辣椒DNA甲基化修飾酶基因的鑒定與表達特征分析

張 穎　蔡小桃　謝炳春　韋麗麗　徐小萬　張碧佩　吳智明

摘? 要：DNA甲基化與去甲基化是表觀遺傳修飾中一種保守的分子機制，參與植物生長發(fā)育、次生代謝和逆境脅迫響應等多種生物過程，受DNA甲基化修飾酶基因的調控。為了解DNA甲基化修飾酶基因在辣椒基因組中的特征，利用生物信息學手段鑒定出14個辣椒DNA甲基轉移酶和去甲基化酶基因，并對其進行系統(tǒng)分析。結果表明：辣椒基因組中含10個DNA甲基轉移酶和4個去甲基化酶基因，這些基因編碼的氨基酸介于294～2037 aa之間，不均勻分布于除6號和11號染色體外的其余10條染色體上，基因所含的外顯子數(shù)目在1～21之間，關系較近的基因擁有的保守域基本一致。組織特異性表達結果顯示，和在所有組織的表達量均很低，而和在所有組織中表達量均較高。通過qPCR分析基因在高溫和鹽脅迫下的表達模式，對比高溫處理的整個時期，發(fā)現(xiàn)處理3?h的材料中甲基化修飾酶基因表達量變化最明顯，上調最高的基因分別為和;鹽脅迫誘導下的材料在12?h處理時甲基化修飾酶基因最敏感，有9個基因表達量達到峰值，上調最高的基因分別為和。本研究為進一步揭示辣椒DNA甲基化修飾酶基因家族在表觀遺傳學中的調控作用提供理論參考。

關鍵詞：辣椒;DNA甲基化;果實發(fā)育;非生物脅迫;表達分析

中圖分類號：S813.3??????文獻標識碼：A

Identification and Expression Analysis of the DNA Methyltransferase and Demethylase Gene Families in L.

ZHANG Ying CAI Xiaotao ?XIE Bingchun WEI Lili XU Xiaowan ZHANG Bipei WU Zhiming

1. College of Horticulture and Landscape Architecture， Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou， Guangdong 510225， China; 2. Vegetable Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetables， Guangzhou， Guangdong 510640， China

DNA methylation or demethylation is a highly conserved epigenetic modification involved in the regulation of numerous biological processes， including plant growth and development， secondary metabolism， and response to abiotic stresses， which controlled by DNA methyltransferase and demethylase genes. To fully understand the characteristics of DNA methylation modifying enzyme genes in the pepper genome， a total of 10 putative DNA methyltransferase and 4 demethylase genes were identified in pepper in the present study by using bioinformatics methods. The amino acids encoded by the genes were between 294–2037?AA. The genes were located on 10 different chromosomes， the number of exons contained in the 14 genes is between 1 and 21. The conserved motif compositions and exon-intron structures were systematically analyzed， and the results strongly supported the classi?cation. Transcriptome data analysis proved that the expression levels of family member genes in different organs of pepper and different stages of fruit development were different. Among them， and showed the lowest expression in all organs， while and showed the highest. The expression pattern of genes under high temperature and salt stress was analyzed by qPCR. Compared with the whole period of high temperature treatment， it was found that the expression of methylation modifying enzyme gene changed most obviously in materials treated for 3 hours， and the genes with the highest up-regulation were and ， respectively. The methylation modifying enzyme gene of the materials induced by salt stress was the most sensitive when treated for 12 hours， and the expression of 9 genes reached the peak， and the genes with the highest up-regulation were and. This study would provide a theoretical reference for further revealing the regulatory role of pepper DNA methylation modifying enzyme gene family in epigenetics.

pepper （ L.）; DNA methylation; fruit development; abiotic stress; expression

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.02.004

表觀遺傳（epigenetics）是指不依賴DNA序列的改變所產生的可遺傳的變異，在動植物界均普遍存在。DNA甲基化（DNA methylation）與去甲基化（demethylation）是表觀遺傳修飾中最早發(fā)現(xiàn)且非常保守的分子機制之一，通過改變染色質結構、DNA構象、DNA穩(wěn)定性或DNA與蛋白質的相互作用方式調控基因的表達 。已有研究表明，植物DNA甲基化參與許多生物學過程的調控，在維持基因組穩(wěn)定、組織器官的生長發(fā)育及響應脅迫應答等過程中均發(fā)揮了重要作用。

