楊佳慧 孫玉萍 陸雅寧 劉歡 盧存福 陳玉珍
(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院 教育部林木花卉育種與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)
端粒酶的生物學(xué)功能研究在寄生蟲(chóng)[14]、老鼠[15]、人[16]等領(lǐng)域取得較大進(jìn)展。植物端粒酶的研究最初是在煙草細(xì)胞的提取物中檢測(cè)到端粒酶活性[17];并首次從擬南芥懸浮細(xì)胞中克隆出擬南芥AtTERT的cDNA,端粒酶分子量131 kD,等電點(diǎn)9.9[18];Heller-Uszynska等[19]采用同源序列比對(duì)的方法克隆出單子葉植物水稻中的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因,為植物端粒酶功能研究奠定了基礎(chǔ)。端粒酶的研究在非模式植物中取得較大進(jìn)展,建立了不同植物材料端粒酶活性檢測(cè)方法[20-21]。已有研究表明,在大腸桿菌中可成功表達(dá)出有活性的逆轉(zhuǎn)錄酶,Tanese等[22]構(gòu)建了莫洛尼鼠白血病病毒的pol核心區(qū)域的表達(dá)載體,在大腸桿菌中成功表達(dá)出具有活性逆轉(zhuǎn)錄酶。
目前,人hTERT已在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)活性重建[23],但尚未見(jiàn)植物TERT在大腸桿菌中發(fā)揮功能的報(bào)道。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上,將擬南芥AtTERT轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,誘導(dǎo)表達(dá)可溶性AtTERT蛋白,研究其對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)及非生物脅迫的影響,為深入研究TERT蛋白非端粒功能奠定基礎(chǔ)。
所用植物材料為哥倫比亞(Col-0)擬南芥。菌株為實(shí)驗(yàn)室保存的轉(zhuǎn)pET32a-AtTERT原核表達(dá)菌株。
IPTG、考馬斯亮藍(lán)、GST親和層析純化試劑、鎳柱親和層析純化試劑、Western blotting相關(guān)試劑及試劑盒均購(gòu)自北京拜爾迪生物科技公司。
1.2.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化 引物設(shè)計(jì):利用Primer5軟件分析AtTERT的CDS序列,結(jié)合pET32a和pGEX-4T-1原核表達(dá)載體上的多克隆位點(diǎn)信息,確定酶切位點(diǎn)BamH I和NotI。使用軟件CE Design(http://www.vazyme.com)設(shè)計(jì)引物,pGEX-4T-1和pET32a對(duì)應(yīng)的引物分別為GST-F/R和32-F/R(32-F:5′-gccatggctgatatcggatccATGCCGCGTAA ACCTAGACATC-3′、32-R:5′-tggtggtgctcgagtgcggccgc ATAATTCAACTTCCACAGCGAAG-3′;GST-F:5′-gat ctggttccgcgtggatccATGCCGCGTAAACCTAGACATC-3′、GST-R:5′-tcagtcagtcacgatgcggccgcTCAATAATTCAA CTTCCACAGCGA-3′;小寫字母代表載體序列引物部分)。
目的基因的PCR擴(kuò)增:提取保存測(cè)序正確的AtTERT克隆菌株質(zhì)粒,作為PCR擴(kuò)增模板,以32a-F/GST-F及引物32a-R/GST-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,切膠回收目的基因片段。
1.2.1受試者檢查方法 對(duì)受試者開(kāi)展常規(guī)治療。例如胃腸道減壓、及時(shí)抗感染等等。分別使用彩色多普勒超聲診斷設(shè)備以及多功能直接數(shù)字化X線成像系統(tǒng),對(duì)患兒開(kāi)展檢查。受試者取仰臥位,多切面掃查患兒腹部。開(kāi)展實(shí)時(shí)監(jiān)控腸壁回聲,全面判定腸壁厚度和腸管外形形狀情況對(duì)受試者的腸腔、門靜脈以及腹腔加以觀察,分析是否存在異?,F(xiàn)象。例如擴(kuò)張積液等等[3]。在此之后,對(duì)患兒腹部開(kāi)展橫向以及縱向掃描檢查,以免發(fā)生積氣假象現(xiàn)象發(fā)生。對(duì)探頭加壓,分析積氣來(lái)源。全面明確病變位置位于管壁內(nèi)還是管腔中。使用陽(yáng)性以及陰性,來(lái)表示X線檢查和超聲診斷結(jié)果。陽(yáng)性代表腸壁內(nèi)存在積氣。陰性代表腸壁積氣、腸壁增厚以及門靜脈積氣等均未出現(xiàn)。
