透明質(zhì)酸的生物合成及其代謝工程的研究進(jìn)展

馬艷琴 邱益彬 李莎 徐虹

（1. 南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，南京 211816；2. 南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，南京 210037）

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是一種由β-1，3-N-乙?；?D-葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）和β-1，4-D-葡萄糖醛酸（UDP-GlcUA）的雙糖單位聚合而成的線性大分子酸性黏多糖［1］（圖1）。HA分子內(nèi)不含硫酸基團(tuán)，也不與蛋白形成共價(jià)化合物，在溶液里HA以游離的自由鏈或無規(guī)則卷曲的形式存在。HA作為細(xì)胞間質(zhì)的重要組成成分，在維持著皮膚的功能、形態(tài)、結(jié)構(gòu)當(dāng)中起著不可或缺的作用，在亞洲HA產(chǎn)品主要在化妝品中添加，用于保濕、防皺以及延緩肌膚衰老。同時(shí)HA無色無味、易溶于水、不改變產(chǎn)品本來的性質(zhì)，被批準(zhǔn)為新的食品原料，可作為食品原料添加到各類應(yīng)用中，前景十分廣闊。目前HA主要是通過微生物發(fā)酵獲得，但隨著對(duì)HA發(fā)酵研究的深入，同樣也面臨了一些新的挑戰(zhàn)。首先，當(dāng)采用以獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）為主的野生型鏈球菌進(jìn)行HA發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，鏈球菌屬自身存在一定的安全問題且所要求的發(fā)酵條件十分苛刻［2-3］。在HA生物合成過程中，第二個(gè)比較突出的問題就是糖前體底物和HA產(chǎn)物之間不平衡的問題。HA合成的兩個(gè)前體UDP-GlcUA和UDPGlcNAc同時(shí)也是用于菌體細(xì)胞壁生物合成的前體，因此菌體自身的細(xì)胞生長(zhǎng)和HA合成存在底物的競(jìng)爭(zhēng)［4］。此外，除了用于細(xì)胞的生長(zhǎng)，HA合成過程中乳酸和乙酸等副產(chǎn)物的產(chǎn)生需要消耗約80%的碳源［5］，嚴(yán)重影響了HA底物的利用。第三，HA在宿主中合成過程伴隨著大量氧化還原過程，該發(fā)酵是嚴(yán)格需氧的過程，但隨著HA在發(fā)酵液中不斷積累，其高分子粘性會(huì)使發(fā)酵液溶氧降低，這對(duì)HA合成過程十分不利。第四，HA合成酶（HAS）是膜結(jié)合蛋白，自身需要通過多達(dá)7種不同的功能來啟動(dòng)、延長(zhǎng)和分泌HA［6］，因此膜結(jié)構(gòu)和HAS氨基酸序列是影響HA合成的重要因素。本文從分子生物學(xué)角度對(duì)近年來HA生物合成中遇到的問題和采取的有效策略進(jìn)行梳理和總結(jié)，為未來HA的高效合成研究提供參考。

圖1 N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸組成的重復(fù)HA雙糖單元分子結(jié)構(gòu)Fig. 1 Molecular structure of repeating HA disaccharide unit composed of N-acetylglucosamine and glucuronic acid

1 HA合成途徑及關(guān)鍵合成酶

HA在細(xì)胞內(nèi)合成過程中需要有多種酶的參與（圖2），無論真核生物還是原核生物，HA的合成都是以單糖為起始，通過三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑形成D-葡萄糖醛酸（UDP-GlcUA）和N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）兩個(gè)單糖底物，再通過關(guān)鍵酶HAS使兩個(gè)底物連接成HA的結(jié)構(gòu)單元，將逐漸變長(zhǎng)的糖鏈釋放到胞。在眾多酶中，hasB基因負(fù)責(zé)編碼UDP-葡萄糖脫氫酶，hasC基因負(fù)責(zé)編碼UDP-葡糖焦磷酸化酶，另一邊glmU編碼UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，glmM編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶。與天然合成HA菌株相比，目前所涉及的諸如枯草芽孢桿菌等基因工程菌中，主要缺乏使HA前體UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc的聚合關(guān)鍵基因hasA。