植物DNA甲基化修飾過程通常由DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase）和DNA去甲基化酶（DNA demethylase）共同作用，前者主要包括甲基轉移酶MET1（Methyltransferase 1）、染色質甲基化酶CMT3（Chromomethylase 3）和結構域重排甲基轉移酶DRMs（Domain-rearranged methyltransferases）等，分別負責CG、CHG和CHH（H=A，C或T）的甲基化修飾。DNA去甲基化酶基因通常都含有保守的DNA糖苷酶結構域，屬于DNA葡萄糖基酶（DNA glycosylases）家族，如DME（DEMETER）、DML2和DML3（DEMETER-like proteins 2 and 3）和沉默抑制子ROS1（Repressor of Silencing 1）等 。基于基因組水平的生物信息學分析，目前研究者已分別從擬南芥、水稻、玉米、花生、丹參、番茄、茶和石斛等多種植物中鑒定出8～14個不等的DNA甲基化修飾酶基因，對這些基因功能的研究主要集中在模式植物如擬南芥、水稻和番茄中，基因突變后可引起擬南芥、水稻整個或部分基因組DNA甲基化水平發(fā)生改變。

辣椒（spp.）是重要的茄科蔬菜作物，原產于墨西哥和中南美洲，約在明朝末年經絲綢之路和東南亞海路傳入我國。我國辣椒年播種面積超過200萬hm，是種植面積最大的蔬菜種類之一。本研究團隊前期運用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術（methylation sensitive amplified polymorphism， MSAP）分析了一年生辣椒（ L.）和中華辣椒（ Jacq.）種間與種內DNA甲基化多樣性，發(fā)現(xiàn)辣椒表觀遺傳十分豐富。同時分析了高溫高濕脅迫下辣椒基因組DNA甲基化水平及狀態(tài)的變化，推測DNA去甲基化可能是辣椒耐高溫高濕的機制之一。最近也有研究表明，DNA甲基化修飾酶基因與植物激素相互作用，參與辣椒果實成熟的調控。其他有關辣椒DNA甲基化表觀遺傳調控的研究甚少。

2014年，韓國和中國研究團隊連續(xù)完成了對辣椒基因組的測序，為后續(xù)辣椒應用基礎研究提供了重要支撐。本研究通過生物信息學手段從辣椒基因組中鑒定DNA甲基轉移酶和DNA去甲基化酶家族成員，對其結構、染色體定位、系統(tǒng)進化、蛋白質保守序列進行分析，并比較該基因家族在辣椒不同組織及在逆境處理下的表達模式，為進一步挖掘辣椒甲基化修飾酶基因的功能提供參考依據。

? 材料與方法

? 材料

供試材料為一年生辣椒（Capsicum annuum L.）栽培種‘遵辣1號’（Zunla-1），由遵義市農業(yè)科學院辣椒研究所提供。種子經浸泡過夜，28℃催芽，出芽后播種于裝有專用育苗基質的50孔穴盤，待植株長至5～6片真葉，一批露地種植于仲愷農業(yè)工程學院教學科研基地，按常規(guī)栽培管理;另一批用于逆境處理試驗。逆境試驗選擇長勢良好且長勢一致的植株，分別經42℃高溫和200?mmol/L NaCl脅迫處理，以未經處理正常生長的材料作為對照（CK），處理后0、3、6、12?h采取辣椒葉片，每個處理10株，設3個生物學重復，液氮速凍后立即放入–80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

? 方法

1.2.1? 辣椒DNA甲基化修飾酶基因家族成員的鑒定? 在擬南芥基因組數(shù)據庫（https：//www. arabidopsis.org/）搜索獲得擬南芥中DNA甲基化修飾酶基因：（AT5G49160.1）、（AT1G80740.1）、（AT4G19020.1）、（AT1G69770.1）、（AT5G25480.1）、（AT5G15380.1）、（AT5G04560.2）、（AT3G10010.1）、（AT4G34060.1）和（AT2G36490.1），下載基因相應的蛋白質序列，在茄科植物基因組數(shù)據庫（https：// solgenomics.net/marker/SGN-M8338/details）選擇辣椒基因組蛋白質序列庫（Zunla v2.0）進行BLASTP比對。利用ProtParam（http：//web.expasy. org/protparam/）對甲基化修飾酶基因進行理化性質分析，預測等電點。

1.2.2? 基因定位及結構分析 ?從辣椒基因組網站獲取DNA甲基化基因所在的染色體位置及染色體大小，利用MapChart 2.2制作染色體定位圖。同時從數(shù)據庫下載基因的DNA和cDNA序列，利用在線工具GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu. cn/）對甲基化修飾酶基因的結構進行展示。利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/）在線分析軟件分析蛋白質中的保守結構域。