載體構(gòu)建:提取pET32a和pGEX-4T-1空載體質(zhì)粒,利用BamH I和NotI進(jìn)行酶切,然后與目的基因片段重組連接,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-AtTERT和pGEX-4T-1-AtTERT,并轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行PCR鑒定。
遺傳轉(zhuǎn)化:選取測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒菌液,轉(zhuǎn)化Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,獲得轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株。
1.2.2 AtTERT蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá):將陽(yáng)性重組菌及空載菌液置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600=0.6-0.8);加入終濃度為1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h,以不加IPTG作為對(duì)照。
樣品制備:收集菌體,使用細(xì)胞破碎儀破碎菌體至菌液澄清,并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),融合蛋白純化試驗(yàn)在4℃條件下操作。
Western blotting檢測(cè):將經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品電轉(zhuǎn)至0.45 μm硝酸纖維素膜上,加入一抗(HIS抗體)、二抗(羊抗鼠的辣根過(guò)氧化物酶HRP抗體),洗膜、拍照。
1.2.3 轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌的非生物脅迫抗性檢測(cè) 轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌的生長(zhǎng)特性:將對(duì)照菌pET32a及轉(zhuǎn)AtTERT重組菌以1∶100的比例接種至新鮮50 mL LB液體培養(yǎng)基(含有終濃度0.5 mmol/L IPTG),誘導(dǎo)至菌液濃度為OD600=0.6,此時(shí)記為初始濃度,繼續(xù)震蕩培養(yǎng),在2、4、6、8、10和12 h時(shí)測(cè)量OD600值,做好記錄,并做成曲線。
對(duì)照菌pET32a及轉(zhuǎn)AtTERT重組菌活化后,加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG,20℃、100 r/min過(guò)夜誘導(dǎo)培養(yǎng);將2種菌稀釋至相同濃度(OD600=1.2),進(jìn)行不同非生物脅迫抗性檢測(cè)存活率,試驗(yàn)重復(fù)3次。
氯化鈉、甘露醇抗性檢測(cè):經(jīng)實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)試驗(yàn),確定氯化鈉的處理濃度為400和500 mmol/L,甘露醇的處理濃度為400和600 mmol/L。取6 μL兩種菌液分別垂直加到LB固體培養(yǎng)基(含有0.5 mmol/L IPTG和NaCl/甘露醇)上,37℃,倒置培養(yǎng)12 h,按照計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)存活率。
低溫抗性檢測(cè):取1 mL的2種菌液于液氮中反復(fù)凍融5-6次,然后取6 μL分別垂直加到LB固體培養(yǎng)基(含有0.5 mmol/L IPTG)上,37℃,倒置培養(yǎng)12 h,統(tǒng)計(jì)存活率。
過(guò)氧化氫(H2O2)耐受性檢測(cè):采用點(diǎn)板計(jì)數(shù)法,取6 μL計(jì)數(shù)法準(zhǔn)備的2種菌液分別垂直加到LB固體培養(yǎng)基(含有0.4 mmol/L H2O2)上,37℃,倒置培養(yǎng)12 h,統(tǒng)計(jì)存活率。
提取測(cè)序正確的菌株質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1),以帶有15-20 bp載體序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得目的基因片段,片段大小與預(yù)期一致,為3 409 bp。
圖1 AtTERT的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification of AtTERT gene
