白木香轉(zhuǎn)錄因子AsMYB1和AsMYB2克隆及表達分析

馮瑩瑩　董先娟　劉曉　閆雅如　王金鈴　史社坡++王曉暉　屠鵬飛

[摘要] MYB類轉(zhuǎn)錄因子是數(shù)量最多、功能最多樣化的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。該研究根據(jù)白木香轉(zhuǎn)錄組高通量測序結(jié)果設(shè)計引物擴增白木香中MYB基因，利用RTPCR技術(shù)從白木香中首次克隆得到2個MYB基因cDNA 全長，分別命名為AsMYB1，AsMYB2，并對MYB蛋白質(zhì)進行跨膜結(jié)構(gòu)分析和聚類分析，預(yù)測其生物學(xué)信息；利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測 AsMYB基因在不同組織， 及在NaCl、低溫（4 ℃）、重金屬（CdCl2）、干旱（甘露醇）4種非生物脅迫和脫落酸、水楊酸、赤霉素、茉莉酸甲酯4種外源激素處理下的表達差異。該研究中克隆獲得的AsMYB1基因全長1 063 bp，編碼353個氨基酸；AsMYB2基因全長1 081 bp，編碼359個氨基酸。2個基因具有組織表達特異性；AsMYB1，AsMYB2 基因的轉(zhuǎn)錄水平受到不同生物脅迫和外源激素的影響，說明MYB基因?qū)Π啄鞠惴烙磻?yīng)和激素信號傳導(dǎo)具有重要的作用。

[關(guān)鍵詞] 白木香； MYB基因； 表達分析； 非生物脅迫； 激素處理

Cloning and expression analysis of transcription factor AsMYB1 and

AsMYB2 from Aquilaria sinensis

FENG Yingying， DONG Xianjuan， LIU Xiao， YAN Yaru， WANG Jinling， SHI Shepo， WANG Xiaohui*， TU Pengfei*

（Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine， School of Chinese Materia Medica，

Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

[Abstract] The MYB gene family comprises one of the richest groups of transcription factors in plants. The full length of two MYB genes were isolated through heterologous screening of Aquilaria sinensis calli transcriptome data， and the reverse transcription PCR was performed to obstain the corrected MYB clones， named AsMYB1， AsMYB2. The MYB transmembrane domain and phylogenetic analysis were predicted by different software to analyze the bioinformatics of MYB proteins. The transcript level of AsMYB1， AsMYB2 was performed by realtime quantitative RTPCR in different tissues and in responds to abiotic stresses including salt， cold， metal and drought stress， and hormone treatments including abscisic acid （ABA）， salicylic acid （SA）， gibberellins （GA3） and methyl jasmonate （MeJA） treatment. The AsMYB1 cDNA sequence had an ORF of 1 063 nucleotides， encoding a protein of 353 amino acids. The largest AsMYB2 ORF was 1 081 nucleotides， and its predicted translation products consisted of 359 amino acids. Two MYB genes had a tissuesspecific pattern in A. sinensis. Moreover， the expression level of AsMYB1 and AsMYB2 was regulated by different abiotic stresses and hormone treatments， suggesting the transcription factors AsMYB1 and AsMYB2 play an important role in plant defense and hormone signal transduction in A. sinensis.

[Key words] Aquilaria sinensis； MYB transcription factor； expression analysis； abiotic stress； hormone treatment

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor， TF）也稱反式作用因子，是一類能夠與基因啟動子區(qū)域中順式作用元件、沉默子或增強子發(fā)生特異性結(jié)合并相互作用，從而激活或者抑制目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA結(jié)合蛋白。DNA 結(jié)合區(qū)域的特點可將轉(zhuǎn)錄因子分為若干個家族，其中，MYB（myeloblastosis）轉(zhuǎn)錄因子蛋白是包含 MYB 結(jié)構(gòu)域且數(shù)量眾多、功能多樣的一類蛋白家族成員[1]，它們在植物的生長發(fā)育、次生代謝、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物的非生物脅迫反應(yīng)中起到重要的作用。對MYB基因克隆和功能進行研究，有利于豐富植物的防御反應(yīng)機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究。endprint

