三種喹諾酮類藥物在雞蛋中殘留消除規(guī)律的研究

章 敏，寧 軍，余軍軍，韋 田，邰 鏑

(廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制企業(yè)重點(diǎn)實驗室，廣東新興527439)

諾氟沙星(norfloxacin，NOR)、氧氟沙星(ofloxacin，OFL)、恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)均屬于喹諾酮類藥物(quinolones，QNs)，該類藥物是一類新型、高效、廣譜、低毒的人工合成抗菌藥，在畜牧養(yǎng)殖中廣泛用于預(yù)防與治療動物疾病，對革蘭氏陽性菌特別是綠膿桿菌，以及革蘭氏陰性菌有效，對支原體、衣原體也有良好抗菌作用。隨著QNs在食品動物中大量使用，殘留于食品中的藥物會直接危害消費(fèi)者健康，有報道［1］稱喹諾酮類藥物對人體會造成全身性損害、神經(jīng)和精神系統(tǒng)損害，對消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的不良反應(yīng)也相對較多。為了避免消費(fèi)者受到喹諾酮類藥物殘留的危害，各國都有制定其在組織中最高殘留限量，而美國則禁止喹諾酮類藥物應(yīng)用于動物源性食品。我國農(nóng)業(yè)部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》［2］規(guī)定了喹諾酮類藥物禁止使用于蛋雞產(chǎn)蛋期。本試驗在廣東溫氏食品集團(tuán)某種雞場開展，實地對兩種優(yōu)質(zhì)在產(chǎn)種雞(天露草雞和竹絲雞)進(jìn)行拌水給藥試驗，旨在通過建立的檢測方法的最低檢測限計算停藥期，以確定臨床蛋雞在產(chǎn)蛋前使用諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星后，不會有藥物殘留于雞蛋中，降低消費(fèi)者因食用含有喹諾酮類藥物殘留的雞蛋而對身體造成的傷害，本試驗結(jié)果可指導(dǎo)喹諾酮類藥物在臨床合理用藥以及為休藥期的制定提供參考，具有很強(qiáng)的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 對照品:諾氟沙星，純度99.5%;氧氟沙星，純度 99.0%;恩諾沙星，純度 99.0%，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;諾氟欣(5%煙酸諾氟沙星)、氧氟沙星可溶性粉(含量2%)、恩諾沙星可溶性粉(含量5%)，均由廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司生產(chǎn);甲醇、乙腈為色譜純，正己烷、磷酸、三乙胺、無水硫酸鈉等均為分析純。

1.1.2 實驗動物 三座天齡分別為166、272、299 d的天露草雞，兩座天齡分別為270、288 d的竹絲雞，由廣東溫氏食品集團(tuán)某種雞場提供。

1.1.3 儀器與設(shè)備 Agilent－1100系列高效液相色譜儀及化學(xué)工作站，包括自動進(jìn)樣器、熒光檢測器、恒溫柱溫箱、真空在線脫氣裝置;Milli Q去離子水發(fā)生器:美國Millipore公司;均質(zhì)器:天津四方公司;離心機(jī)、振蕩器:金壇杰瑞爾公司;氮吹儀、隔膜真空泵:津騰公司;分析天平感量:0.01 g;不同量程的移液槍;50、15 mL離心管。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗與采樣 已經(jīng)開產(chǎn)的健康的三座天露草雞和兩座竹絲雞，自由采食和飲水，飼喂不含藥物的全價日糧飼料，于用藥前一天每座隨機(jī)收集7枚空白雞蛋樣品。動物給藥:3座天露草雞分別通過飲水投給諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星藥物，30包(200 g/包)5%煙酸諾氟沙星可溶性粉、50包(100 g/包)2%氧氟沙星可溶性粉、50包(100 g/包)5%恩諾沙星可溶性粉，分別溶于1200 kg水中，連續(xù)給藥3 d;兩座竹絲雞分別通過飲水投給諾氟沙星、氧氟沙星藥物，給藥劑量與方法同天露草雞。采樣方法:在停藥后 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 d 時間點(diǎn)分別于每座隨機(jī)收集7枚雞蛋樣品，并隨機(jī)選取5枚打碎于勻漿杯中，均質(zhì)后分裝于密封袋中，4℃冰箱保存。