將測(cè)序正確的菌液提取質(zhì)粒,并用BamH I及NotI酶切鑒定,酶切后片段大小與目的基因片段一致(圖2),說(shuō)明pET32a/ pGEX-4T-1-AtTERT原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。
圖2 pET32a/ pGEX-4T-1-AtTERT重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Double digestion identification of pET32a/ pGEX-4T-1-AtTERT
2.2.1 誘導(dǎo)表達(dá) GST-AtTERT融合蛋白條件的優(yōu)化 用Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞對(duì)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的IPTG濃度(0.3/0.5/1.0 mmol/L)及溫度(20/30℃)進(jìn)行了優(yōu)化(圖3),在溫度為20℃時(shí)特異性蛋白的表達(dá)量明顯高于30℃時(shí)。在誘導(dǎo)溫度為30℃,IPTG濃度為0.5 和1.0 mmol/L時(shí),特異性蛋白條帶在上清及沉淀中均有表達(dá),但主要存在于沉淀中;而在溫度為20℃,IPTG濃度為0.3、0.5和1.0 mmol/L時(shí),特異性蛋白條帶在上清及沉淀中均有表達(dá),但主要存在于上清中,而且在IPTG濃度為0.5 mmol/L時(shí),上清中蛋白表達(dá)量相對(duì)較高。因此,優(yōu)化后的蛋白誘導(dǎo)條件為誘導(dǎo)溫度20℃,誘導(dǎo)劑(IPTG)濃度0.5 mmol/L。
圖3 GST-TERT蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)Fig. 3 Detection of GST-TERT protein by SDS-PAGE
2.2.2 GST-AtTERT融合蛋白的純化及鑒定 為驗(yàn)證SDS-PAGE中的特異性蛋白條帶是否為帶有GST標(biāo)簽的目的蛋白,利用融合蛋白中的GST標(biāo)簽對(duì)全菌液、上清、沉淀及純化后組分進(jìn)行了Western blotting驗(yàn)證,結(jié)果(圖4)顯示,在誘導(dǎo)全菌、上清及沉淀中均出現(xiàn)與預(yù)期蛋白相對(duì)分子量大小相符的條帶,為156 kD,與SDS-PADG分析結(jié)果一致。
圖4 Western blotting鑒定GST-AtTERT融合蛋白Fig. 4 Western blotting identification of GST-AtTERT fusion protein
2.3.1AtTERT抑制大腸桿菌的生長(zhǎng) 為研究AtTERT對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)特性的影響,測(cè)定空載對(duì)照菌(pET32a)和轉(zhuǎn)AtTERT重組菌在同等條件下的生長(zhǎng)狀況,結(jié)果(圖5)顯示,兩種菌株均呈現(xiàn)“S”型生長(zhǎng)趨勢(shì),在生長(zhǎng)4-10 h時(shí),空載對(duì)照菌的生長(zhǎng)速度總是顯著高于轉(zhuǎn)AtTERT重組菌;在生長(zhǎng)10-12 h時(shí),空載對(duì)照菌生長(zhǎng)速度趨于平緩,而轉(zhuǎn)基因重組菌生長(zhǎng)仍然相對(duì)較快,兩者菌濃度差距變小但空載對(duì)照菌的菌濃度仍然顯著高于轉(zhuǎn)基因重組菌,說(shuō)明AtTERT抑制了大腸桿菌的生長(zhǎng)。
圖5 AtTERT對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)特性的影響Fig.5 Effect of AtTERT on the growth characteristics of E.coli
2.3.2 轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌的鹽脅迫抗性增強(qiáng) 為研究轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌對(duì)鹽脅迫抗性的影響,采用點(diǎn)板法對(duì)轉(zhuǎn)AtTERT重組菌和空載體對(duì)照菌進(jìn)行了NaCl抗性檢測(cè),結(jié)果表明,對(duì)照菌和重組菌在空白LB基本固體培養(yǎng)基(0 mmol/L NaCl)上生長(zhǎng)良好且無(wú)顯著差異;但采用400和500 mmol/L NaCl處理時(shí),轉(zhuǎn)AtTERT重組菌存活率顯著高于空載對(duì)照菌(圖6),說(shuō)明轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌的鹽脅迫抗性增強(qiáng)。
圖6 鹽脅迫下AtTERT對(duì)大腸桿菌存活率的影響Fig.6 Effect of AtTERT on the survival rate of E. coli under salt stress
