30味中藥提取物與環(huán)丙沙星聯(lián)用對(duì)豬源鏈球菌體外抑菌作用研究

宋曉言，趙 晴，田立杰，劉樹明，馬紅霞*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130118)

豬源鏈球菌是一種重要的人畜共患病病原，主要致病型以II型，屬于D血清群?？梢l(fā)人和動(dòng)物的多種化膿性疾病、肺炎、乳腺炎、敗血癥等，給人畜健康均帶來極大危害［1］。近年來，隨著抗生素不合理應(yīng)用，豬源鏈球菌出現(xiàn)不同程度的耐藥性，不但給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也給我國(guó)公共衛(wèi)生事業(yè)帶來極大威脅［2］。因此，研發(fā)一種天然、綠色、無毒、低副作用的抗菌藥物增效劑迫在眉睫。

中藥作為我國(guó)的優(yōu)勢(shì)國(guó)藥，被喻為“天然抗生素”，其資源豐富，品種較多、成分復(fù)雜毒副作用小、易于代謝。近年來，從中藥中研發(fā)新藥倍受重視，其中，中藥與抗菌藥物聯(lián)用防治畜禽疾病為重要組成部分，其發(fā)揮的作用已引起廣泛關(guān)注［3－4］。清熱解毒、祛風(fēng)除濕類等中藥的抑菌作用較強(qiáng)，試驗(yàn)選取具有此類功效的30味中藥提取物分別與環(huán)丙沙星進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，旨在檢測(cè)環(huán)丙沙星與其合用對(duì)豬源鏈球菌的聯(lián)合體外抑菌效果，初步追蹤有協(xié)同抑菌作用中藥萃取物的抑菌效果，為獸醫(yī)臨床合理用藥及進(jìn)一步分析中藥活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 鏈球菌藥敏質(zhì)控株CVCC3077，購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所微生物菌種保藏管理中心。

豬源多重耐藥鏈球菌(pf－cc)，于2011年采自吉林省某豬場(chǎng)病死豬的病變肺臟，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理試驗(yàn)室保存，文獻(xiàn)報(bào)道pf－cc對(duì)環(huán)丙沙星、青霉素、紅霉素、克林霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考的最低抑菌濃度值(MIC值)分別為256、1、﹥512、﹥512、64 和128 μg/mL，而 CVCC3307 對(duì)環(huán)丙沙星、青霉素、紅霉素、克林霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考的MIC值分別為 1、≤0.03、0.03、0.06、0.25 和 2 μg/mL［5］。

1.2 藥物 佩蘭、黃連、郁金、枳殼、蒼術(shù)、射干、辛夷、艾葉、麥冬、菊花、木通、厚樸、地龍、赤芍、白芍、白芷、虎杖、青蒿、防風(fēng)、苦參、山豆根、土茯苓、金錢草、刺五加、魚腥草、紫花地丁、馬齒莧、天花粉、女貞子，決明子共30味中藥均購于吉林省長(zhǎng)春市福百草大藥房。

乳酸環(huán)丙沙星(CIP)原粉由北京海洋醫(yī)化生物科技有限公司惠贈(zèng)。

1.3 培養(yǎng)基的配制 鏈球菌血瓊脂培養(yǎng)基按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行配制［6］。

1.4 菌種復(fù)蘇純化鑒定及菌落計(jì)數(shù) 無菌環(huán)境下，用接種環(huán)蘸取已鑒定保存菌液于血瓊脂平板上劃線，37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18～24 h［7］，挑取形態(tài)、大小均勻的單個(gè)典型菌落于鏈球菌液體培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)18～24 h，經(jīng)鑒定為鏈球菌，并按照常規(guī)方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)［8］。

