鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯長期暴露對成年雄鼠甲狀腺激素水平的影響

張婉瑩，吳昊宇，董新文，苗新秀楠，冀俊昌，王占舉，那曉琳，張云波

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)是一種增塑劑，被廣泛地應(yīng)用于食品包裝、洗護(hù)用品，醫(yī)療器材等消費品中，人們可通過食物、水、空氣等多種途徑接觸到DEHP[1-2]。與此同時，隨著塑料制品的使用和廢棄，DEHP會逐漸釋放進(jìn)入到環(huán)境中。根據(jù)美國環(huán)保局規(guī)定人均DEHP每日暴露最大量是20μg/kg，人均從生活環(huán)境、食物和水中攝取的DEHP是每日0.1～5μg/kg[3]。DEHP在動物體內(nèi)的急性毒性并不高，半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)在大鼠體內(nèi)的數(shù)值為30.6 g/kg[4-5]。近年來，DEHP被公認(rèn)為是一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)，會對人體造成多種不良影響。以往對DEHP的研究大多是針對雌性大鼠生殖、發(fā)育及各臟器造成的損傷等方面[6-8]。但DEHP對雄性大鼠甲狀腺的研究卻很少，人們忽略了其對甲狀腺不同程度的損害作用，并且這種損害作用在不同年齡段的作用程度可能有所差異。有研究顯示，女性患甲狀腺癌的幾率要高于男性[9]，可能與雌激素水平有關(guān)，DEHP作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物具有類雌激素的作用，那么當(dāng)男性長期暴露在DEHP環(huán)境中時，是否也會增加甲狀腺疾病的發(fā)病率，目前研究尚淺。因此本研究針對成年雄性大鼠在不同劑量DEHP暴露下探究其對甲狀腺激素水平所產(chǎn)生的影響，并嘗試探究其作用機(jī)制，為日后推廣于成人長期暴露DEHP所產(chǎn)生影響提供可靠的理論依據(jù)，同時為人群甲狀腺臨床研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

本研究使用DEHP標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.6%)、水合氯醛、氯化鈉(優(yōu)級純)、硫酸銨(優(yōu)級純)、濃硫酸(優(yōu)級純)、三氧化二砷(優(yōu)級純)、氫氧化鈉(優(yōu)級純)、硫酸鈰銨(優(yōu)級純)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。碘酸鉀(基準(zhǔn)試劑，純度≥99.995%)購自中國上海Aladdin試劑公司。所用胚芽玉米油購自超市。使用超級恒溫水浴振蕩器購自南京順流儀器有限公司，雙光束紫外可見分光光度計購自北京普析儀器有限公司，全自動γ計數(shù)儀(Wallac Wizard-2?2470)購自美國Perkin Elmer公司，酶標(biāo)儀(Cytation3 MFD)購自美國伯騰儀器有限公司。碘(125I)、T3、T4、FT3、FT4、TSH放射免疫分析試劑盒購自北方生物技術(shù)研究所。促甲狀腺激素釋放激素(TRH)ELISA試劑盒、血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)ELISA試劑盒和血清甲狀腺刺激抗體(TSAb)ELISA試劑盒購自上海古朵生物科技有限公司。

1.2 動物實驗

選購北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司繁育的健康的SPF級2月齡的雄性成年Wistar大鼠36只，許可證號為SCXK(京)2016-0006。所有動物實驗取得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物與醫(yī)學(xué)倫理委員會(批準(zhǔn)號2015010)批準(zhǔn)。動物實驗室溫度控制在20～25℃，濕度控制在45%～75%，光照為16～20 lx條件下，每日給予新鮮的蒸餾水和顆粒飼料使其自由進(jìn)食進(jìn)水適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

將動物按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組9只，分別為對照組，低、中、高劑量DEHP暴露組(DEHP含量分別為6%、12%、24%)。動物實驗開始后，每天用玉米油配制含DEHP的暴露樣品，玉米油的配制參照大鼠的NOAEL[10]，采用灌胃的方式分別對低、中、高劑量組進(jìn)行DEHP暴露處理，對照組給予玉米油。根據(jù)體質(zhì)量變化隨時調(diào)整灌胃劑量。每周稱取1次大鼠體質(zhì)量，并觀察大鼠的生長發(fā)育情況是否發(fā)生異常。

1.3 樣品的收集和準(zhǔn)備

飼養(yǎng)3個月后處死之前，將全部大鼠放入代謝籠中，用干凈的玻璃管收集大鼠24 h尿液，1 000 r/min離心10 min后取上清儲存于-80℃冰箱中直至日后檢測分析。用水合氯醛麻醉大鼠，通過腹主動脈采集血樣，靜置直至血樣凝固，3 000 r/min離心15 min獲得血清，用于分析激素水平。