1.2.2 試液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲備液:精密稱取諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星各10.01 mg于100 mL棕色容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容至刻度。復(fù)溶液:甲醇－乙腈－水(1+1+2，V/V/V)。

1.2.3 雞蛋樣品的前處理方法 準(zhǔn)確稱取5.00 g已勻漿好的雞蛋樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋30 sec，加入5 g左右的無水硫酸鈉，渦旋 30 sec，振蕩 20 min，4000 r/min離心5 min，吸取5 mL乙腈層于15 mL離心管中，40℃空氣吹干濃縮。加入1 mL復(fù)溶液復(fù)溶，加入2 mL乙腈飽和正己烷除脂，渦旋30 sec，3000 r/min離心5 min;去掉正己烷層，重復(fù)此除脂操作一次，下清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。

1.2.4 色譜分析條件 色譜柱:Venusil ASB C18分析柱(5 μm，250 mm × 4.6 mm);流動相:0.05 mol/L磷酸溶液/三乙胺(pH 2.4)－乙腈(80+20，V/V);流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量 20 μL;熒光檢測器檢測:激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450 nm。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星三種標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用流動相稀釋成濃度依次為 10、20、50、100、200、500、1000 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 檢測限和定量限 稱取已均質(zhì)好的空白雞蛋樣品，添加一定量諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星標(biāo)液，使得樣品中的藥物濃度為5、10、15 μg/kg，每個濃度做5個重復(fù)，分別按上述方法進(jìn)行處理和HPLC檢測，以最低檢出濃度計算，信噪比(S/N)≥3對應(yīng)的濃度為檢測限，信噪比(S/N)≥10對應(yīng)的濃度為定量限。

1.2.7 準(zhǔn)確度與精密度 采用在空白雞蛋樣品加標(biāo)的方法進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度的測定。在空白雞蛋中添加低、中、高三個濃度的諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星樣品(15、50、100 μg/kg)，每個濃度樣品做 5個平行，3個批次，同日測定，不同批次間隔一天或者數(shù)天，分別計算回收率、批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

1.2.8 采集雞蛋樣品的測定 檢測方法同1.2.3項。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜圖 在本實驗所選條件下，NOR保留時間為5.5 min左右、OFL保留時間6.0 min左右、ENR保留時間為7.4 min左右，如圖1～圖3所示?？瞻讟悠吩诒Ａ魰r間均無色譜峰出現(xiàn)，樣品雜質(zhì)峰與藥物峰分離效果好。

圖1 三種藥物標(biāo)液色譜圖

圖2 空白雞蛋樣品色譜圖

圖3 雞服用喹諾酮類藥物后雞蛋樣品色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與檢測限 在選定的色譜條件下，各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液分別用HPLC測定，以藥物濃度(C)與相應(yīng)色譜面積(A)作線性回歸，在藥物濃度為10～1000 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，滿足殘留檢測的要求。具體結(jié)果見表1?？瞻纂u蛋樣品標(biāo)準(zhǔn)添加的檢測限為 5 μg/kg，定量限為 15 μg/kg，均滿足殘留檢測的要求。

表1 喹諾酮類藥物的線性回歸及相關(guān)系數(shù)

2.3 回收率和變異系數(shù) 按照1.2.4項所述方法處理添加15、50、100 μg/kg三個濃度的混合標(biāo)液，回收率均在75%以上，批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)均小于10%。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 喹諾酮類藥物的回收率及變異系數(shù)

