取1×20～1×29共10個稀釋倍數(shù)的菌液，按1.2.2中的方法進(jìn)行平板菌落計數(shù)(見表1)。以各稀釋倍數(shù)的D(540)值為橫坐標(biāo)，菌液濃度為縱坐標(biāo)，作散點(diǎn)圖，求回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 吸光度值測定波長

培養(yǎng)過夜的營養(yǎng)肉湯和菌液在96孔板中分別測定了D(540)值和D(600)值，測得8個復(fù)孔的吸光度值見表2。在540 nm下菌液的吸光度值顯著高于600 nm，因此選取吸光度值較大的540 nm進(jìn)行測定。

表2 營養(yǎng)肉湯和菌液在不同測定波長下的吸光度值

2.2 菌液擴(kuò)增時間

根據(jù)不同擴(kuò)增時間下的D(540)值-菌液濃度繪制曲線見圖1。菌液的吸光度值基本呈現(xiàn)出了逐漸上升的趨勢，而菌液濃度在培養(yǎng)2 h后迅速升高，約10 h達(dá)到最高值，隨后逐漸下降，因此最佳的擴(kuò)增時間為培養(yǎng)10 h。

圖1 不同擴(kuò)增時間下的D(540)值和菌液濃度

2.3 菌液D(540)值和菌液濃度測定

菌液在1×20～1×29等10個稀釋倍數(shù)測定了吸光度值，8個復(fù)孔的D(540)值(扣除營養(yǎng)肉湯的本底值)結(jié)果見表3。

表3 菌液D(540)值的測定

根據(jù)表3各復(fù)孔的D(540)值分別計算1×20～1×29共10個稀釋倍數(shù)的D(540)均值，選取1×101～1×1010共10個稀釋倍數(shù)中平板菌落數(shù)在30～300范圍內(nèi)的稀釋倍數(shù)計算出菌液濃度，結(jié)果見表4。

表4 菌液濃度的計算和選擇

以1×20～1×29共10個稀釋倍數(shù)的D(540)均值為橫坐標(biāo)，菌液濃度為縱坐標(biāo)，作散點(diǎn)圖(見圖2)。設(shè)置截距為0后，添加趨勢線，可得直線回歸方程y=4×109x(R2=0.999 6，方程中x為D(540)值，y為菌液濃度，單位為個/mL)。

圖2 D(540)值-菌液濃度圖(第1次)

隨后，按照相同的方法選取了另一株凍存的菌株TA102進(jìn)行了重復(fù)測試，確認(rèn)直線回歸方程的準(zhǔn)確性。選取1×20～1×29共10個稀釋倍數(shù)，測得的D(540)值和菌液濃度結(jié)果見表5，繪制的D(540)值-菌液濃度圖見圖3。

表5 第2次試驗測定的D(540)值和菌液濃度

圖3 D(540)值-菌液濃度圖(第2次)

根據(jù)同樣的方法，可得直線回歸方程y=4×109x(R2=0.992 8，方程中x為D(540)值，y為菌液濃度，單位為個/mL)。

3 討論

由于培養(yǎng)過程中菌液濃度是一個動態(tài)變化的過程，因此如何準(zhǔn)確的得出所要菌液的濃度一直是一個讓試驗人員頭疼的問題。常用的方法包括比濁法和平皿計數(shù)法，但是濁度儀在實驗室中并不普及，而平板菌落計數(shù)法需要等24 h后菌落長出方可計數(shù)，有一定的時間延遲，故也不方便應(yīng)用[6]。由于菌液濃度和吸光度值之間存在線性關(guān)系，故可以通過吸光度值的測定來判斷菌液濃度。林靜等[7]報道了在600 nm測定5種常見致病菌的吸光度值，段夢奇等[8]發(fā)現(xiàn)550 nm比600 nm更適用于百日咳菌液的吸光度值測定，計芬芬等[9]比較了各種波長，認(rèn)為國內(nèi)微生物定量細(xì)菌一般使用600 nm。對于Ames試驗中所用到的營養(yǎng)缺陷性鼠傷寒沙門氏菌，有的研究人員在540 nm下測定吸光度值，認(rèn)為D(540)值在0.1～0.2的范圍內(nèi)可滿足試驗要求[2]，有的研究人員在600 nm下測定吸光度值[10]，因此在本試驗中主要選擇這兩個波長進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在540 nm時菌液的吸光度值顯著高于600 nm，因此選擇540 nm測定。

Ames試驗中，菌液的濃度對試驗影響較大，如菌液濃度太低，則會降低試驗的敏感性[10]，如果菌液濃度太高，則細(xì)菌的活力會下降。針對本實驗室凍存的營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌，通過接種后連續(xù)測定其0～14 h的菌液濃度和D(540)值，發(fā)現(xiàn)菌液的濃度變化基本呈現(xiàn)一個“S形”曲線，大約在培養(yǎng)10 h后達(dá)到了菌液的最大濃度，雖然此后吸光度值仍在上升，但是活菌數(shù)卻在下降，這是由于死亡的菌體也有一定的吸光度值所導(dǎo)致[11]。因此在本試驗中，將接種物放于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱中于37℃、100 r/min培養(yǎng)10 h，即可獲得對數(shù)生長末期的菌液。

各規(guī)范和文獻(xiàn)均要求菌液濃度為活菌的數(shù)目，即CFU(Colony-Forming Units)/mL，通過平板菌落計數(shù)法折算出的菌液濃度就是CFU/mL，和業(yè)內(nèi)要求一致。隨后，本研究通過吸光度值測定和平板菌落計數(shù)法，建立了菌株TA102菌液濃度和吸光度值的直線回歸方程，兩次試驗的結(jié)果均表明菌液濃度和D(540)值之間存在良好的線性關(guān)系，可通過直線回歸方程y=4×109x由D(540)值計算獲得菌液濃度。如菌液的D(540)值(扣除營養(yǎng)肉湯的本底值)在0.25～0.50之間即可保證獲得菌液的濃度在(1～2)×109個/mL。2次試驗培養(yǎng)10 h后獲得的菌液濃度分別為7.50×108個/mL和7.47×108個/mL，未達(dá)到109個/mL，但是考慮到稀釋時的損耗和2個粘連的菌體只會生長出1個CFU，因此平板稀釋法的結(jié)果往往偏低。因此，本擴(kuò)增條件完全可以滿足(1～2)×109個/mL這個范圍。

在條件相同(同一批次凍存的菌液，相同的接種體系，相同的儀器)時，每次擴(kuò)增出來的菌液濃度都應(yīng)相近，即D(540)值相近，每次只需測定菌液的D(540)值(扣除營養(yǎng)肉湯的本底值)是否在0.25～0.50之間即可知道這次擴(kuò)增的菌液濃度是否在(1～2)×109個/mL范圍內(nèi)。如D(540)值太低，則表明生長狀態(tài)不好，菌液濃度不足，無法進(jìn)行試驗；如D(540)值太高，則表明可能產(chǎn)生污染，也無法進(jìn)行試驗。通過TA102菌液擴(kuò)增條件的摸索和確定，證明通過測定菌液吸光度值可對菌液濃度進(jìn)行預(yù)測和質(zhì)量控制，此法科學(xué)、簡單、快捷。