兔多殺性巴氏桿菌C51－17株在疫苗效力檢驗(yàn)中保存方法的研究

張 媛，李 建，張 磊，王秀麗，張立春，丁家波

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

兔多殺性巴氏桿菌病是家兔養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的常見(jiàn)病之一［1－2］，為預(yù)防控制該病中國(guó)許多學(xué)者開展了大量的疫苗研發(fā)工作，已經(jīng)獲得新獸藥證書的產(chǎn)品有兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)三聯(lián)滅活疫苗(皖阜株+C51－17株+蘇84－A株)等11個(gè)產(chǎn)品。這些產(chǎn)品的效力檢驗(yàn)均采用免疫攻毒法進(jìn)行，C51－17株是其常用的攻毒用菌株。該菌株1～5 CFU活菌皮下注射可致死家兔，攻擊的菌數(shù)對(duì)疫苗效力檢驗(yàn)結(jié)果影響很大，因此，攻毒劑量的準(zhǔn)確性在以C51－17株為攻毒菌株的效力檢驗(yàn)中顯得尤為重要。為了保證攻毒劑量準(zhǔn)確，必須對(duì)攻毒菌液濃度有準(zhǔn)確的把握。傳統(tǒng)采用將菌液4℃保存過(guò)夜計(jì)算菌存率及測(cè)定菌液吸光值估算菌液濃度的方法，在實(shí)際檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用這兩種方法估算的菌液濃度往往與攻毒菌液的實(shí)際濃度偏差較大，需要檢驗(yàn)工作的重復(fù)，造成人力、財(cái)力的浪費(fèi)。本試驗(yàn)擬采用將菌液分裝后置－80℃凍存的方法對(duì)菌液進(jìn)行預(yù)數(shù)，并比較了菌液3種不同處理方法對(duì)實(shí)際計(jì)數(shù)結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 兔多殺性巴氏桿菌 C51－17株，由中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬丁肉湯、改良馬丁瓊脂，購(gòu)自北京中海動(dòng)物保健科技公司。

1.1.3 試劑 裂解血細(xì)胞全血，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。新生牛血清，購(gòu)自美國(guó)Hyclone實(shí)驗(yàn)室公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 兔多殺性巴氏桿菌病陰性的健康家兔，2月齡，1.5 kg左右，三批，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.5 主要儀器設(shè)備 GNP－9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。THZ－C型恒溫振蕩器購(gòu)自太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。Herasafe KS生物安全柜購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO－RAD公司。低溫冰箱購(gòu)自日本日立公司。

1.2 方法 本試驗(yàn)將C51－17菌液分別采用置4℃保存過(guò)夜計(jì)算菌存率、測(cè)定菌液吸光值及置－80℃凍存三種處理方法估算菌液濃度，并將上述三種方法獲得的菌液濃度估值與實(shí)值分別通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以確定菌液濃度估值與實(shí)值最為接近的方法，此方法視為攻毒菌液最佳處理方法。對(duì)采用此方法處理過(guò)的菌液的穩(wěn)定性及毒力進(jìn)行了測(cè)定，并將此方法應(yīng)用于疫苗效力檢驗(yàn)，具體試驗(yàn)方法如下:

1.2.1 攻毒菌液最佳處理方法的篩選 按處理方法的不同，試驗(yàn)分A、B、C 3組，每組試驗(yàn)重復(fù)5次。

A組采用4℃過(guò)夜保存法，對(duì)C51－17菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)后將其放置4℃保存過(guò)夜，然后再對(duì)其進(jìn)行一次活菌計(jì)數(shù)，與第一次計(jì)數(shù)結(jié)果比較，計(jì)算出菌液放置4℃過(guò)夜后的菌存率，此過(guò)程為預(yù)數(shù)過(guò)程。按照與第一次培養(yǎng)菌液相同的培養(yǎng)條件再次培養(yǎng)C51－17菌液，對(duì)其進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)后將其放置4℃保存過(guò)夜，根據(jù)菌數(shù)結(jié)果及預(yù)數(shù)計(jì)算的菌存率估算出菌液濃度，同時(shí)對(duì)菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算出菌液濃度實(shí)值。

