利用小RNA深度測序技術(shù)檢測灰飛虱病毒種類

樸君 張璐婕， 樸敬愛， 周益軍 李碩

（1. 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116081；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南京 210014）

灰飛虱（Laodelphax striatellusFallén）屬半翅目（Hemiptera）飛虱科（Delphacidae）昆蟲，主要在東亞、東南亞、歐洲等地發(fā)生，其生長期短、暴發(fā)性高，具備較強(qiáng)的耐饑和耐低溫能力，是一種嚴(yán)重危害糧食作物的農(nóng)業(yè)害蟲［1］。灰飛虱在我國南方地區(qū)一般每年發(fā)生5-6世代，但種群密度相對較低，其寄主范圍十分廣泛，可取食水稻、小麥、大麥、玉米、看麥娘、稗草等禾本科植物［2］。21世紀(jì)初以來，灰飛虱在我國黃淮和長江三角洲地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，其傳播水稻條紋病毒（rice stripe virus，RSV）引起的水稻條紋葉枯病在江蘇、浙江、安徽、河南等地大面積爆發(fā)，重癥田塊發(fā)病率50%以上，對我國水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失［3］。此外，灰飛虱還可傳播水稻黑條矮縮病毒（rice black streaked dwarf virus，RBSDV）和小麥叢矮病毒（wheat rosette stunt virus），引起水稻黑條矮縮病、玉米粗縮病和小麥叢矮?。?-5］。因此，有效控制灰飛虱的再次暴發(fā)以及降低其擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)對于保障糧食安全生產(chǎn)具有重要意義。

病毒與昆蟲在長期進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜多樣的關(guān)系。灰飛虱傳播的多種植物病毒（如RSV和RBSDV）都可以在其體內(nèi)增殖，因此，這些病毒既是植物病毒，又屬于昆蟲病毒。昆蟲病毒作為天然的生物殺蟲劑，具有對人畜環(huán)境安全無害、在環(huán)境中滯留時(shí)間短、毒力強(qiáng)以及能引起害蟲種群流行病而長期控制其密度等優(yōu)點(diǎn)［6］，應(yīng)用昆蟲病毒殺蟲劑防治農(nóng)業(yè)害蟲已成為目前生物防治的一個(gè)理想途徑。德國早在19世紀(jì)末就已開展利用昆蟲病毒防治害蟲的研究，并利用昆蟲核型多角體病毒防治模毒蛾［7］。1973年聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）將昆蟲桿狀病毒作為防治農(nóng)作物害蟲的生物殺蟲劑。我國也在同年開展關(guān)于昆蟲病毒防治的研究工作，當(dāng)時(shí)應(yīng)用較廣泛的病毒是松毛蟲CPV病毒和棉鈴蟲NPV病毒［8］，其防治效果顯著高于化學(xué)農(nóng)藥，且在環(huán)境中不造成大面積有毒化學(xué)物質(zhì)殘留，有利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，維持生態(tài)平衡。目前，已鑒定出涵蓋15個(gè)科的600多種昆蟲致病性病毒［9］。之前研究人員在灰飛虱體內(nèi)鑒定出多種昆蟲病毒，如Himetobi P virus（HiPV）、Laodelphax striatellusiflavirus 1（LsIV1）等［10-12］，這暗示灰飛虱體內(nèi)有較多昆蟲病毒種類。鑒定灰飛虱體內(nèi)病毒種類，不僅可以豐富我國昆蟲病毒資源庫，同時(shí)也為利用昆蟲病毒進(jìn)行生物防治灰飛虱打下良好的基礎(chǔ)，對灰飛虱的綜合防治具有參考價(jià)值。