圖2 HA在微生物中合成的代謝通路Fig. 2 Metabolic pathways of HA synthesis in microorganisms

自從發(fā)現(xiàn)和克隆了第一個(gè)編碼化膿性鏈球菌透明質(zhì)酸合成酶（HAS）的基因（sphasA）后，類似的HA合成酶基因（或cDNA）已經(jīng)在哺乳動(dòng)物（人和老鼠）、青蛙、感染藻類的病毒中被發(fā)現(xiàn)［7-11］。這些不同的HASs酶組成了一個(gè)具有氨基酸序列同一性或相似性的區(qū)域的蛋白質(zhì)大家族。根據(jù)氨基酸序列同源性和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，已知的HAS蛋白被分為I類和II類，來自多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）的PmHAS［12］是唯一的II類成員，I類酶來源則包括鏈球菌S. pyogenes（SpHAS）、S. equisimilis（SeHAS）［13］、S. zooepidemicus（SzHAS）［14］、S. parauberis（SpaHAS）［15］和S. uberis（SuHAS）［16］以 及 病 毒PBCV-1（CvHAS）［11］和 脊 椎 動(dòng) 物［17-18］來 源 的HAS1-3酶［6］。目前研究最多的幾種HAS氨基酸序列對(duì)比如圖3。動(dòng)物和細(xì)菌來源的has基因同源性為56%，其中幾種鏈球菌屬的has基因同源性為62%，而動(dòng)物之間的has基因同源性高達(dá)93%。不同來源HAS蛋白的氨基酸序列有保守區(qū)域，這些保守序列為HA合成的關(guān)鍵區(qū)域。在大多數(shù)無HA合成的微生物中，只需要引入單基因has即可實(shí)現(xiàn)HA的異源合成，例如在畢赤酵母中利用非洲爪蟾的透明質(zhì)酸合成酶（xlHasA）成功合成了高分子量HA［19］，Gomes等［20］首次在乳酸克魯維酵母中將多殺性巴氏桿菌的hasA基因與非洲爪蟾的hasB基因相結(jié)合進(jìn)行HA合成表達(dá)。

圖3 不同來源的透明質(zhì)酸合成酶的多序列比對(duì)圖Fig. 3 Multiple sequence alignment of hyaluronidases from different sources

HASs是一種膜結(jié)合蛋白（圖4），Wang等［21］發(fā)現(xiàn)seHasA和spHasA具有不同HA合成能力，為了進(jìn)一步探索原因，用spHasA的相應(yīng)跨膜螺旋Thr7-Met25取代了seHasA上對(duì)應(yīng)的第一個(gè)跨膜螺旋Leu7-Val25，從而產(chǎn)生seHasAThr7-Met25。突變體seHasAThr7-Met25在谷氨酰胺中的表達(dá)水平與野生型seHasA相同，然而其產(chǎn)生的HA量卻要高得多，這表明I型HA合成酶的第一個(gè)跨膜螺旋在調(diào)節(jié)HA合成中起關(guān)鍵作用。

圖4 微生物中HA合成酶跨膜蛋白流動(dòng)鑲嵌模型Fig. 4 Flow mosaic model of HA synthase transmembrane protein in microorganisms

2 透明質(zhì)酸的生物合成及生物學(xué)改造

2.1 基于GRAS菌株的HA合成

目前，HA的商業(yè)化生產(chǎn)主要依賴于A組鏈球菌的發(fā)酵，這些天然鏈球菌屬生產(chǎn)HA的研究大部分著眼于物化環(huán)境對(duì)其生產(chǎn)的影響［5，22-23］，且其潛在的致病高風(fēng)險(xiǎn)和產(chǎn)品中外毒素的污染限制其更廣泛的應(yīng)用。盡管通過敲除HA天然生產(chǎn)菌毒力基因的方法能降低菌株毒力，但并不能完全消除，且相關(guān)基因過多操作復(fù)雜難以實(shí)現(xiàn)。基因工程和代謝工程等實(shí)現(xiàn)了從非致病的、安全的微生物中獲得HA，目前HA已經(jīng)被廣泛的異源宿主產(chǎn)生。人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多公認(rèn)的安全（GRAS）菌株如枯草芽孢桿菌［24-27］、乳酸乳球菌［28-29］、谷氨酸棒桿菌［30-32］和畢赤酵母［19］等為HA的替代性生產(chǎn)菌。這些菌株共同的特點(diǎn)是相對(duì)安全且遺傳背景清晰、具有成熟的DNA操作技術(shù)、對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)條件要求不高、具有表達(dá)高活性蛋白酶和高分子聚合的能力等。在研究最多的重組枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中的HA產(chǎn)量和分子量分別達(dá)到6.8 g/L、4.55×106Da［24］和34.2 g/L、3.31×105Da［21］。各種工程菌合成HA產(chǎn)量及分子量比較見表1。