1.4 尿碘水平的測定

尿碘測定方法根據(jù)國家碘缺乏病參照實驗室提供的《WS/T 107-2006尿中碘的砷鈰催化分光光度測定方法》原理實施進(jìn)行。根據(jù)國家碘缺乏病參照實驗室提供的人尿中碘成分分析標(biāo)準(zhǔn)(GBW09109h)進(jìn)行參考分析。

1.5 放射免疫分析RAI

使用北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的放射免疫分析試劑盒，按照使用說明書操作，使用全自動γ計數(shù)儀測定血清中T3、T4、FT3、FT4、TSH水平。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定

使用上海古朵生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的ELISA試劑盒，測定血清中TRH、TTR、TSAb水平。實驗操作過程嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀，以空白孔調(diào)零，在450 nm波長條件下測定每孔吸光度D(450)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將測得的樣品D(450)值代入方程求得樣品的濃度。

1.7 統(tǒng)計方法

所有指標(biāo)均以統(tǒng)計圖統(tǒng)計表的形式體現(xiàn)，所有數(shù)據(jù)分析均使用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0，選用單因素方差分析方法，進(jìn)一步的多重比較采用SNK檢驗方法，結(jié)果以xˉ±s表示。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量

動物實驗開始后，每周稱量大鼠體質(zhì)量，各組大鼠在3個月喂養(yǎng)期的體質(zhì)量變化情況如圖1所示，對照組、低、中、高劑量DEHP暴露組大鼠體質(zhì)量均值增長分別為121.11、125.22、115.68、116.92 g。經(jīng)方差分析，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 成年雄性大鼠體質(zhì)量均值變化趨勢圖

2.2 大鼠甲狀腺濕重與臟體比

甲狀腺濕重及臟體比的改變可宏觀的體現(xiàn)DEHP對甲狀腺的影響，本研究測定甲狀腺濕重與甲狀腺臟體比如表1所示，在DEHP暴露3個月后，各劑量組甲狀腺濕重和臟體比與對照組相比均無顯著性差異。

表1 不同劑量組大鼠甲狀腺濕重與臟體比

2.3 大鼠其他組織的臟體比

DEHP對腦、心臟、肝臟、腎臟、胰腺組織質(zhì)量的影響如表2所示，與對照組相比，各劑量組肝臟臟器系數(shù)均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。其他組織臟器系數(shù)未見明顯差異。

表2 不同劑量組大鼠各組織臟體比

2.4 大鼠尿碘水平

對各組大鼠尿液樣本碘含量的檢測結(jié)果如表3所示，DEHP暴露3個月后，與對照組相比，低劑量組與中劑量組大鼠尿碘水平升高。高劑量組與對照組相比尿碘水平明顯降低(P＜0.05)。說明長期暴露DEHP會影響甲狀腺的正常功能。

表3 不同劑量組大鼠尿碘水平

2.5 大鼠甲狀腺激素水平

經(jīng)檢驗及統(tǒng)計分析后，各劑量組大鼠血清T3、T4、FT3、FT4、TSH水平如表4所示，高劑量組大鼠血清FT4水平與對照組相比顯著降低(P＜0.05)。其他甲狀腺激素指標(biāo)差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 不同劑量組大鼠血清甲狀腺激素水平

2.6 各組大鼠TRH、TTR和TSAb水平

大鼠暴露DEHP 3個月后，血清中TRH、TTR、TSAb水平經(jīng)ELISA試劑盒檢測結(jié)果如表5所示，各劑量組大鼠血清TRH、TTR、TSAb水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表5 不同劑量組大鼠TRH、TTR和TSAb水平

3 討論

塑料制品從2000年后開始呈直線式大量生產(chǎn)使用，塑料制品可以說已全面的應(yīng)用到我們的日常生活中，人們無時無刻不在接觸和使用塑料制品。近年來，人們不斷將焦點集中到塑料制品中最具代表性的塑化劑DEHP上。有研究顯示DEHP的暴露會對生殖發(fā)育具有毒性作用且對肝臟及甲狀腺也具有一定的毒性作用[4，11-12]。但近年來隨著甲狀腺疾病的爆發(fā)，人們開始關(guān)注和探索DEHP與甲狀腺疾病之間的關(guān)聯(lián)。對于兒童青少年而言，他們從一出生便開始接觸，因此大量DEHP與甲狀腺的研究均選擇幼齡為研究對象，但對于現(xiàn)在的中老年人群，他們在青年時才逐漸開始大量接觸，并未得到更多的關(guān)注。因此，本研究以成年鼠暴露DEHP為研究對象，想更全面的揭示DEHP對甲狀腺激素水平產(chǎn)生的影響。