常規(guī)的病毒檢測方法主要有核酸檢測法、酶聯(lián)免疫法、電鏡法以及近年發(fā)展起來的高通量測序技術(shù)，但只有高通量測序能滿足對新病毒的鑒定和檢測。高通量測序技術(shù)主要通過宏基因組測序、宏轉(zhuǎn)錄組測序、小RNA深度測序3種方法來鑒定病毒，具有檢測成本較低、無序列依賴性等優(yōu)點(diǎn)［13］，還可檢測到生物體內(nèi)大部分含量較低的病毒基因［14］。昆蟲具有天然的RNAi抗病毒機(jī)制［15-16］，當(dāng)外來的病毒在其體內(nèi)復(fù)制時(shí)，會激活該機(jī)制產(chǎn)生針對入侵病毒靶RNA的siRNA，并結(jié)合和降解病毒RNA。siRNA通常只有18-30 nt，可輕易與細(xì)胞中的mRNA、tRNA和rRNA區(qū)分開，因此使用小RNA深度測序技術(shù)分析昆蟲體內(nèi)siRNA，進(jìn)而鑒定病毒種類成為一種簡便可行的方法。本研究利用小RNA深度測序技術(shù)對灰飛虱體內(nèi)昆蟲病毒資源進(jìn)行分析鑒定，為今后利用昆蟲病毒進(jìn)行生物防治灰飛虱奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 昆蟲種群 供試?yán)ハx灰飛虱種群采集自江蘇省海安縣，由江蘇省農(nóng)科院植保所植物病毒研究室經(jīng)多代篩選獲得RSV高帶毒種群（帶毒率90%以上）和無毒（RSV）種群，兩個(gè)種群在實(shí)驗(yàn)室常年維持?；绎w虱種群參照劉海建等［17］的方法篩選獲得。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑購自Invitrogen公司；Small RNA Sample Pre Kit購自Illumina公司；PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、高保真DNA聚合酶和pMD18-T克隆載體購自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 灰飛虱總RNA的提取 灰飛虱RSV高帶毒和無毒種群中各取4-5齡若蟲100頭，樣品混合后液氮研磨，用Trizol試劑提取總RNA（參照Trizol試劑說明書進(jìn)行）。取少量RNA用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)測定濃度和純度（OD268/280比值），1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量和完整性。

1.2.2 文庫構(gòu)建和測序 RNA檢測合格后，使用Small RNA Sample Pre Kit構(gòu)建文庫。利用小RNA的5′端和3′端特殊結(jié)構(gòu)（5′端有完整磷酸基團(tuán)，3′端有羥基），以總RNA為起始樣品，直接將小RNA兩端加上接頭，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。隨后經(jīng)PCR擴(kuò)增、PAGE膠電泳分離目標(biāo)DNA片段，切膠回收即得到cDNA文庫。庫檢合格后，在Illumina HiSeq 2000測序平臺進(jìn)行高通量測序，委托測序公司完成。

1.2.3 樣本病毒分析 測序獲得的原始數(shù)據(jù)序列（raw reads）中，去除不合格reads（低質(zhì)量、N比例大于10%、5′接頭污染、無3′接頭序列和插入片段、含有polyA/T/G/C），得到高質(zhì)量clean reads，篩選其中長度為18-26 bp的sRNA進(jìn)行后續(xù)分析。用bowtie將過濾后的sRNA與GenBank Virus RefSeq核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對（允許1 mismatch），對樣品中的病毒種類進(jìn)行初步鑒定。使用velvet［18-19］和PFOR［20］軟件對sRNA進(jìn)行短序列拼接，獲得contigs。Velvet軟件拼接的K-mer參數(shù)為17，PFOR軟件拼接的參數(shù)為“-x 5”。將拼接所得contigs進(jìn)行分類注釋，使用數(shù)據(jù)庫為：NCBI Nr（NCBI nonredundant protein sequences）、NCBI Nt（NCBI nonredundant nucleotide sequences）、GenBank Virus Ref-Seq Nucletide和GenBank Virus RefSeq Protein數(shù)據(jù)庫。比對采用Blast算法，參數(shù)限制e-value（Blastn：1E-6，BlastX：1E-4），得到候選病毒列表。將用bowtie初步鑒定的病毒種類與候選病毒列表比較，評估候選病毒的有效性，鑒定出灰飛虱病毒種類。

1.2.4 新病毒的RT-PCR檢測和序列分析 根據(jù)測序分析結(jié)果，在灰飛虱體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種與類復(fù)制酶置換四體病毒存在較高同源性的病毒，這類病毒尚未在半翅目昆蟲中報(bào)道，故對該病毒進(jìn)行基因檢測。根據(jù)匹配的contigs序列，設(shè)計(jì)2對特異性引物，Plv1-F：5′-ACAACGACAATGGACGCAAGCAACCC-3′，Plv1-R：5′-TGATCCGTCCATCTGTTTGAAATCTGG-3′，Plv2-F：5′-CCCAGATTTCAAACAGATGGAC GG-3′，Plv2-R：5′-GTAGAGGGCCAGGCAGAACTCC-3′。用Trizol試劑提取灰飛虱總RNA，利用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit和Random 6 mers引物反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的基因片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性單菌落測序。引物合成和測序由生工生物工程（上海）公司完成。