1.2.3? 構建系統(tǒng)進化樹? 為研究DNA甲基化修飾酶基因的進化關系，從NCBI分別下載馬鈴薯、番茄等物種中相應基因的蛋白質序列，采用MEGA-X軟件內置的Clustal W軟件對蛋白序列進行多重比對，默認軟件本身參數(shù)設置。使用鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構建系統(tǒng)進化樹，并對構建的系統(tǒng)進化樹進行自檢，bootstrap值設為1000。

1.2.4? 組織特異性表達特征分析? 利用辣椒基因組測序中獲得的轉錄組數(shù)據集，分析辣椒甲基化修飾酶基因的表達特征，其中包含‘遵辣1號’辣椒不同組織（根、莖、葉、花和不同時期的果實等）所有注釋基因的表達數(shù)據。轉錄本豐度用 FPKM（fragments per kilo bases per million reads）值表示。家族成員在不同組織中的FPKM值，取對數(shù)（logFPKM）進行轉換，用TBtools繪制表達量熱圖。

1.2.5? RNA提取與qPCR表達分析? 采用試劑盒（華越洋）提取組織RNA。用1.5%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，同時用核酸蛋白儀測定RNA的濃度。反轉錄合成cDNA并以此為模板，在CFX96 Connect實時定量PCR分析儀（Bio-Rad）上進行基因表達分析。擴增體系為25?μL：其中含100 ng/μL cDNA 2?μL，上下游引物（0.2 μmol/L）各0.5 μL，TB Green Ex Taq（TaKaRa公司）12.5?μL，ddHO 9.5?μL，擴增程序為：95℃預變性30?s;95℃變性5?s，60℃退火30?s，40個循環(huán)。用2法計算基因相對表達量，所得數(shù)據運用Origin軟件作圖。本研究所用qPCR引物見表1。

? 結果與分析

? 辣椒甲基化修飾酶基因的鑒定與分布

通過序列比對并去除重復，在‘遵辣1號’基因組中共鑒定獲得14個DNA甲基化修飾酶基因（表2），包括10個DNA甲基轉移酶基因和4個DNA去甲基化酶基因，分別是2個MET基因（和），3個CMT基因（、和），4個DRM基因（、CaDRM1-like1、和）和1個DNMT2基因（），

2個DME和DML基因（和）和2個ROS1基因（和）。這些基因編碼蛋白質的氨基酸長度范圍為294～2037?aa，CDS序列長度為885～5835?bp，等電點在4.77～9.41之間。從基因在染色體上的分布看，除6號和11號染色體外，其余10條染色體均有分布（圖1）。14個基因中有3個分布在12號染色體中，2個分布在1號染色體上，2個分布在10號染色體上，其余均單獨分布在2號、3號、4號、5號、7號、8號和9號染色體上。

?辣椒甲基化修飾酶基因的結構分析

利用GSDS 2.0和MEME結構域在線分析工具，得到辣椒甲基化修飾酶基因的結構和蛋白質Motif分析的分布圖（圖2、圖3）。圖2展示了基因的內含子與外顯子，其中含有21個外顯子，而僅有1個外顯子。通過分析預測辣椒DNA甲基化修飾酶基因編碼蛋白中的保守結構域可知，關系較近的基因擁有的保守域基本一致。如和同時包含motif2、moti4、motif5和motif9;和共同擁有motif2、moti4和motif9;而motif7和motif8僅在DRMs中出現(xiàn)，motif1、motif3、motif6和motif10僅在DNA去甲基化酶基因（和）中出現(xiàn)（圖3）。保守motif的分布預示著辣椒的這些甲基化修飾酶基因進化過程相對保守。

? 辣椒甲基化修飾酶基因的系統(tǒng)進化分析

為探究辣椒和其他物種DNA甲基化修飾酶基因的同源進化關系，以擬南芥、辣椒、番茄和馬鈴薯中DNA甲基化修飾酶基因編碼的蛋白質序列為材料，利用MEGA-X構建系統(tǒng)進化樹（圖4）。結果顯示，辣椒基因組中的DNA甲基化修飾相關酶基因與擬南芥中該基因家族的分類結果一致。首先可將DNA甲基化修飾相關酶基因分為兩大類，即I類DNA甲基轉移酶基因和II類DNA去甲基化酶基因。DNA甲基轉移酶基因家族可分為a、b、c和d四個亞家族，分別為DRMs、DNMT2、MET1和CMT3。DNMT2亞家族中的成員最少，僅包含1個基因（），CMT3亞家族中包含3個辣椒CMT基因。DRMs亞家族中成員最豐富，包含4個辣椒DRM基因。在同科的馬鈴薯和番茄中，幾乎都能找到辣椒DNA甲基化修飾相關酶基因對應的同源基因。