B組采用測(cè)定菌液吸光值法，用相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)5份C51－17菌液，對(duì)其分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，同時(shí)分別測(cè)定OD450nm值，此過(guò)程為預(yù)數(shù)過(guò)程。按照與第一次培養(yǎng)菌液相同的培養(yǎng)條件再次培養(yǎng)C51－17菌液，測(cè)定其OD450nm值，根據(jù)預(yù)數(shù)菌液OD450nm值對(duì)應(yīng)的菌液濃度，估算出此菌液濃度，同時(shí)對(duì)菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算出菌液濃度實(shí)值。

C組采用－80℃分裝凍存法，將C51－17菌液分裝置2支試管中，每支裝量3 mL，同時(shí)放置－80℃凍存。取出1支室溫融化后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，此過(guò)程為預(yù)數(shù)過(guò)程。至少間隔1 d，將第2支試管取出，室溫融化，預(yù)數(shù)的菌液濃度即為此菌液濃度的估值，對(duì)其進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算出菌液濃度實(shí)值。

采用t檢驗(yàn)分析不同處理方法獲得的菌液濃度估值與其實(shí)值間是否存在顯著差異。首先根據(jù)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)求出平均值ˉx及樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差s，將有關(guān)數(shù)據(jù)代入計(jì)算公式中計(jì)算t值。其次，根據(jù)選定的顯著性水準(zhǔn)α=0.05及df值，由t分布表查得t臨界值。最后，將計(jì)算得到的t值與查表得到的t臨界值比較，如果前者小于后者，則認(rèn)為二者之間無(wú)顯著性差異［3］。t值計(jì)算公式:

式中:x1—第一次檢驗(yàn)測(cè)量數(shù)據(jù)的平均值;x2—第二次檢驗(yàn)測(cè)量數(shù)據(jù)的平均值;s1— 第一次檢驗(yàn)測(cè)量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差;s2—第二次檢驗(yàn)測(cè)量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差;n1—第一次檢驗(yàn)測(cè)量的測(cè)量次數(shù);n2—第二次檢驗(yàn)測(cè)量的測(cè)量次數(shù)。1.2.2 攻毒菌液最佳處理方法的檢定 方法處理過(guò)的菌液的穩(wěn)定性試驗(yàn):將C51－17菌液分裝置5支試管中，每支裝量3 mL，置－80℃凍存。于凍存后1、5、15、25、35 d 分別各取出1 支，室溫融化后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

采用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)方法，測(cè)定Z比分值，用于分析菌液置－80℃保存不同時(shí)間后濃度變化程度。Z比分值采用X、XM、Norm IQR來(lái)確定。Z比分值計(jì)算公式:Z=(X－XM)/Norm IQR，式中:Z為穩(wěn)健比分值;X為檢驗(yàn)數(shù)據(jù);XM為中位值;Norm IQR為標(biāo)準(zhǔn)化四分位距，Norm IQR=0.7413×四分位間距(IQR)。

判定標(biāo)準(zhǔn)為:︱Z︱≤2表示菌液濃度變化不顯著;2＜︱Z︱＜3時(shí)，表示結(jié)果可疑;︱Z︱≥3表示菌液濃度變化顯著。

方法處理過(guò)的菌液的毒力測(cè)定:將置－80℃凍存過(guò)的 C51 －17 菌液稀釋為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 CFU/mL共12個(gè)劑量組，每個(gè)劑量組頸部皮下注射家兔2只，每只注射1 mL，注射后觀察10 d。

方法應(yīng)用于疫苗效力檢驗(yàn)進(jìn)行MLD測(cè)定:用C51－17菌株制備三批氫氧化鋁膠滅活疫苗，每批用兔4只，每只皮下注射疫苗1.0 mL，21 d后與對(duì)照兔4只，各皮下注射 C51－17株1MLD，觀察10 d。三批疫苗效力檢驗(yàn)使用不同批次家兔進(jìn)行，每次攻毒前均需重新測(cè)定C51－17株對(duì)此批家兔的MLD。采用菌液分裝置－80℃凍存法測(cè)定MLD。