測序完成后根據(jù)引物去除兩端冗余序列，獲得病毒基因片段信息。序列同源性分析和多重比對使用NCBI的BLAST程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）和DNAstar軟件的MegAlign程序完成。聚類分析及進(jìn)化樹構(gòu)建利用MEGA-X軟件［21］采用鄰接法［22］（neighbor-joining）完成，核酸序列選擇Kimura-2 參數(shù)（Kimura 2-parameter）模型，氨基酸序列選擇泊松修正（Poisson Correction）模型，進(jìn)化樹的可信度使用1 000次Bootstrap Replications進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 小RNA測序獲得灰飛虱體內(nèi)病毒序列信息

灰飛虱小RNA深度測序后得到16 551 978條原始序列，經(jīng)質(zhì)控后獲得16 316 588條高質(zhì)量clean reads，其中長度為18-26 bp的sRNA為15 342 565條（94.03%）。sRNA總長度380 355 818 bp，拼接后共獲得13 816條contigs，分類注釋后共得到病毒序列296條，與13種病毒序列一致或具有較高同源性（表1）。sRNA經(jīng)bowtie比對GenBank Virus RefSeq核酸數(shù)據(jù)庫，有35 134條reads可匹配的病毒序列，所屬病毒種類涵蓋上述13種病毒，驗(yàn)證了這些病毒種類的有效性。

2.2 灰飛虱體內(nèi)病毒種類鑒定

鑒定的13種病毒分別屬于8個(gè)病毒科和2種未分類RNA病毒（表1）。由于測序所用昆蟲種群攜帶RSV，因此在獲得的全部病毒contigs中，匹配RSV的contigs占絕對數(shù)量優(yōu)勢（78.04%），該病毒屬于白纖病毒科纖細(xì)病毒屬，既是植物病毒，也是昆蟲病毒。其余7個(gè)病毒科均是專性寄生昆蟲的病毒科，與昆蟲RNA病毒相關(guān)的科2個(gè)，傳染性軟腐病病毒科和雙順反子病毒科，有3種病毒Laodelphax striatellushoneydew virus 1、LsIV1和HiPV，此前均已在灰飛虱體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。鑒定的5個(gè)屬于昆蟲DNA病毒的科分別為濃核癥病毒亞科、昆蟲痘病毒亞科、虹彩病毒科、多分體DNA病毒科和桿狀病毒科，除虹彩病毒已在灰飛虱體內(nèi)發(fā)現(xiàn)外，其余尚未在灰飛虱體內(nèi)報(bào)道，但濃核癥病毒已在半翅目的蚜蟲和木虱體內(nèi)報(bào)道，桿狀病毒已在與灰飛虱親緣性最近的昆蟲褐飛虱體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。2種分類地位暫不明確的正鏈RNA病毒中，一個(gè)與Nilaparvata lugenscommensal X virus同源，在褐飛虱體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，推測為一種衛(wèi)星病毒［23］。另一個(gè)與果蠅A病毒（Drosophila A virus，DAV）存在較高相似性，DAV是一種存在于果蠅體內(nèi)特殊的類復(fù)制酶置換四體病毒［24］，目前研究較少，故認(rèn)為在灰飛虱體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新病毒。

表1 灰飛虱中經(jīng)測序比對鑒定的病毒Table 1 Identified viruses in Laodelphax striatellus via alignment

2.3 一種新病毒的基因檢測和序列分析

為了獲取新病毒的基因序列，根據(jù)其與DAV匹配的contigs序列設(shè)計(jì)引物，以灰飛虱總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出2個(gè)符合目的基因大小的特異條帶（圖1）。經(jīng)克隆測序表明，所擴(kuò)增2個(gè)片段長度分別為1 167和803 bp，2個(gè)片段拼接得到長度為1 932 bp的序列。經(jīng)Blastn比對，其核苷酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)有意義的匹配。BlastX比對發(fā)現(xiàn)，與其氨基酸序列相似性最高的主要為下列病毒依賴RNA的RNA聚合酶（RNA-dependant RNA polymerase，RdRP）：Smithfield permutotetra-like virus（GenBank登錄號：QIJ25871.1）1-642位（56.68%）、一株野田村病毒科病毒（A Nodaviridae virus）（QIJ25871.1）1-644位（56.90%）、Culex Daeseongdong-like virus（AXQ04818.1）1-642位（56.59%）、DAV（AKH67411.1）1-645位（53.70%）、Vespa velutina associated permutotetra-like virus 2（QGL51736.1）1-645位（52.47%） 以 及Hubei permutotetra-like virus 11（YP_009337276.1）1-642位（51.08%）。這些RNA病毒的分類地位暫不明確，但它們有一個(gè)共同特點(diǎn)，即在復(fù)制酶RdRP的掌型亞結(jié)構(gòu)域（Palm subdomain）中，保守區(qū)域的排列發(fā)生了置換，GDD box（C motif）位于A和B motif之前，呈“C-A-B”樣式排列，這一特點(diǎn)與復(fù)制酶置換四體病毒科（Permutotetraviridae）病毒的RdRP相同。將這些病毒進(jìn)行氨基酸序列比對，在新病毒RdRP序列中也發(fā)現(xiàn)了保守的A、B和C motif，并且C motif同樣發(fā)生了置換，位于A motif上游（圖2），說明其RdRP掌型亞結(jié)構(gòu)域保守區(qū)同樣呈“C-A-B”樣式排列。這些結(jié)果暗示擴(kuò)增的病毒基因片段確實(shí)來源于一種新的類復(fù)制酶置換四體病毒，將其暫命名為Laodelphax striatelluspermutotetra-like virus（LsPLV），這是首次在半翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)類復(fù)制酶置換四體病毒。