本研究選用雄性成年Wistar大鼠作為研究對象，大鼠經(jīng)0、150、300、600 mg/kg DEHP暴露3個月，各劑量組大鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異，說明該劑量范圍內(nèi)對大鼠體質(zhì)量無明顯影響，該體質(zhì)量結(jié)果與李麗萍等[13]的研究相一致。研究者發(fā)現(xiàn)，DEHP的暴露會對幼鼠甲狀腺濾泡細(xì)胞及超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損害作用[14]。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著DEHP暴露劑量的增加，甲狀腺臟體比有所下降，很可能是由于長期高劑量接觸導(dǎo)致甲狀腺濾泡體積變小，腔內(nèi)膠質(zhì)密度下降所致。本研究還發(fā)現(xiàn)，肝臟臟體比呈顯著的上升趨勢，且具有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果提示，長期暴露DEHP會導(dǎo)致肝臟水腫，重量增加，且隨DEHP劑量的增加水腫越明顯，具有一定的肝毒性這與胡帥爾等[15]的研究結(jié)果一致。

尿碘是評價實驗動物體內(nèi)碘含量的一個重要指標(biāo)，其代表著短時間內(nèi)碘在動物體內(nèi)的水平，一般隨餐進(jìn)入體內(nèi)且不會長時間儲存，體內(nèi)碘缺乏相應(yīng)會影響尿碘的水平[16]。當(dāng)長期接觸DEHP使甲狀腺激素水平出現(xiàn)紊亂時，甲狀腺濾泡細(xì)胞鈉碘轉(zhuǎn)運體的生物活性也會受到影響，從而影響細(xì)胞正常攝碘，導(dǎo)致激素生物合成與轉(zhuǎn)運產(chǎn)生阻礙[17-18]。本實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，高劑量組尿碘水平明顯減少且具有統(tǒng)計學(xué)意義，低、中劑量組尿碘水平略有上升。提示維持甲狀腺的正常功能，下丘腦會刺激TTR、TRH的分泌以升高TSH水平，使TSH刺激細(xì)胞攝碘，通過正反饋調(diào)節(jié)來升高機(jī)體內(nèi)的碘水平，因此尿碘水平出現(xiàn)升高，而高劑量組尿碘嚴(yán)重降低，提示在該劑量范圍內(nèi)DEHP嚴(yán)重影響了甲狀腺激素水平，使甲狀腺處于一種機(jī)能減退的狀態(tài)，反饋調(diào)節(jié)已失去作用。本結(jié)果與Dong等[19]的研究結(jié)果一致。

另一方面，血清中的TSH會刺激T3、T4的釋放，而T3、T4承擔(dān)著運輸和儲存碘的工作。FT3、FT4具有一定的生理活性可以更真實地反映出甲狀腺的功能水平[20]。Liu等[21]在研究中發(fā)現(xiàn)，DEHP可降低T3、T4水平，TSH水平未發(fā)現(xiàn)顯著變化。本實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，高劑量組的FT4水平明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；T4、TSH水平略有下降；高劑量組FT3水平升高。結(jié)果說明長期接觸DEHP可以紊亂甲狀腺激素水平的分泌，各激素水平的變化恰恰也符合以上尿碘水平結(jié)果的變化，細(xì)胞攝碘出現(xiàn)紊亂提示甲狀腺的整體合成功能可能已受到影響。與此同時，本實驗還檢測了不同劑量組大鼠促甲狀腺激素釋放激素(TRH)、血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)和血清甲狀腺刺激抗體(TSAb)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTR、TRH水平略有上升，高劑量組TSAb有所下降。當(dāng)甲狀腺激素水平發(fā)生紊亂時，為了維持甲狀腺激素水平，甲狀腺激素水平的下降可能會刺激TTR與TRH的分泌，導(dǎo)致水平升高。因此長期接觸DEHP時，甲狀腺尚可維持機(jī)體功能的正常運行，但長期過量暴露DEHP則會使甲狀腺處于機(jī)能減退狀態(tài)，干擾甲狀腺的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致甲狀腺激素水平發(fā)生紊亂。本研究存在一定的局限性，如僅檢測了甲狀腺的一些基礎(chǔ)性指標(biāo)而未進(jìn)行分子生物學(xué)水平的檢測，同時未能在實驗動物生長發(fā)育的敏感階段進(jìn)行干預(yù)，因此某些影響作用并不能很好的體現(xiàn)，在日后的研究中會更加傾向于分子生物學(xué)水平的研究，以便更好地了解DEHP長期暴露對成年雄鼠甲狀腺作用的影響機(jī)制。