2 結(jié)果

2.1 攻毒菌液最佳處理方法篩選試驗(yàn)結(jié)果 3種處理方法獲得菌液濃度估值及實(shí)值計(jì)算方法見(jiàn)表1。

按照與表1相同的方法，每組試驗(yàn)均重復(fù)5次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 3種處理方法第一次試驗(yàn)獲得菌液濃度估值及實(shí)值結(jié)果

表2 三種處理方法獲得菌液濃度估值與實(shí)值結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析

菌液3種處理方法的自由度f(wàn)均為n1+n2－2=8，經(jīng)查 t值表，臨界值均為 t0.05(8)=2.306 。采用將菌液分裝置－80℃凍存法測(cè)定的t值為2.130，小于臨界值2.306，這表明在α=0.05顯著性水平時(shí)，菌液濃度估值與實(shí)值差異不顯著。采用將菌液置4℃保存過(guò)夜法和測(cè)定菌液吸光值法測(cè)定的t值分別為2.437和2.357，均大于臨界值，這表明在α=0.05顯著性水平時(shí)，兩種方法獲得的菌液濃度估值與其實(shí)值間差異顯著。僅將此兩種方法相比較，采用測(cè)定菌液吸光值法測(cè)定的t值較將菌液置4℃保存過(guò)夜法與臨界值更為接近，表明采用測(cè)定菌液吸光值法較將菌液置4℃保存過(guò)夜法更為準(zhǔn)確。

2.2 攻毒菌液最佳處理方法檢定試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 凍存菌液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 菌液凍存時(shí)間及活菌計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3，穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)參數(shù)見(jiàn)表4。

表3 菌液凍存時(shí)間及活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

表4 凍存菌液濃度穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)參數(shù)

結(jié)果顯示，將菌液等量分裝置－80℃凍存1、5、15、25、35 d 菌液濃度檢驗(yàn)結(jié)果︱Z︱均≤2，說(shuō)明菌液凍存35 d內(nèi)濃度變化不顯著。

2.2.2 凍存菌液毒力測(cè)定結(jié)果 12個(gè)劑量組注射兔在10個(gè)觀察日內(nèi)死亡情況見(jiàn)表5，可見(jiàn)，攻毒菌液采用－80℃凍存的方法處理對(duì)菌液毒力沒(méi)有影響，皮下注射3 CFU可致家兔2/2死亡。

表5 凍存菌液毒力測(cè)定結(jié)果

2.2.3 凍存方法應(yīng)用于疫苗效力進(jìn)行MLD測(cè)定檢驗(yàn)結(jié)果 3批疫苗效力檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，結(jié)果表明，采用將攻毒菌液置－80℃凍存的方法進(jìn)行疫苗的效力檢驗(yàn)，能確保對(duì)照成立，說(shuō)明在兔多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗效力檢驗(yàn)中可以采用－80℃凍存的方法進(jìn)行攻毒菌液的預(yù)數(shù)。

表6 疫苗效力檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

從采用菌液分裝置－80℃凍存法與將菌液置4℃保存過(guò)夜法及測(cè)定菌液吸光值法對(duì)菌液濃度的估值與其實(shí)際濃度的偏差來(lái)看，采用菌液分裝置－80℃凍存法估算的菌液濃度與菌液實(shí)際濃度最為接近，從而保證用這種方法進(jìn)行疫苗效力檢驗(yàn)時(shí)，攻擊菌液的劑量與1MLD更為一致，檢驗(yàn)結(jié)果更能反映疫苗質(zhì)量。兔多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗效力檢驗(yàn)周期一般為31 d，本試驗(yàn)結(jié)果表明菌液在不添加任何保護(hù)劑的情況下置－80℃保存35 d，菌數(shù)變化范圍不超過(guò)5%。