表1 不同工程菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸的產(chǎn)量Table 1 Yield and molecular weight of hyaluronic acid produced by different hosts

2.2 強(qiáng)化HA合成前體途徑

HA的合成通過兩條不同的合成路徑，兩個(gè)前體UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc在HAS酶的催化下交替聚合成鏈（圖3）。在大多數(shù)細(xì)菌中，UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc同時(shí)也是用于細(xì)胞壁生物合成的前體，由此前體濃度與HA產(chǎn)量正相關(guān)，通過前體途徑優(yōu)化可以提高HA產(chǎn)量。Streptococcus thermophilus中同時(shí)過表達(dá)hasA和hasB菌株HA產(chǎn)量是野生型菌株的6倍［4］。Widner等［25］將馬鏈球菌的hasA透明質(zhì)酸合酶編碼基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)，產(chǎn)生1.1-1.2 MD范圍的HA，并且同時(shí)過表達(dá)hasA基因與內(nèi)源性tuaD基因可高水平生產(chǎn)HA。隨后Chien等［45］也證實(shí)盡管在枯草芽孢桿菌基因組中僅表達(dá)hasA可以實(shí)現(xiàn)HA的異源生產(chǎn)，但hasB或tauD與hasA的共表達(dá)可將HA的產(chǎn)量提高至少2倍。Jia等［24］通過兩步誘導(dǎo)法在枯草芽孢桿菌中引入巴氏桿菌HAS（pmHAS）基因和前體tuaD-gtaB操縱子，最終獲得了產(chǎn)量6.8 g/L、分子量達(dá)到4.5 MD的HA。然而在谷氨酸棒狀桿菌中，關(guān)于UDP-GlcUA前體途徑的強(qiáng)化結(jié)果卻不同，Cheng等比較發(fā)現(xiàn)操縱子hasA-hasB更適合在重組C. glutamicum中合成HA［30］，同樣的結(jié)論也在乳酸乳桿菌中得到了證實(shí)［28-29］。

為了探索另一前體UDP-GlcNAc對(duì)HA合成的影響，Jin等［26］在B. substills中也做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)在單獨(dú)強(qiáng)化UDP-GlcNAc途徑中，同時(shí)過表達(dá)3個(gè)相關(guān)基因glmU、glmM和glmS對(duì)HA產(chǎn)量的提升最大。并且在過表達(dá)tuaD-gtaB的同時(shí)，強(qiáng)化glmU、glmM和glmS的表達(dá)能使HA產(chǎn)量達(dá)到最大值，同時(shí)也證實(shí)中間體UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc的濃度和比例是控制HA分子量的關(guān)鍵因素［50］。綜上所述，上調(diào)UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc都能使HA在工程菌中的積累增加，值得注意的是UDP-GlcNAc途徑中相關(guān)基因表達(dá)的比例對(duì)HA分子量有很大影響，這些結(jié)果對(duì)工程菌高產(chǎn)HA都有十分重要的意義。

2.3 基于HA合成中碳通量分布的代謝改造

微生物生產(chǎn)HA會(huì)與生物生長(zhǎng)、糖酵解和磷酸戊糖途徑一起競(jìng)爭(zhēng)碳源。果糖-6-磷酸是糖酵解途徑和HA合成的關(guān)鍵中間體，果糖-6-磷酸激酶由pfkA編碼，是糖酵解途徑中的第一個(gè)限速酶［51］，在正常條件下，果糖-6-磷酸主要流向到EMP途徑。Zhang等［35］在鏈霉菌中通過高效表達(dá)蔗糖-6-磷酸激酶基因scrB并敲除磷酸轉(zhuǎn)移酶基因fruA和磷酸果糖激酶基因fruK后，HA產(chǎn)量分別增加了22%和27%。Jin等［26］利用Cre/lox系統(tǒng)［52］將pfkA（編碼6-磷酸果糖激酶）的起始密碼子ATG替換為TTG或GTG［27］，以適度下調(diào)pfkA的表達(dá)，從而為HA的合成提供更多的果糖-6-磷酸，重組B. substills168中HA的產(chǎn)量分別增加了13%和18%。乳酸是丙酮酸前體在乳酸脫氫酶（LDH）催化下的副產(chǎn)物，浪費(fèi)了合成HA等目標(biāo)產(chǎn)物所需的能量和前體。為了滿足HA合成所需的能量需求，在乳酸乳桿菌中，移除乳酸脫氫酶重新分配了碳流和氧化還原平衡，HA的產(chǎn)量提高了3倍［53］。Cheng等［32］也在谷氨酸棒狀桿菌中通過單交叉同源重組敲除乳酸脫氫酶（LDH）基因，阻斷了產(chǎn)生乳酸的代謝途徑，獲得了HA產(chǎn)量顯著提升的工程菌。