白木香Aquilaria sinensis（Lour.） Gilg又名土沉香，為瑞香科沉香屬植物， 是我國生產(chǎn)名貴芳香類藥材沉香的唯一正品植物來源，現(xiàn)已被列為國家二級瀕危保護植物。白木香的主要產(chǎn)地為廣東、海南、廣西、福建等省區(qū)[2]。沉香是白木香含有黑色樹脂的的木材，具有行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘的功效，可用于治療胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急[3]。白木香在健康狀態(tài)下不能夠結(jié)香，而受到自然因素（雷劈、火燒、微生物入侵等）或人為因素（砍傷、打洞、接菌等）的作用漸漸形成沉香，但是物理傷害和化學(xué)傷害誘導(dǎo)沉香形成的分子機制一直沒有清晰揭示，嚴(yán)重制約了高效結(jié)香技術(shù)的建立[4]。植物在感受逆境脅迫時，通過一系列轉(zhuǎn)錄因子及其他順式作用因子的協(xié)同作用，使植株體內(nèi)發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)，從而抵御或減輕不良環(huán)境造成的危害[5]。而MYB 轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于高等植物中，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，因此研究MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與表達可為白木香結(jié)香機制和植物防御機制的闡明奠定基礎(chǔ)。本研究利用RTPCR技術(shù)，從白木香愈傷組織中成功獲得了2個MYB基因的全長序列；利用實時熒光定量PCR檢測2個MYB基因在不同組織及NaCl、低溫（4 ℃）、重金屬（CdCl2）、干旱（甘露醇）4種非生物脅迫和脫落酸（abscisic acid，ABA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、赤霉素（gibberellin，GA3）、茉莉酸甲酯（methyl Jasmonate，MeJA）4種外源激素處理下的表達差異，對進一步研究沉香結(jié)香機制及豐富植物的防御反應(yīng)機制有十分重要的意義。

1 材料

利用北京中醫(yī)藥大學(xué)栽培的白木香葉誘導(dǎo)的愈傷組織，用于提取總RNA及cDNA的合成。將愈傷組織進行NaCl、低溫（4 ℃）、重金屬（CdCl2）、干旱（甘露醇）4種脅迫和脫落酸、水楊酸、赤霉素、茉莉酸甲酯4種激素處理，分別于處理后的0，12，24，36，48 h取樣，提取總RNA， 檢測AsMYB1，AsMYB2基因在各種處理下的表達差異。

2 方法

2.1 白木香總RNA的提取和cDNA的合成

利用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒（Aidla，中國）進行植物總RNA提取，利用NanoDrop 2000C 檢測RNA濃度，同時利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性和質(zhì)量。利用Sigma公司的反轉(zhuǎn)錄酶MMLV 將白木香的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為第一鏈（cDNA），反轉(zhuǎn)錄的條件按照說明書進行。

2.2 MYB基因序列全長克隆

根據(jù)白木香轉(zhuǎn)錄組高通量測序結(jié)果設(shè)計引物，引物序列見表1。以白木香總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，按照下列體系對白木香中MYB基因進行擴增：cDNA 1 μL，10×LATaq buffer 5 μL，dNTP Mix （2.5 mmol·L-1 ） 4 μL，LATaq（2.5 U· μL-1） 0.5 μL，10 μmol引物各1 μL，終體積為50 μL。反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性5 min；然后進行30個循環(huán)，94 ℃ 1 min，47 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，程序循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸反應(yīng)10 mim，4 ℃保存。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠回收。將回收后的PCR產(chǎn)物與pMD19T連接，轉(zhuǎn)化到DH5α菌株，在氨芐抗性的平板上進行篩選，并經(jīng)過菌落PCR檢測后送上海英濰捷基公司測序。

2.3 白木香MYB蛋白的生物信息學(xué)分析

通過在線軟件 ProtParam 預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)，分析目的基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、理論等電點及穩(wěn)定性等參數(shù)；利用軟件 TMHMM 2.0 進行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析；將所獲得的AsMYB1和AsMYB2基因編碼的氨基酸序列在 GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行 Blast P 對比分析，利用 DNAMAN 對其他物種的MYB基因編碼的氨基酸序列進行同源性分析；通過MEGA6.05軟件構(gòu)建 Neighborjoining系統(tǒng)進化樹，進化距離的計算采用泊松校正法，Bootstrap 重復(fù)次數(shù)為1 000次。

2.4 白木香AsMYB1和AsMYB2在不同組織、脅迫及激素下的表達分析

選取長勢相同的白木香愈傷組織，分別經(jīng)NaCl（150 mmol·L-1）、低溫（4 ℃）、CdCl2（500 μmol·L-1）、甘露醇（750 mmol·L-1）4種非生物脅迫及ABA（150 μmol·L-1），MeJA（150 μmol·L-1），GA3（150 μmol·L-1），SA（150 μmol·L-1）4種外源激素處理，在處理12，24，36，48 h提取RNA作為樣品，以未處理的愈傷組織作為對照。同時提取白木香不同組織的RNA 作為樣品。