圖1 LsPLV RdRP基因片段的擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of RdRP gene segment

圖2 類復(fù)制酶置換四體病毒RdRP氨基酸序列比對顯示“C-A-B”motif的排列Fig.2 Amino acid alignment of permutotetra-like virus RdRP showing C-A-B motif arrangement

2.4 新病毒LsPLV RdRP基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

從上述NCBI數(shù)據(jù)庫BlastX比對結(jié)果中，選取15個(gè)代表性病毒分離物，利用MEGA-X軟件將LsPLV與這15個(gè)病毒RdRP序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，核酸和氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹相似，這些病毒的RdRP可聚類到2個(gè)大的分支中（圖3），但均沒有病毒分離物與LsPLV構(gòu)成最小分支，說明LsPLV與已報(bào)道的類復(fù)制酶置換四體病毒存在較大的進(jìn)化差異，其核苷酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中匹配不到有意義的結(jié)果也說明了這一點(diǎn)。在病毒聚類的2大分支中，分離物采集地沒有明顯的地域界限，由于很多分離物的寄主信息不完善，僅顯示“節(jié)肢動物”、“昆蟲”等信息，因此，也很難區(qū)分出這些分離物的寄主界限，但可以初步說明這類病毒在昆蟲中是廣泛存在的，不同寄主來源的病毒之間基因差異較大。最后，已知自然條件下類復(fù)制酶置換四體病毒僅侵染無脊椎動物，但16個(gè)分離物中，有2個(gè)病毒并不是在昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，而是利用高通量測序從鳥類（A Nodaviridae virus）和植物紫花地丁（VpPLV）中檢測到。

3 討論

病毒幾乎可以感染所有的生命體，是全世界種類十分龐大的微生物，也是引起人類和動植物疾病的主要病原體類型之一。一般來說，有兩大類病毒與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)密切相關(guān)，一類是引起動植物病害的病毒，一類是作為生物防治資源的病毒。昆蟲病毒是一類理想的生物防治資源，利用昆蟲病毒研制的病毒殺蟲劑具有致病力強(qiáng)、專一性強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)和生產(chǎn)簡便等優(yōu)點(diǎn)［6］，發(fā)展前景十分廣闊。目前研究較多、應(yīng)用較廣的昆蟲病毒主要是核型多角體病毒（NPV）、顆粒體病毒（GV）和質(zhì)型多角體病毒（CPV）等［25］，這些病毒主要靶向鱗翅目害蟲，而防治半翅目害蟲的昆蟲病毒在生產(chǎn)上尚不多見?；绎w虱是半翅目中重要的病毒媒介昆蟲，鑒定灰飛虱體內(nèi)昆蟲病毒種類，對于挖掘昆蟲病毒資源以及今后的生防研究和應(yīng)用具有重要意義。

利用傳統(tǒng)測序技術(shù)鑒定病毒可能會漏檢含量較低的病毒，與之相比，高通量測序技術(shù)可避免這一缺陷，提高病毒種類篩查的效率和全面性。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，依靠該技術(shù)報(bào)道出來的病毒種類越來越多，試劑成本越來越低，應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣，該技術(shù)已成為一個(gè)方便快捷的研究工具［13-14］，它極大地縮短了分析工作所花費(fèi)的時(shí)間。本文圖3系統(tǒng)進(jìn)化分析所涉及的16個(gè)病毒分離物中，除Thosea asigna virus（TaV）［26］、Euprosterna elaeasa virus（EeV）［27］和DAV［24］是通過傳統(tǒng)測序方法獲得，其余均是2015年之后通過高通量測序技術(shù)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的，便是該技術(shù)推動病毒鑒定研究的直觀體現(xiàn)。