另一方面，合適的啟動(dòng)子選擇對(duì)于高效合成HA也是非常重要的。在重組谷氨酸棒狀桿菌中，強(qiáng)或中等強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子對(duì)HA的產(chǎn)生效果不佳。這在一定程度上與HA合成的底物也是產(chǎn)生磷壁酸和肽聚糖必不可少組分的理論吻合。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Ptac以IPTG為誘導(dǎo)劑，通過控制HAS表達(dá)的時(shí)間能有效地驅(qū)動(dòng)hasA-hasB操縱子在谷氨酸棒狀桿菌中的過表達(dá)［30］。如果過早添加IPTG（例如在培養(yǎng)0 h時(shí)），則Ptac效果不佳。因此通過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄時(shí)機(jī)調(diào)控，也是緩解菌體生長(zhǎng)與HA合成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的又一有效手段，

2.4 HA合成中氧化還原反應(yīng)的生物學(xué)改造

為了補(bǔ)充HA生物合成所消耗的能量，Chien等［45］將透明顫藻血紅蛋白（VHb）與合成HA的基因共表達(dá)。隨著vhb的表達(dá)，不僅細(xì)胞濃度提高了25%，HA產(chǎn)量也進(jìn)一步提高了100%，這可能是由于vhb的表達(dá)增加了ATP的利用率。培養(yǎng)30 h后，攜帶vhb，hasA和tuaD表達(dá)盒基因的重組枯草芽孢桿菌獲得了約1.8 g/L的HA。共表達(dá)血紅蛋白基因vgb的谷氨酸棒狀桿菌與不表達(dá)vgb的培養(yǎng)物相比，HA生產(chǎn)菌具有了更高的CDM，雖然vgb的共表達(dá)使枯草芽孢桿菌的HA產(chǎn)量增加了一倍，但降低了谷氨酸桿菌的HA產(chǎn)量［31］。這可能是因?yàn)楣劝彼釛U菌的中樞代謝調(diào)控、碳分解代謝抑制模式和基因表達(dá)調(diào)控與枯草芽孢桿菌不同［54］，氧氣供應(yīng)的改善將代謝流重新定向到細(xì)胞生長(zhǎng)和能量生成上，并降低了谷氨酸桿菌中HA的產(chǎn)量。當(dāng)谷氨酸桿菌細(xì)胞缺氧時(shí)，它們停止生長(zhǎng)，但保持代謝活性，并保持其從葡萄糖中產(chǎn)生大量產(chǎn)物的能力。

另一方面細(xì)胞內(nèi)的氧化環(huán)境影響了HA的合成［55］，這種氧化環(huán)境一方面通過NAD+/NADH的比值體現(xiàn)，HA的產(chǎn)量與之成正比。而NAD+/NADH的動(dòng)態(tài)平衡通過氧化還原感受器和Rex等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)［56］。Prasad等［57］發(fā)現(xiàn)在獸疫鏈霉菌中hasB的轉(zhuǎn)錄水平比其他HAS基因低好幾倍，在乳酸鏈球菌中即使過表達(dá)hasB基因，NAD+/NADH比值較較低時(shí)，在熱力學(xué)上也不利于HA的產(chǎn)生［51］。通過Rex結(jié)合位點(diǎn)的篩選和基因表達(dá)與NAD+/NADH比值的相關(guān)性，他們也間接證明了Rex對(duì)幾個(gè)關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的可能性。HA作為多糖高分子，在發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)粘度嚴(yán)重影響了菌體的氧攝入，為了克服物理溶氧（dissolved oxygen，DO）帶來的瓶頸，Jin等［26］將來源于水蛭的透明質(zhì)酸酶LHAase導(dǎo)入B. subtilis168中。并通過人工設(shè)計(jì)的RBS調(diào)控元件精確控制LHAase的表達(dá)水平，生產(chǎn)低分子量的HA（LMW-HA）的同時(shí)，HA產(chǎn)量提升了37%。