2.3.3 轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌甘露醇脅迫抗性增強(qiáng) 采用點(diǎn)板法對(duì)轉(zhuǎn)AtTERT重組菌和空載體對(duì)照菌進(jìn)行了甘露醇脅迫處理,發(fā)現(xiàn)對(duì)照菌和重組菌在空白LB基本固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好且無(wú)顯著差異;但經(jīng)400和600 mmol/L甘露醇處理時(shí),轉(zhuǎn)AtTERT重組菌存活率明顯高于空載對(duì)照菌(圖7),故轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌甘露醇脅迫抗性增強(qiáng)。
圖7 甘露醇脅迫下AtTERT對(duì)大腸桿菌存活率的影響Fig.7 Effect of AtTERT on the survival rate of E. coli under mannitol stress
2.3.4 轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌低溫抗性減弱 為研究轉(zhuǎn)AtTERT對(duì)大腸桿菌低溫脅迫抗性的影響,采用點(diǎn)板法對(duì)轉(zhuǎn)AtTERT重組菌和空載體對(duì)照菌進(jìn)行了液氮反復(fù)凍融處理,結(jié)果(圖8)表明,對(duì)照菌和重組菌在LB基本固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好且無(wú)顯著差異;經(jīng)過(guò)液氮反復(fù)凍融5次時(shí),兩者的存活率沒(méi)有顯著差異,但是液氮反復(fù)凍融6次時(shí),轉(zhuǎn)AtTERT重組菌存活率顯著低于空載對(duì)照菌,說(shuō)明轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌低溫抗性減弱。
圖8 低溫脅迫下AtTERT對(duì)大腸桿菌存活率的影響Fig.8 Effect of AtTERT on the survival rate of E. coli under cold stress
2.3.5 轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌H2O2耐受性增強(qiáng) 為研究轉(zhuǎn)AtTERT對(duì)大腸桿菌H2O2耐受性影響,采用點(diǎn)板技術(shù)法及在菌液中直接添加H2O2測(cè)定菌液OD600值2種方法(圖9)。點(diǎn)板法結(jié)果顯示,對(duì)照菌和重組菌在空白LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好且無(wú)顯著差異;但是在含有H2O2的LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況顯著高于空載對(duì)照菌(圖9-B)。
圖9 H2O2脅迫下AtTERT對(duì)大腸桿菌存活率的影響Fig. 9 Effect of AtTERT on the survival rate of E. coli under hydrogen peroxide stress
端粒酶是基本的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶,在真核細(xì)胞中負(fù)責(zé)端粒延長(zhǎng),把DNA復(fù)制損失的端粒填補(bǔ)起來(lái),使端粒不會(huì)因細(xì)胞分裂而有所損耗,端粒酶在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細(xì)胞長(zhǎng)期的活性和潛在的繼續(xù)增殖能力等方面具有重要作用[3-5]。已有研究表明,端粒酶除具有端粒DNA的合成作用外,還具有非端粒功能[7],生命活動(dòng)的多種應(yīng)激反應(yīng)與TERT介導(dǎo)相關(guān),如調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖和分化有關(guān)的基因表達(dá)[24],改善DNA損傷修復(fù)[25-26],增加細(xì)胞凋亡抗性[27]或減少凋亡信號(hào)傳導(dǎo)[28]等。在研究模式植物擬南芥AtTERT功能時(shí)發(fā)現(xiàn),由AtTERT生物學(xué)功能網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可推測(cè),AtTERT和多種蛋白相互作用,這些蛋白中部分參與維持端粒長(zhǎng)度,具有保護(hù)端粒末端結(jié)構(gòu)的作用,值得關(guān)注的是SMG7可能在植物防御中發(fā)揮作用,這表明擬南芥AtTERT如同動(dòng)物等TERT,除具有合成端粒末端結(jié)構(gòu)生物學(xué)功能外,還可行使其非端粒的生物學(xué)功能[29-32]。