? 辣椒甲基化修飾酶基因在不同組織的時空表達模式分析

利用辣椒不同組織（包括根、莖、葉、花蕾、花、不同發(fā)育時期的果實）RNA-Seq數(shù)據庫中辣椒DNA甲基化修飾酶基因對應轉錄本的FPKM值，繪制基因表達熱圖（圖5）。結果顯示，和在辣椒所有組織的表達量均很低，特別是，幾乎在辣椒所有組織中均不表達;而和在所有組織中表達量均較高，特別是，在根、莖和葉中的表達量均是最高的。在花蕾中，和表達量最高，而在開放的花中，、和表達量居前三。

本研究詳細分析了相關基因在辣椒果實發(fā)育與成熟過程中的表達情況。結果顯示，除幾乎不表達外，其他基因呈現(xiàn)不同的表達模式。在果實膨大過程中（F-Dev1～F-Dev5），和表達量一直較高，隨著果實的發(fā)育，、CaMET1-like和的表達量逐步升高，在綠熟期前后達到最大值;與之相反，隨著果實的發(fā)育，、和的表達量逐步降低，在綠熟期前后達到最小值。在果實成熟（變色轉紅，F(xiàn)-Dev5～F- Dev9）過程中，、、和均表現(xiàn)出逐步下調的趨勢，在完全成熟的果實中表達量達到最低值。

? 辣椒甲基化修飾酶基因在高溫脅迫下的時空表達模式分析

對高溫脅迫處理下基因的表達模式進行qPCR驗證（圖6），結果顯示，在高溫脅迫處理后，基因表達呈現(xiàn)不同的變化趨勢。其中，和受高溫脅迫表達量顯著降低，分別在3 h和6 h達到顯著差異。有9個基因呈現(xiàn)先上升后降低再上升的規(guī)律。處理后3?h，除外，另外8個基因相比于其他時期表達量最突出。其中表達量變化最顯著的是與對照相比其表達量上調8倍，變化量最不明顯的是，上調不到1倍。和在處理12?h后，表達量出現(xiàn)峰值，分別上調11倍和25倍。DNA甲基化修飾酶基因的表達量隨高溫脅迫呈現(xiàn)不同的變化趨勢，推測這些基因在辣椒響應高溫脅迫過程中具有一定的調控作用。

?辣椒甲基化修飾酶基因在鹽脅迫下的時空表達模式分析

對鹽脅迫下的13個基因進行qPCR驗證，結果見圖7。13個基因在鹽脅迫后12 h內的表達量發(fā)生顯著變化。和受鹽脅迫誘導表達，呈現(xiàn)逐步升高的趨勢，在12 h表達量達到最高，其中表達量差異變化最大的是，與對照相比上調9倍，變化最小的，與對照相比上調1.5倍。與之相反，、和在鹽脅迫處理后，表達量顯著降低。和呈現(xiàn)先抑制表達后誘導表達的趨勢。辣椒DNA甲基化修飾酶基因在鹽脅迫下呈現(xiàn)不同的表達模式，推測這些基因參與辣椒鹽脅迫響應誘導的機制可能不同。

? 討論

DNA甲基化是由甲基化修飾酶基因催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）上的甲基與基因組DNA上的胞嘧啶第5位碳原子進行共價結合，將其修飾為5-甲基胞嘧啶（5-mC）的過程。DNA甲基化修飾酶（包括DNA甲基轉移酶和DNA去甲基化酶）在調控甲基化與否和甲基化水平高低中起著非常重要的作用。DNA甲基化修飾酶家族的全基因組學鑒定已在擬南芥、水稻、玉米和番茄等多種植物中有過報道，部分基因如、在模式植物擬南芥和水稻中的功能也有一些深入研究。然而關于辣椒DNA甲基化修飾酶基因的研究還鮮見報道。因此，本研究基于已測序的辣椒基因組數(shù)據庫鑒定出DNA甲基轉移酶和DNA去甲基化酶基因家族成員，并通過全面的生物信息學分析和表達分析，為辣椒甲基化修飾酶基因的功能挖掘提供參考依據。