2.5 強(qiáng)化HA合成及轉(zhuǎn)運(yùn)

目前用于原核工程菌的HAS都是來自鏈球菌屬的I類蛋白，其HAS蛋白需要通過多達(dá)7種不同的功能來啟動(dòng)和延長(zhǎng)HA鏈，并將其擠出跨膜結(jié)構(gòu)最后產(chǎn)生HA［6］。為了研究HAS酶的工作機(jī)制，Zhang等［58］通過改變獸疫鏈球菌HAS（SzHAS）胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的5個(gè)區(qū)域，并在枯草芽孢中表達(dá)獲得了更高的HA效價(jià)和分子量。由于分泌型HA能包裹谷氨酸棒狀桿菌，改變其細(xì)胞形態(tài)并抑制新陳代謝，Wang等［21］發(fā)現(xiàn)用水蛭透明質(zhì)酸酶破壞包膜可以恢復(fù)菌體新陳代謝，產(chǎn)生74.1 g/L的低分子透明質(zhì)酸。另一方面獸疫鏈球菌在生產(chǎn)高分子量透明質(zhì)酸（HA）方面具有巨大的潛力，但透明質(zhì)酸酶對(duì)HA的降解阻礙了該細(xì)菌在高分子量情況下提高HA產(chǎn)量。Yan等［52］利用同源重組技術(shù)敲除了野生菌中的透明質(zhì)酸酶，最終HA分子量從1.5 MD提高到3.8 MD。這些研究可以發(fā)現(xiàn)HAS合成酶與HA降解酶的綜合利用，可以提高HA合成與轉(zhuǎn)運(yùn)，亦可產(chǎn)生不同分子量維度的HA。

膜的有效表面積可以顯著影響膜蛋白的折疊和產(chǎn)量，而HAS是一種膜結(jié)合蛋白（圖2），細(xì)胞膜的表面積會(huì)影響單細(xì)胞的HA合成能力。Westbrook等［59］利用枯草芽孢桿菌CRISPR-Cas9工具［60］，通過CRISPR干擾（CRISPRi）降低了FtsZ（啟動(dòng)細(xì)胞分裂）的表達(dá)，從而改變了心磷脂（cardiolipin，CL）在膜中的分布，提高了搖瓶培養(yǎng)中的HA滴度和分子量。為了進(jìn)一步增強(qiáng)SeHAS的表達(dá)，隨后通過過表達(dá)磷脂酰甘油磷酸合酶基因pgsA和心磷脂合成酶基因clsA增加細(xì)胞膜CL含量，使HA滴度增加204%，最大分子量增加到2.2 MD。該膜工程研究還分別使ppsA和ugpP失活，將磷脂酰乙醇胺（PE）和中性糖脂（GL）從枯草芽孢桿菌的膜上去除，這一突變并不能顯著改變枯草芽孢桿菌HA的生產(chǎn)，因?yàn)镻E可以提高seHAS的活性而UgpP參與了脂磷壁酸的膜錨定。這一研究表明枯草芽孢桿菌膜上存在的其他主要脂質(zhì)（即PE和GL）對(duì)維持seHAS的活性起關(guān)鍵作用。綜上所述seHAS的功能表達(dá)是依賴于脂質(zhì)的。