1.5 藥物制備

1.5.1 中藥水提物的制備 精確稱取所選30味中藥各50 g，加蒸餾水2000 mL，加熱至沸騰后，文火煎煮三次，每次0.5 h。分別合并三次濾液，濃縮至1/2體積后，離心、過濾、濃縮為1 g/mL，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 中藥醇提物的制備 精確稱取所選30味中藥各50 g，將其粉碎至粉末狀，用75%乙醇按料液比為1∶8比例浸泡12 h，25 ℃超聲提取三次，0.5 h/次。分別合并醇提液，揮去乙醇、濃縮為1 g/mL，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 有機(jī)溶劑萃取物的制備 稱取佩蘭醇提物10 g加入適量蒸餾水進(jìn)行混懸，按照石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇的極性自低到高依次進(jìn)行萃取，各萃取三次，分別合并各項(xiàng)萃取液，濃縮為1 g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 CIP原液的配制 取乳酸環(huán)丙沙星原粉0.2304 g，加蒸餾水10 mL溶解，經(jīng)微孔濾器過濾除雜菌，分裝至EP管中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 30味中藥水、醇提取物對(duì)pf－cc最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 將單味中藥水提物與醇提物分別用合適的溶劑溶解后，參照文獻(xiàn)［9］中的方法，用鏈球菌液體培養(yǎng)基按照試管二倍稀釋法進(jìn)行倍比稀釋，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，將幼齡菌液稀釋至適當(dāng)濃度(即菌液濃度為1×104～1×105CFU/mL范圍內(nèi))，分別加入適量稀釋菌液于倍比稀釋的藥液中，37℃震蕩培養(yǎng)18～24 h后，于血瓊脂板上劃線培養(yǎng)，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，重復(fù)3次，確定各中藥的MIC。

1.7 中藥與抗生素聯(lián)合應(yīng)用的部分抑菌濃度(FIC)測(cè)定 選用篩選得到的對(duì)pf－cc有抑菌作用的中藥與環(huán)丙沙星聯(lián)用，采用棋盤法，按照各中藥2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC 濃度的順序，在棋盤管中沿Y軸方向(自上向下)添加200 μL中藥液于EP管中。按照環(huán)丙沙星的1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC濃度順序，沿 X軸方向(自左向右)添加200 μL環(huán)丙沙星于EP管中，保證試管中實(shí)際濃度為計(jì)劃濃度［10］。根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液稀釋至適當(dāng)濃度(即菌液濃度在1×104～1×105CFU/mL范圍內(nèi))，分別加適量于EP管中。37℃震蕩培養(yǎng)18～24 h，蘸取培養(yǎng)液接種于MHA瓊脂板上，37℃靜置培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果，重復(fù)三次，計(jì)算中藥與抗生素聯(lián)合應(yīng)用的FIC值，并判定是否有協(xié)同作用或相加作用。

判定標(biāo)準(zhǔn):以部分抑菌濃度FIC指數(shù)作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判定依據(jù)。

(FIC指數(shù):≤0.5協(xié)同作用，0.5～1相加作用，1～2無關(guān)作用，＞2拮抗作用)。

1.8 佩蘭醇提物的四種溶劑萃取物對(duì)MIC的測(cè)定依照1.6的方法分別檢測(cè)佩蘭醇提物的石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物對(duì)豬源鏈球菌的MIC。

1.9 佩蘭四種溶劑萃取物與環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用FIC的測(cè)定 依照1.7的方法測(cè)定佩蘭四種溶劑萃取物分別與環(huán)丙沙星聯(lián)用對(duì)pf－cc株的FIC，并判定中藥提取物與環(huán)丙沙星合用是否具有協(xié)同或相加作用。

2 結(jié)果

2.1 中藥提取物對(duì)豬源鏈球菌pf－cc的MIC測(cè)定 中藥水、醇提取物對(duì)pf－cc的MIC值測(cè)定結(jié)果見表1。佩蘭、黃連、土茯苓、枳殼、郁金5味中藥醇提物、水提物抑菌作用相對(duì)較強(qiáng)，其中佩蘭醇提物的抑菌效果相對(duì)最強(qiáng)，其他25味中藥的醇提物、水提物的MIC值均大于或等于500 mg/mL，抑菌作用相對(duì)較弱。

2.2 中藥與環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用對(duì)豬源鏈球菌(pfcc)的FIC測(cè)定 30味中藥水提物、醇提物與環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用抑菌結(jié)果見表2。佩蘭醇提物、黃連醇提物與環(huán)丙沙星對(duì)pf－cc分別呈現(xiàn)協(xié)同抑菌作用、相加抑菌作用，其余28味中藥提取物與環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用對(duì)pf－cc的FIC值均大于1，呈無關(guān)作用。

表1 中藥對(duì)pf-cc的MIC測(cè)定 (mg·mL－1)

表2 中藥提取物與環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用對(duì)pf-cc的FIC值測(cè)定