2.4 藥物的提取 雞蛋中含有大量的水分、蛋白質(zhì)和卵磷脂，因此樣品的提取和凈化的主要目的是沉淀蛋白質(zhì)、去脂肪和提取目標(biāo)物。沉淀蛋白常用的方法有使用乙醇、甲醇和乙腈等有機(jī)溶劑，或者用乙酸、甲酸、磷酸和三氯乙酸等酸性溶液［3］。在方法研究過程中，對樣品的提取液進(jìn)行了實驗摸索，所選的試劑最好既要沉淀蛋白又能提取目標(biāo)物質(zhì)，參考相關(guān)［4－7］文獻(xiàn)報道，根據(jù)實驗室條件，發(fā)現(xiàn)雞蛋樣品在乙腈提取和沉淀蛋白后，再經(jīng)過正己烷除脂過程，樣品的上清液很清亮且回收率及色譜分離效果均可達(dá)到要求。該方法提取過程簡單、便捷、成本低，適用于雞蛋樣品中喹諾酮類藥物的殘留檢測。

2.5 雞蛋中藥物的殘留與消除 從表3可以分析出，天露草雞和竹絲雞分別連續(xù)拌水諾氟沙星和氧氟沙星3 d后，在停藥的第8天收集的雞蛋中藥物已基本檢測不出;天露草雞在連續(xù)拌水恩諾沙星3 d后，雞蛋內(nèi)富集的濃度逐漸增大，從停藥后的第3天開始降低，第8天已基本檢測不到恩諾沙星，但痕量水平的恩諾沙星代謝較慢，在第12天已基本測不出。

3 結(jié)論

本研究建立了一種諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星在雞蛋中殘留的高效液相色譜熒光檢測法，在10～1000 μg/L添加濃度范圍內(nèi)平均添加回收率在75%以上，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10%，檢測限為5 μg/kg，該方法整個提取過程便捷、快速、成本低，適用于大量雞蛋樣品中喹諾酮類藥物的殘留檢測。

表3 兩品種種雞雞蛋中喹諾酮類藥物的殘留量 μg·kg－1

從試驗的結(jié)果可以看出，通過檢測雞蛋中藥物的殘留量監(jiān)控諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星在蛋雞產(chǎn)蛋前使用后體內(nèi)的代謝情況，從而確保雞蛋中無此類藥物殘留，保障消費(fèi)者的食品安全。在產(chǎn)的3座天露草雞分別連續(xù)飲服溶于1200 kg水的30包(200 g/包)5%煙酸諾氟沙星可溶性粉、50包(100 g/包)2%氧氟沙星可溶性粉、50包(100 g/包)5%恩諾沙星可溶性粉3 d，兩座竹絲雞分別通過飲服同劑量的諾氟沙星、氧氟沙星后，建議天露草雞和竹絲雞在產(chǎn)蛋前10 d左右停用諾氟沙星和氧氟沙星，天露草雞在產(chǎn)蛋前14 d左右停用恩諾沙星。

［1］ 魏 東，李振華，張乃生.喹諾酮類藥物的不良反應(yīng)［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27(7):105 －107.

［2］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告(第235號).動物性食品中獸藥最高殘留限量［S］.

［3］ 廖 蘭，饒 勇，楊桂香，等.檢測雞蛋中12種喹諾酮類藥物殘留的HPLC方法［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41(8):2419－2424.

［4］ 李 丹，張玉潔，仲 鋒，等.雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量檢測方法研究［J］.中國獸藥雜志，2010，44(6):1 －4.

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［6］ 劉俊華，鹿翠珍，石麗敏，等.肉雞組織中四種氟喹諾酮類藥物休藥期的探討［J］.中國獸藥雜志，2010，44(5):14 －17.

［7］ 潘 媛，牛 華，程曉云，等.動物源性食品中六種氟喹諾酮類殘留檢測前處理的優(yōu)化［J］.中國獸藥雜志，2011，45(4):28－32.