這些與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞伸長(zhǎng)或細(xì)胞分裂的靶基因還與細(xì)胞形狀相關(guān)，因此細(xì)胞形態(tài)工程可以受細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長(zhǎng)過程的調(diào)控。除了細(xì)胞分裂相關(guān)的蛋白FtsZ，DivIVA是谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞伸長(zhǎng)過程中必不可少的蛋白，DivIVA和FtsZ表達(dá)的降低和增強(qiáng)均顯著改變了谷氨酸棒狀桿菌的細(xì)胞形態(tài)，使其由天然短桿狀轉(zhuǎn)變?yōu)樾E圓形（DivIVA降低）、球狀（DivIVA增強(qiáng)）、長(zhǎng)桿狀（FtsZ降低）和啞鈴狀（FtsZ增強(qiáng)）。而引入HA合成途徑后，只有FtsZ的過表達(dá)使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了驚人的變化，細(xì)胞膜面積增加了5.2倍，變成了粗長(zhǎng)的桿狀，同時(shí)HAS在膜上的表達(dá)增加了2.1倍，最終使單細(xì)胞的HA合成滴度提高了13.5倍［61］。但無論DivIVA和FtsZ的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，細(xì)胞形態(tài)的改變都會(huì)影響細(xì)胞分裂，從而減少細(xì)胞數(shù)量，相應(yīng)地降低HA總滴度。通過優(yōu)化兩階段誘導(dǎo)、引入動(dòng)態(tài)代謝調(diào)節(jié)等合成生物學(xué)新方法［62-65］，消除形態(tài)調(diào)控對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，有望進(jìn)一步提高工程細(xì)胞的HA總產(chǎn)率。

3 總結(jié)與展望

目前許多諸如B. subtilis、C. glutamicum等非HA產(chǎn)生菌通過導(dǎo)入has基因可以很容易地轉(zhuǎn)化為HA產(chǎn)生菌，工程菌生產(chǎn)代謝HA的過程中所面臨的諸多挑戰(zhàn)需要專門研究來增加對(duì)HA最佳生產(chǎn)條件的了解，在較為熟悉的基因工程菌株中異源表達(dá)合成HA的方法將會(huì)更加成熟和簡(jiǎn)單。隨著對(duì)HA研究的不斷深入，越來越多的研究表明HA的生物學(xué)功能與其分子量（molecular weight，MW）大小有著密切的關(guān)系。高分子量HA（MW≥1.0×106Da）由于具有較好的粘彈性、保濕性、抑制炎性反應(yīng)和潤(rùn)滑等功能，可用于關(guān)節(jié)腔注射恢復(fù)關(guān)節(jié)組織的黏彈性和修復(fù)軟骨退變。相比于高分子量HA，低分子量HA（MW≤1.0×104Da）則更容易被人體吸收，常用于整形美容和化妝品，能促進(jìn)傷口愈合和術(shù)后防粘連等。近年來，低分子HA（MW≤1.0×104Da）在食品保健以及醫(yī)藥領(lǐng)域同樣展現(xiàn)出了重要的應(yīng)用前景。研究表明，低分子HA在慢性傷口愈合和HA交聯(lián)物的開發(fā)方面具有重要作用［66］。寡糖HA10（10糖單位）和HA8可以刺激膠原合成、成纖維細(xì)胞增殖、以及通過破壞大分子HA與細(xì)胞受體的相互作用而選擇性殺死癌細(xì)胞［67-68］；而HA6和HA4可以誘導(dǎo)體內(nèi)樹突細(xì)胞的成熟以及新血管合成等［69］（表2）。

表2 透明質(zhì)酸應(yīng)用及對(duì)應(yīng)分子量總結(jié)Table 2 Summary of hyaluronic acid applications and corresponding molecular weights

HAS在調(diào)控HA分子量方面起著至關(guān)重要的作用。Weigel等［82］用基因定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)SeHAS中的4個(gè)Cys進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cys262和Cys281突變?yōu)锳la時(shí)，HA分子量降低了13%和28%。于慧敏等人進(jìn)一步對(duì)SeHAS中C端的參與穩(wěn)定HASeHAS復(fù)合物的R406-R413殘基進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)表明SeHAS的C-末端與HA之間的結(jié)合親和力會(huì)影響產(chǎn)物HA分子量的大?。?3］。盡管過去針對(duì)HAS聚合酶做了大量突變工作來探究其在HA分子量調(diào)控中的關(guān)鍵位點(diǎn)，但這些突變位點(diǎn)所在的酶結(jié)構(gòu)域中并不存在共性，這為進(jìn)一步解析HAS分子量催化機(jī)制帶來了困難，同時(shí)由于缺乏HAS結(jié)構(gòu)特征，研究學(xué)者們?nèi)晕磳AS分子量調(diào)節(jié)機(jī)制闡釋清楚。在未來，利用HAS的蛋白質(zhì)工程以及HAS蛋白序列中自然存在的差異或可實(shí)現(xiàn)HA的分子量調(diào)控。