辣椒基因組中共包含10個DNA甲基轉移酶基因和4個DNA去甲基化酶基因，與同科的番茄、馬鈴薯中報道的基因數(shù)量一致，比花生基因組中報道的少，這一差異的發(fā)生可能因為不同物種間基因組大小和復制方式存在差異。一般來說，在系統(tǒng)進化樹上聚集在同一亞族的基因可能具有類似的功能。本研究對擬南芥、番茄、馬鈴薯和辣椒的甲基化修飾酶基因進行系統(tǒng)進化關系分析，辣椒DNA甲基化修飾酶基因家族可分為a、b、c和d四個亞家族，分別為DRMs、DNMT2、MET1和CMT3，分類結果與前人在擬南芥中的報道一致。說明辣椒DNA甲基化轉移酶基因家族進化相對保守。

基因的組織特性表達特征一定程度上與基因的功能密切相關。已有研究結果表明，DNA甲基化修飾酶基因在植物不同組織和不同發(fā)育時期的果實表現(xiàn)出特異性表達。如柑橘在幼苗和嫩葉中偏好表達，番茄中的在幼嫩組織中表達量高。番茄中4個DNA去甲基化酶基因（～），在所有組織中的表達量極低，和在葉片、

花和幼果中表達量高，并均隨器官發(fā)育成熟，表達量降低;隨果實發(fā)育與成熟，從轉色期開始的表達量極顯著升高，在橙色果實中表達量最高。本研究發(fā)現(xiàn)，在辣椒莖和根組織中的相對表達量最高，和在辣椒花蕾組織中相對表達量高于其他基因，推測其在花蕾發(fā)育中發(fā)揮促進作用。辣椒果實發(fā)育過程中，隨著果實的發(fā)育，、和的表達量逐步升高，在綠熟期前后達到最大值，反方，隨著果實的發(fā)育，、和 的表達量逐步降低，在綠熟期前后達到最小值，推測他們參與了辣椒果實發(fā)育與成熟過程的調控。另外，對柑橘果實發(fā)育與成熟過程的甲基化組學分析表明，柑橘果實發(fā)育與成熟過程伴隨DNA甲基化水平的升高，DNA去甲基化酶基因表達量降低，最終激活ABA信號基因的表達觸發(fā)了柑橘果實的成熟。今后也可對辣椒果實發(fā)育過程中的甲基化組進行分析，有利于更深入地解析DNA甲基化在辣椒果實發(fā)育中的調控作用。

當植物遭受非生物脅迫時，其體內的DNA甲基化會迅速發(fā)生動態(tài)變化，從而調控相關脅迫應答基因的表達，實現(xiàn)植物對非生物脅迫的快速響應。而DNA甲基化修飾酶基因也會響應脅迫應答，基因的表達量發(fā)生變化。如玉米中的、、和在干旱和鹽脅迫下表達量顯著下調，而、、和的表達不受干旱和鹽脅迫誘導。在低溫脅迫下，番茄和的表達明顯受到抑制;而在鹽脅迫下，的表達量顯著升高，在4?h達到峰值，在12?h后表達量增加了13倍，而和的表達幾乎不受鹽脅迫影響。茶樹中6個DNA甲基轉移酶基因，包括、、、、和在冷脅迫下均顯著下調，干旱脅迫下，、、和在12?h表達量顯著降低，而、和等基因顯著上調表達。石斛基因組中DNA甲基轉移酶和DNA去甲基化酶基因的表達也受冷脅迫和干旱脅迫誘導或抑制，呈現(xiàn)不同的表達特性。本研究分析了辣椒DNA甲基化修飾酶基因在高溫（42℃處理）和鹽（200?mmol/L NaCl）脅迫下基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)和受高溫脅迫表達量顯著降低，同時、和等表達量顯著上調，研究結果與在茶樹中的研究一致。在鹽脅迫下，有的基因如和的表達量逐步升高，有的基因如、和的表達量顯著降低。也有一些基因如和呈現(xiàn)先抑制表達后誘導表達的趨勢。辣椒DNA甲基化修飾酶基因在鹽脅迫下呈現(xiàn)不同的表達模式，推測這些基因參與辣椒鹽脅迫響應誘導的機制可能不同。本研究結果為進一步揭示辣椒甲基化修飾酶基因的功能提供了參考依據。

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收稿日期 2021-07-20;修回日期 2021-08-16

基金項目 國家自然科學基金項目（No. 32072598，No. 31672162）;廣東省普通高校特色創(chuàng)新項目（No. 2018KTSCX099）。

作者簡介 張 穎（1996—），女，碩士研究生，研究方向：茄果類蔬菜遺傳育種及分子生物學。*通信作者（Corresponding

author）：吳智明（WU Zhiming），E-mail：wuzm2012@zhku.edu.cn。