2.3 佩蘭四種溶劑萃取物對(duì)pf－cc的MIC測(cè)定佩蘭四種溶劑萃取物對(duì)pf－cc的MIC測(cè)定結(jié)果見表3，佩蘭醇提物的氯仿、乙酸乙酯萃取物的體外抑菌作用相對(duì)較強(qiáng)，其中佩蘭乙酸乙酯萃取物抑菌作用最強(qiáng)，佩蘭醇提物的石油醚、正丁醇萃取物的體外抑菌作用相對(duì)較弱。

表3 佩蘭四種溶劑萃取物對(duì)pf-cc的MIC測(cè)定(mg·mL－1)

2.4 佩蘭四種溶劑萃取物與環(huán)丙沙星聯(lián)用對(duì)pfcc的FIC測(cè)定 佩蘭四種溶劑萃取物與環(huán)丙沙星聯(lián)用對(duì)pf－cc的FIC值見表4。

表4 佩蘭四種溶劑萃取物與環(huán)丙沙星聯(lián)用對(duì)pf-cc的FIC值測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)果表明，佩蘭醇提物的氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物分別與環(huán)丙沙星合用對(duì)pf－cc呈現(xiàn)相加作用，協(xié)同作用。

3 討論

試驗(yàn)選取的30味清熱解毒、理氣、祛風(fēng)除濕類的中藥提取物對(duì)臨床分離豬源鏈球菌的MIC值不一致，推測(cè)源于各中藥的抑菌活性成分存在差異。30味中藥醇提物體外抑菌作用均相對(duì)較強(qiáng)于其水提物體外抑菌作用，表明同一藥材的不同提取方法能夠使其呈現(xiàn)不同程度的抑菌活性，另外，水煎法的高溫提取適合熱穩(wěn)定的藥材，此過程將破壞部分熱穩(wěn)定性較差藥材的有效抑菌成分，且水提物中只包含了水溶性成分，而醇提法能夠有效克服水煎法的高溫破壞作用［11］，從而增強(qiáng)醇提物的體外抑菌作用。

試驗(yàn)測(cè)定的黃連、馬齒莧等部分中藥醇提物對(duì)豬源鏈球菌體外抑菌作用結(jié)果與張紅英［12］、趙恒章［13］等測(cè)定部分中藥醇提物對(duì)豬源鏈球菌體外抑菌作用結(jié)果基本一致;菊花、山豆根等部分中藥水提物、醇提物對(duì)豬源鏈球菌的體外抑菌作用結(jié)果與劉洋［14］等測(cè)定的部分中藥對(duì)豬源鏈球菌的體外抑菌結(jié)果差異較大，由于中藥成分復(fù)雜，部分中藥的產(chǎn)地、采收時(shí)間、加工炮制以及儲(chǔ)存方法等因素的不同均能導(dǎo)致成分差異［15］。試驗(yàn)測(cè)得魚腥草等部分中藥體外抑菌作用不顯著，但應(yīng)用于獸醫(yī)臨床抗感染效果良好［16］，因此上述中藥的體內(nèi)抗感染作用效果還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

試驗(yàn)測(cè)得佩蘭醇提物及其醇提物的乙酸乙酯萃取物對(duì)pf－cc的MIC值最低，均為62.5 mg/mL，即二者對(duì)pf－cc的體外抑菌作用相對(duì)最強(qiáng)。佩蘭醇提物與其醇提物的乙酸乙酯萃取物對(duì)pf－cc的體外協(xié)同抑菌作用略有差異，推斷由于佩蘭醇提物的乙酸乙酯萃取物成分相對(duì)于其醇提物較單一，導(dǎo)致與環(huán)丙沙星聯(lián)合抑菌作用產(chǎn)生一定程度的影響。佩蘭醇提物與其他喹諾酮類藥物及其他類抗菌藥物聯(lián)用對(duì)pf－cc是否能夠呈現(xiàn)協(xié)同抑菌作用還有待研究，與環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)有無較強(qiáng)協(xié)同抑菌作用亦有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，試驗(yàn)初步篩選得到與環(huán)丙沙星合用對(duì)豬源鏈球菌有較強(qiáng)體外協(xié)同抑菌作用的佩蘭醇提物及佩蘭醇提物的乙酸乙酯萃取物，為進(jìn)一步研發(fā)新型抗菌藥物制劑奠定了基礎(chǔ)。

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