Fojtová等[33]研究重金屬鎘脅迫與DNA修復(fù)時(shí)發(fā)現(xiàn),大部分DNA鏈斷裂在脫鎘48 h內(nèi)得到修復(fù),端粒酶活性在恢復(fù)期增加了2.5倍,表明端粒酶可能與DNA修復(fù)有關(guān),認(rèn)為植物可能已經(jīng)建立了一套高效的DNA修復(fù)系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì)短暫的環(huán)境脅迫。吳曉飛等[34]以胡楊(Populus euphratica)和合作楊(P.simonii×P. pyramibalis)懸浮細(xì)胞為材料,0和20 mmol/L H2O2處理提高胡楊細(xì)胞端粒酶活性,而合作楊端粒酶對(duì)H2O2不敏感,研究認(rèn)為抗鹽性強(qiáng)胡楊細(xì)胞的端粒酶對(duì)抵御其細(xì)胞內(nèi)氧化損傷具有一定作用。張徐俞等[32]發(fā)現(xiàn),采用500 mmol/L高濃度鹽脅迫時(shí),初期端粒酶活性迅速增加,但隨后端粒酶活性下降;當(dāng)高鹽處理后移除 NaCl 脅迫,端粒酶活性可增加1.4倍,且DNA穩(wěn)定性提高;同時(shí)孫麗春等[35]采用熒光定量PCR檢測(cè)到,高鹽、干旱、高熱及低溫脅迫均能導(dǎo)致沙冬青幼苗根和葉中AmTERT的表達(dá)量升高,表明植物細(xì)胞端粒酶可能和動(dòng)物細(xì)胞一樣具有應(yīng)激保護(hù)功能。王楊等[36]發(fā)現(xiàn),采用濃度100 mmol/L NaCl處理模式植物擬南芥幼苗3 d時(shí),其端粒酶活性升高,鹽處理時(shí)間延長(zhǎng)端粒酶活性下降;同時(shí)AtTERT表達(dá)量也呈現(xiàn)先升高后降低的規(guī)律性變化,這些抗性結(jié)果說(shuō)明,雖然不同物種對(duì)不同脅迫處理抗性程度表現(xiàn)不同,但在一定脅迫范圍內(nèi),植物抗性應(yīng)激反應(yīng)與其端粒酶活性及TERT的表達(dá)量密切相關(guān)。
端粒酶的生物發(fā)生是一個(gè)高度調(diào)控的過(guò)程,解決了DNA的末端復(fù)制問(wèn)題,但這些研究均是在真核生物背景下完成。Hansen等[23]為了揭示TERT的結(jié)構(gòu)和功能,進(jìn)行了人類端粒酶在原核生物中的表達(dá)研究,在表達(dá)序列優(yōu)化的hTERT基因大腸桿菌細(xì)胞提取物中,檢測(cè)到端粒酶重復(fù)擴(kuò)增(TRAP)陽(yáng)性活性,尤其是終點(diǎn)TRAP顯示的表達(dá)水平是HeLa癌細(xì)胞的3倍,這些結(jié)果首次報(bào)道了來(lái)自細(xì)菌的TRAP活性,并為獨(dú)立于真核環(huán)境的組裝因子和抗癌治療的研究提供了一個(gè)簡(jiǎn)便的系統(tǒng)。而植物TERT在大腸桿菌中的表達(dá)還未見(jiàn)報(bào)道,本研究將擬南芥AtTERT成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,構(gòu)建了pET32a-AtTERT原核表達(dá)載體,并優(yōu)化了AtTERT蛋白誘導(dǎo)條件,獲得了純化GST-AtTERT融合蛋白(156 kD);同時(shí)檢測(cè)了轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌的非生物脅迫抗性:轉(zhuǎn)AtTERT重組菌在NaCl(400 和500 mmol/L)、甘露醇(400和600 mmol/L)和H2O2(0.4 mmol/L)的LB固體培養(yǎng)基上的存活率顯著高于空載對(duì)照菌LB固體培養(yǎng)基上的存活率,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌NaCl鹽脅迫、甘露醇滲透脅迫、H2O2氧化脅迫抗性增強(qiáng),表明擬南芥AtTERT具有提高大腸桿菌的鹽滲透脅迫抗性及氧化應(yīng)激能力。Ahmed等[29]在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)hTERT時(shí)發(fā)現(xiàn),線粒體膜電位增加,線粒體超氧化物產(chǎn)生和細(xì)胞過(guò)氧化物水平降低及mtDNA受到保護(hù),但TERT在大腸桿菌中如何參與非生物脅迫過(guò)程減少ROS的形成、保護(hù)DNA完整性、增強(qiáng)細(xì)胞凋亡抗性以及調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)等還有待于進(jìn)一步深入研究。
優(yōu)化AtTERT蛋白誘導(dǎo)條件,獲得156 kD純化GST-AtTERT融合蛋白,轉(zhuǎn)AtTERT重組大腸桿菌獲得多種非生物脅迫抗性,表明擬南芥AtTERT具有抗非生物脅迫的非端粒功能。