利用實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR， qRTPCR）的方法檢測白木香在不同處理下不同時間的表達情況。分析使用SYBR Green I熒光染料法，在qRTPCR儀上進行。選取白木香GAPDH基因作為目標(biāo)基因定量表達的內(nèi)參基因，引物序列見表1。反應(yīng)體系：TransStart Top Green qPCR Super Mix 5 μL， 上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，模板0.5 μL（50 mg·L-1），補充ddH2O至10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火/延伸30 s（每次循環(huán)后采集熒光），40個循環(huán)后，95 ℃變性10 s，65～95 ℃做溶解曲線分析，每個溫度以每步0.5 ℃上升，每個溫度停留5 s。實驗數(shù)據(jù)通過Excel進行分析，采用2-ΔΔCt法計算獲得AsMYB1，AsMYB2基因的相對表達量。

3 結(jié)果與分析endprint

3.1 白木香AsMYB1和AsMYB2基因全長cDNA的克隆

根據(jù)白木香愈傷組織轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，以白木香愈傷組織的cDNA為模板進行擴增，利用PCR方法擴增得到2條約1 200 bp的條帶，見圖1。將其連接到pMD19T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測序結(jié)果經(jīng)過NCBI的BLAST比對，確定2個擴增產(chǎn)物是MYB基因的全長，2個基因分別命名為AsMYB1，AsMYB2。

MYB轉(zhuǎn)錄因子以其N端特有的MYB保守結(jié)構(gòu)域而得名，MYB 結(jié)構(gòu)域是一段約51～52個氨基酸的肽段，由一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列組成，每個MYB結(jié)構(gòu)域折疊成螺旋轉(zhuǎn)角螺旋M.Marker； 1.AsMYB1基因的擴增片段； 2.AsMYB2基因的擴增片段。

空間結(jié)構(gòu)，其中含有3個色氨酸殘基，這3個殘基被18～19個氨基酸殘基隔開，起著疏水核心的作用[6]。MYB 轉(zhuǎn)錄因子一般由3個保守的功能域組成：1個 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，1個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，以及1個不完全界定的負調(diào)節(jié)區(qū)[7]。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子中 MYB 結(jié)構(gòu)域數(shù)量的不同，MYB家族可劃分為不同的亞家族，即R1MYB（單一MYB結(jié)構(gòu)域），R2R3MYB（2個重復(fù)MYB結(jié)構(gòu)域），R1R2R3MYB（3個重復(fù)MYB結(jié)構(gòu)域）及4RMYB（4個MYB結(jié)構(gòu)域）[8]。

AsMYB1基因全長1 063 bp，編碼353個氨基酸，具有1個鋅指結(jié)構(gòu)（1～20位氨基酸），具有1個MYB結(jié)構(gòu)域（75～156位氨基酸），屬于R1MYB；AsMYB2基因全長1 081 bp，編碼359個氨基酸，具有2個MYB結(jié)構(gòu)域R2（102～142位氨基酸）和R3（143～179位氨基酸），屬于R2R3MYB。

3.2 AsMYB1，AsMYB2的生物學(xué)信息分析

3.2.1 AsMYB1，AsMYB2蛋白結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)域分析 通過ProtParam 軟件預(yù)測AsMYB1，AsMYB2基因編碼的蛋白的理化性質(zhì)。推測AsMYB1編碼的蛋白分子式為C1690H2653N493O532S15，相對分子質(zhì)量為38 870.54，理論等電點為8.17，不穩(wěn)定系數(shù)Ⅱ為64.99，屬于不穩(wěn)定蛋白，總平均親水性 GRAVY為-0.692，為親水性蛋白；AsMYB2編碼的蛋白分子式為C1683H2677N513O537S18，相對分子質(zhì)量為39 266.96，理論等電點為9.03，不穩(wěn)定系數(shù)Ⅱ為51.69，屬于不穩(wěn)定蛋白，總平均親水性 GRAVY 為-0.563，為親水性蛋白。利用TMHMM 2.0預(yù)測白木香AsMYB1，AsMYB2的跨膜區(qū)域，預(yù)測結(jié)果表明AsMYB1和AsMYB2均沒有跨膜區(qū)域。

3.2.2 AsMYB1，AsMYB2分子系統(tǒng)進化分析 將白木香AsMYB1，AsMYB2氨基酸序列與GenBank 中其他植物中的不同MYB 氨基酸序列進行比對，通過 DNAMAN 軟件與多種植物進行比對分析，見圖2。比對結(jié)果表明AsMYB1氨基酸序列與木本棉Gossypium arboreu、苜蓿Medicago truncatula的同源性分別為69.30%，61.73%；而AsMYB2氨基酸序列與可可Theobroma cacao、陸地棉G. hirsutum的同源性分別為50.37%，46.93%；說明AsMYB1，AsMYB2基因在進化過程中有一定程度的保守性。