為了確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，本研究對(duì)每組試驗(yàn)進(jìn)行了5個(gè)重復(fù)。理想狀態(tài)下，菌液濃度估值與實(shí)值完全一致，二者之差為0，本研究以此理論值作為標(biāo)準(zhǔn)，采用t檢驗(yàn)分析不同處理方法獲得的菌液濃度估值與實(shí)值之差和理論值0之間是否存在顯著差異。t檢驗(yàn)是數(shù)理統(tǒng)計(jì)中一種檢驗(yàn)平均值的檢驗(yàn)方法，可用于檢查分析方法或操作過(guò)程是否存在較大的系統(tǒng)誤差。而在凍存菌液穩(wěn)定性試驗(yàn)中，菌液濃度沒(méi)有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)值，故本研究采用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)方法，通過(guò)測(cè)定Z比分值分析不同凍存時(shí)間獲得菌液濃度的離散程度，Z值越低說(shuō)明不同凍存時(shí)間獲得的菌液濃度越接近。

杜立業(yè)等［4］將酒酒球菌加入保護(hù)劑稀釋的菌體放入液氮冷凍保存6個(gè)月后，菌株存活率仍可達(dá)到99%以上。由于許多從事細(xì)菌類疫苗檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室不具備液氮，因此本試驗(yàn)嘗試將菌液放置－80℃低溫冰箱保存，結(jié)果表明在檢驗(yàn)周期內(nèi)菌液濃度變化不大，可以滿足疫苗效力檢驗(yàn)需要。而且，本試驗(yàn)沒(méi)有在菌液中添加任何保護(hù)劑，避免保護(hù)劑中的某些成分會(huì)對(duì)菌液毒力產(chǎn)生影響，或刺激動(dòng)物出現(xiàn)某種異常反應(yīng)。

從菌液凍存后毒力測(cè)定結(jié)果來(lái)看，凍存對(duì)菌液毒力無(wú)影響，采用菌液分裝置－80℃凍存法進(jìn)行兔多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗效力檢驗(yàn)，可以保證對(duì)照組兔全部死亡，檢驗(yàn)成立。此方法較傳統(tǒng)的將菌液置4℃保存過(guò)夜法及測(cè)定菌液吸光值法大大減少了工作量，且攻擊劑量更準(zhǔn)確。王麗嬋等［5］將制備的百日咳攻擊菌于液氮中保存，4年中毒力無(wú)明顯變化，穩(wěn)定性良好。有液氮保存條件的實(shí)驗(yàn)室可以嘗試將菌液放置液氮中長(zhǎng)期保存，每次測(cè)毒及攻毒前取出一支融化，稀釋后進(jìn)行攻擊，如果這種做法對(duì)菌株毒力沒(méi)有影響，不僅可以進(jìn)一步簡(jiǎn)化檢驗(yàn)操作，而且可以提升檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。在今后工作中將繼續(xù)摸索和探討能促使檢驗(yàn)工作高效準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法。

［1］ 呂惠序，董欽正.兔巴氏桿菌病的防治［J］.農(nóng)業(yè)科技通訊，1981，10:35.

［2］ 蘭小兵，余長(zhǎng)貴.兔巴氏桿菌病的綜合防治研究［C］.重慶:第七屆重慶市飼料工業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略研討會(huì)暨第八屆飼料工業(yè)協(xié)會(huì)會(huì)員大會(huì)論文集，2010.

［3］ 魯秀恒，孔憲忱.如何應(yīng)有t檢驗(yàn)正確評(píng)價(jià)糧油分析檢驗(yàn)結(jié)果［J］.糧油倉(cāng)儲(chǔ)科技通訊，1995，(1):37 －40.

［4］ 杜立業(yè)，王 華，金 剛，等.酒酒球菌液氮超低溫保存［J］.微生物學(xué)報(bào)，2011，51(9):129 －135.

［5］ 王麗嬋，衛(wèi) 辰，張路民，等.百日咳攻擊菌液氮保存毒力穩(wěn)定性的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2012，25(7):118－119.