圖3 根據(jù)不同類復(fù)制酶置換四體病毒RdRP序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on RdRP sequence consistency of different permutotetra-like viruses

本研究對灰飛虱攜帶的病毒種類進(jìn)行了全面分析，通過小RNA深度測序檢測灰飛虱RNAi免疫機(jī)制產(chǎn)生的siRNA，再根據(jù)小RNA之間存在重疊序列這一特點(diǎn)，將其組裝成較長的contigs，通過數(shù)據(jù)庫比對鑒定病毒種類，最終從灰飛虱中鑒定出13種病毒，涉及8個(gè)病毒科和2種未分類病毒。由于測序所用昆蟲種群攜帶RSV，因此匹配RSV的contigs在數(shù)量上占絕對優(yōu)勢。其余病毒均為專性寄生的昆蟲病毒，其中，3種RNA病毒和1種DNA病毒（虹彩病毒）已在灰飛虱體內(nèi)報(bào)道［10-12，28］，5種病毒已在半翅目的褐飛虱、蚜蟲、木虱等昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)［29-31］，只有昆蟲痘病毒、繭蜂病毒（多分體DNA病毒科）和一個(gè)類似DAV的病毒尚未在灰飛虱以及其它半翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)。本研究所用灰飛虱來自實(shí)驗(yàn)室常年飼養(yǎng)種群，灰飛虱不同地理種群所攜帶的昆蟲病毒種類也不盡相同［32］，因此，本次鑒定的病毒種類是少于自然界中實(shí)際可侵染灰飛虱的病毒種類，更多的病毒種類仍需今后進(jìn)一步挖掘。在鑒定的病毒中，很多DNA病毒的相似分離物已經(jīng)被用于農(nóng)業(yè)害蟲生物防治研究和應(yīng)用，而RNA病毒相關(guān)生物防治研究還較少，這些病毒的發(fā)現(xiàn)為今后生防研究和應(yīng)用提供了候選病毒資源。

對灰飛虱中類似DAV的病毒進(jìn)行基因檢測，獲得了RdRP基因1-1 932位核酸序列，經(jīng)Blast比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析，在氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)RdRP掌型亞結(jié)構(gòu)域保守區(qū)呈現(xiàn)復(fù)制酶置換四體病毒科病毒所具有的“C-A-B”排列樣式［26-27］，確定該病毒是一種新的類復(fù)制酶置換四體病毒，暫命名為LsPLV。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，類復(fù)制酶置換四體病毒在昆蟲中廣泛存在，不同寄主來源的病毒之間基因差異較大。與LsPLV同源性較高的病毒分離物中，有2個(gè)病毒并不是在昆蟲體內(nèi)檢測到，而是在鳥類和植物樣品中發(fā)現(xiàn)。根據(jù)已知信息，自然條件下這類病毒僅侵染無脊椎動物，因此，我們認(rèn)為這2個(gè)病毒來自測序樣本的“環(huán)境污染”，一個(gè)可能來自鳥消化道中尚未消化的昆蟲體內(nèi)的病毒殘留，另一個(gè)可能來自植物葉片表面上昆蟲排泄物中病毒殘留。這一現(xiàn)象也說明自然界中這類病毒在昆蟲體內(nèi)廣泛存在，同時(shí)也暗示這類病毒粒子結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定、不易降解，能在自然環(huán)境下存活一定時(shí)間，較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性使得該病毒具備進(jìn)一步開發(fā)為昆蟲病毒殺蟲劑的一個(gè)潛在優(yōu)勢。

本研究首次在半翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)類復(fù)制酶置換四體病毒。目前，LsPLV的全基因組測序正在進(jìn)行中，其對灰飛虱的致病性還不明確，該病毒是否可侵染其他稻飛虱（褐飛虱、白背飛虱）及其它半翅目昆蟲也不清楚，這些問題都將在今后的工作中進(jìn)一步研究，為LsPLV在生物防治中的早日應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本文利用小RNA深度測序技術(shù)在灰飛虱體內(nèi)鑒定了13種病毒，涉及8個(gè)病毒科和2種未分類病毒，并首次在半翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)一種新的類復(fù)制酶置換四體病毒LsPLV。