通過進化樹構(gòu)建軟件MEGA 6.05，采用相鄰連接法構(gòu)建MYB進化樹，進行MYB的聚類分析。通過軟件構(gòu)建的進化樹，結(jié)果表明AsMYB1，AsMYB2蛋白氨基酸序列具有一定程度的相似性，與大豆MYB62、苜蓿MYB52等相似性相對較高，見圖3。

3.3 AsMYB1和AsMYB2的組織表達特異性分析

利用實時熒光定量 PCR 檢測AsMYB1，AsMYB2基因的表達特異性，研究結(jié)果表明AsMYB1基因在根中的表達量最多，其次是莖和葉。AsMYB2基因在葉中的表達量最多，其次是根和莖，見圖4。說明AsMYB1，AsMYB2基因分別主要在根和葉中發(fā)揮生物學(xué)功能，推測AsMYB1和AsMYB2基因分別在白木香的根和葉起到重要作用。

3.4 AsMYB1和AsMYB2基因在非生物脅迫處理下不同時間的表達分析

以前的研究表明，MYB家族在非生物脅迫中起到重要的作用，但是關(guān)于白木香中MYB在植物防御反應(yīng)中的作用目前沒有研究。為研究白木香愈傷組織中基因AsMYB1，AsMYB2是否對鹽、低溫、重金屬及干旱脅迫響應(yīng)，將白木香愈傷組織分別經(jīng)過NaCl、低溫、CdCl2、甘露醇處理，利用實時熒光定量PCR檢測AsMYB1，AsMYB2基因的表達差異。AsMYB1的表達水平在鹽脅迫和低溫脅迫下顯著升高，分別在24，48 h達到最高；重金屬脅迫（CdCl2）則使AsMYB1的表達水平在48 h內(nèi)逐漸降低；在甘露醇處理下，AsMYB1的表達水平在12 h降到最低，之后逐漸升高，在36 h 內(nèi)達到最高，隨后降低。

AsMYB2的表達水平在鹽脅迫條件下，表達水平顯著上升，有趣的是，AsMYB2的表達水平在鹽脅迫誘導(dǎo)下出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，12 h 表達達到最高，24 h降低，而36 h又顯著上升，之后降低；AsMYB2的表達水平在愈傷組織受到低溫處理時顯著降低；CdCl2處理則使AsMYB2 的表達水平在36 h內(nèi)持續(xù)下降，隨后上升；甘露醇處理使AsMYB2 的表達水平在12 h降低，但是隨后迅速上升，在36 h表達水平達到最高，之后降低。這些實驗結(jié)果表明屬于不同MYB亞家族的AsMYB1 和AsMYB2 參與不同植物脅迫響應(yīng)，在植物防御反應(yīng)中起到重要的作用，見圖5。

3.5 AsMYB1和AsMYB2基因在外源激素處理下不同時間的表達分析

ABA，GA3，SA，MeJA 是植物中重要的信號分子，同時在植物防御反應(yīng)中起到重要作用。為研究AsMYB1，AsMYB2基因是否在植物信號傳遞的過程中起到重要的作用，將白木香的愈傷組織分別經(jīng)過ABA，SA，GA3，MeJA 4種外源激素的誘導(dǎo)，采用實時熒光定量 PCR 的方法對愈傷組織中在各激素處理下不同時間基因的表達量進行分析。AsMYB1在受到外源ABA，GA3處理后表達水平顯著上升，24 h 內(nèi)表達水平持續(xù)升高，之后逐漸降低；在外源SA 處理下，AsMYB1的表達水平在48 h內(nèi)持續(xù)升高，48 h的表達水平是0 h的8倍；另外，在外源的MeJA處理下，AsMYB1的表達水平在12 h略有上升，之后表達水平持續(xù)降低。在外源ABA 處理下，AsMYB2的表達水平在12 h顯著降低，之后表達水平逐漸上升；在SA激素處理下，AsMYB2的表達水平在24 h內(nèi)持續(xù)增高，24 h達到最高，之后隨時間的增加而表達量下降；在外源的GA3和MeJA 的處理下，AsMYB2 的表達趨勢一致，出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，誘導(dǎo)后12 h基因表達量顯著上升，24 h表達量下降，36 h表達量顯著上升達到最高，之后隨時間增加而表達量顯著下降。這些實驗結(jié)果表明AsMYB1，AsMYB2基因在白木香的信號傳遞及防御反應(yīng)中起到重要的作用，見圖6。endprint

4 討論

MYB轉(zhuǎn)錄因子是一類由多成員組成的超基因家族，其功能多樣并且廣泛參與植物的生長發(fā)育。已有的研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答逆境脅迫過程中扮演著非常重要的角色。在逆境脅迫下，MYB轉(zhuǎn)錄因子可與許多功能基因啟動子區(qū)中的 MYB 結(jié)合元件結(jié)合，從而激活脅迫應(yīng)答基因的表達[9]。在自然界中，只有當(dāng)沉香屬植物受到刺激或者損傷時，才會產(chǎn)生沉香[2]，說明沉香的產(chǎn)生機制與白木香的防御反應(yīng)密切相關(guān)。本研究首次從白木香的愈傷組織中擴增得到屬于不同亞家族的AsMYB1，AsMYB2基因全長，并對2個基因進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明從白木香愈傷組織擴增的AsMYB1，AsMYB2基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、理論等電點及穩(wěn)定性等很接近，兩者的理化性質(zhì)相似。AsMYB1，AsMYB2蛋白氨基酸序列的相似性僅為12.30%，二者相似性較低。AsMYB1氨基酸序列與木本棉G. arboreu、苜蓿M. truncatula MYB的同源性分別為69.30%，61.73%；AsMYB2氨基酸序列與可可Theobroma cacao、陸地棉G. hirsutum MYB的同源性分別為50.37%，46.93%；說明AsMYB1，AsMYB2在進化過程中有一定程度的保守性。通過聚類分析結(jié)果表明，AsMYB1，AsMYB2蛋白氨基酸序列分別與大豆MYB62、苜蓿MYB52等相似性相對較高。

已有研究表明，MYB 基因的表達具有組織特異性，在水稻和擬南芥中，大部分MYB基因主要在葉中表達[1011]，也有部分MYB基因主要在根中表達；白木香中MYB基因也具有表達特異性，AsMYB1主要在根中表達，AsMYB2則主要在葉中表達；說明AsMYB1，AsMYB2可能在不同組織重要的作用。

MYB 基因在植物非生物脅迫過程中起到重要作用；鹽、低溫、重金屬及干旱脅迫是自然界中最常見的非生物脅迫；已有報道表明擬南芥和水稻中部分MYB基因在鹽脅迫、干旱脅迫條件下能夠大量表達，也有部分MYB基因在鹽、干旱等條件下受到抑制，但是關(guān)于在低溫和重金屬脅迫下的MYB的表達水平研究較少[1012]。本研究表明，AsMYB1能夠在鹽脅迫和低溫脅迫誘導(dǎo)下能夠大量表達，但是重金屬脅迫和干旱脅迫則使AsMYB1基因表達受到抑制；AsMYB2能在鹽脅迫和干旱脅迫下表達量上升，而低溫和重金屬脅迫則使其表達水平受到抑制，這些實驗結(jié)果說明AsMYB1，AsMYB2在植物響應(yīng)脅迫中起到重要作用。MYB基因在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中也具有重要的作用。以前的研究表明油菜Brassica napus中BnaMYB78、黃芩Scutellaria baicalensis的SbMYB2，SbMYB7、擬南芥中AtMYB15表達水平受到ABA 的調(diào)控[1315]；小麥的TaMYB4基因的表達受到外源SA，ABA，MeJA的調(diào)控[16]；擬南芥中AtMYB62能夠參與GA3信號的傳遞[17]。因此本文中研究了AsMYB1，AsMYB2基因在外源激素ABA，SA，GA3，MeJA處理下的表達水平，實驗結(jié)果表明AsMYB1基因表達量在ABA，SA，GA3誘導(dǎo)下顯著上升，特別是外源GA3的誘導(dǎo)下AsMYB1基因表達量升高最多，外源MeJA對AsMYB1基因的影響不大；AsMYB2基因表達量在外源的GA3的誘導(dǎo)下大量表達，表達趨勢出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，同時AsMYB2基因也能夠被外源的SA和 MeJA誘導(dǎo)，其中AsMYB2基因在外源MeJA誘導(dǎo)下也出現(xiàn)雙峰趨勢；而在外源的ABA刺激下AsMYB2基因的表達水平受到抑制。這些實驗結(jié)果表明AsMYB1和AsMYB2基因的表達受到激素的影響，對植物體內(nèi)激素信號的傳導(dǎo)具有重要作用。因此AsMYB1和AsMYB2基因的生物信息學(xué)研究和表達分析有利于揭示白木香的防御機制，同時為白木香的結(jié)香機制研究奠定基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]endprint