杜梨bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族兩成員的序列特征及對非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)

李曉剛+李慧+楊青松+藺經(jīng)+常有宏

摘要： 為探索杜梨（Pyrus betulaefolia Bunge）bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的序列特征及表達特點，以8葉期杜梨幼苗為材料，克隆獲得2個bHLH轉(zhuǎn)錄因子bHLH122-1和bHLH122-2，采用qPCR方法研究它們在非生物脅迫下的表達情況。結(jié)果表明，bHLH122-1和bHLH122-2開放閱讀框為1 302 bp和1 251 bp，編碼的蛋白分別含433個和416個氨基酸殘基，分別與蘋果的MdbHLH122的同源性最高（83.49%和93.51%）。bHLH122-1和bHLH122-2主要在葉中表達，鹽、干旱以及滲透脅迫均能誘導(dǎo)PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的表達，但它們對ABA處理并無轉(zhuǎn)錄響應(yīng)。此外，PbbHLH122-2對上述逆境的應(yīng)答要早于PbbHLH122-1，而PbbHLH122-1的表達量大于PbbHLH122-1。綜上所述，bHLH122-1和bHLH122-2均參與杜梨葉片對非生物脅迫的防御機制，該機制不受ABA信號調(diào)控，并且PbbHLH122-1和PbbHLH122-2在逆境條件下發(fā)揮的作用可能略有不同。

關(guān)鍵詞： 杜梨；bHLH122轉(zhuǎn)錄因子；非生物脅迫；表達特征

中圖分類號： S661.201 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0040-06

bHLH（basic Helix-Loop-Helix，堿性-螺旋-環(huán)-螺旋）轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中廣泛存在的一大類轉(zhuǎn)錄因子，通過特定的氨基酸殘基與靶基因相互作用，進而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達[1]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員在植物中數(shù)量眾多，為僅次于MYB類轉(zhuǎn)錄因子的第二大基因家族[2]。例如，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組中為147個[3-4]，在水稻（Oryza sativa）中有167個[5]，菜豆中為155個[6]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物葉片花青素合成[7]、光周期對花期的調(diào)控[8]、果實的發(fā)育成熟[9-10]，以及缺鐵條件下根的應(yīng)激反應(yīng)[1，11]等多種生命活動。除此之外，研究表明bHLH基因家族中部分成員在植物適應(yīng)逆境過程中發(fā)揮重要作用，例如，擬南芥的AtbHLH122表達受干旱、高鹽、滲透等非生物脅迫強烈誘導(dǎo)，超量表達AtbHLH12可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的抗逆能力[12]；在野生稻（Oryza rufipogon）Dongxiang中過量表達OrbHLH001，可顯著提升植株耐鹽和耐寒能力[13]；分析菜豆155個bHLH轉(zhuǎn)錄因子在高鹽條件下的表達情況發(fā)現(xiàn)，其中16個基因在根部和葉片中的表達量均有顯著升高[6]。

杜梨（Pyrus betulaefolia Bunge）具備良好的耐旱、耐寒、耐澇等特性，為梨生產(chǎn)中廣泛選用的砧木之一，其抗逆分子機制已成為目前的研究熱點之一[14-17]，但bHLH轉(zhuǎn)錄因子在杜梨抗逆機制中的研究尚未見報道。本研究選取杜梨幼苗為材料，克隆獲得2條與擬南芥AtbHLH122同源的PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的DNA和cDNA序列，并用定量PCR分析2條基因在不同非生物脅迫條件下的表達情況，探明杜梨PbbHLH122-1和PbbHLH122-2對非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)，從而為進一步研究它們在杜梨逆境響應(yīng)過程中的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試杜梨的成熟種子采集于山東泰安，試驗所用材料為8葉齡杜梨幼苗。脫落酸（ABA）、氯化鈉（NaCl）、聚乙二醇（PEG-6000）和甘露醇（Mannitol）購自Sigma公司，RNA plant plus Reagent和Pfu DNA Polymerase購自天根生化科技（北京）有限公司，SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit、PowerScript ⅡTM反轉(zhuǎn)錄酶和SYBRPremix ExTaqTMⅡ購自寶生物工程（大連）有限公司，AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司，所有引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的克隆 取經(jīng) 100 mmol/L NaCl處理6 h的杜梨8葉齡幼苗，葉片總RNA 用RNA plant plus Reagent提取，基因組DNA采用CTAB法提取。按照PowerScript ⅡTM反轉(zhuǎn)錄酶和SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一 鏈。采用Liu等報道的在逆境處理中表達量顯著提高的擬南芥（Arabidopsis thaliana）轉(zhuǎn)錄因子（NCBI 登錄號：NP_564583.1） 作為模板[12]，通過tblastN方法在NCBI數(shù)據(jù)庫中（將Organism限定為Pyrus）搜索獲得2條與其高度同源的梨屬植物白梨（Pyrus×bretschneideri）基因LOC103967841和LOC103963544 。根據(jù)上述2條基因序列，分別設(shè)計引物 7841-F（5′-ATGGAATCGGATCTTCAGCAGCAT-3′）/7841-S（5′-CTACTGCTGCTTGTTTGAACAGGT-3′）和3544-F（5′-ATGGAATCAGATCATCAGCAGCAT-3′）/3544-S（5′-CTACTGCTGCTTGTTTGAGCAAGT-3′）用Pfu DNA Polymerase擴增編碼區(qū)的cDNA和DNA序列。PCR反應(yīng)體系為：buffer 2 μL、cDNA 2 μL上下游引物各0.8 μL、ddH2O 14.2 μL，Pfu DNA Polymerase 0.2 μL，總計20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR特異產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收，連接、轉(zhuǎn)化并PCR驗證陽性菌株后，送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行序列測定。endprint

1.2.2 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的生物信息學分析 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的核苷酸翻譯采用BioXM軟件，利用Gene StructureDisplay Server（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）分析內(nèi)含子和外顯子組成[18]。使用ExPaSy-ProtparamTool（http：//web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸基本理化特性。氨基酸序列比對采用DNAMAN軟件完成，Conserved Domains Search Service（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析保守域。用PSORT（http：//psort.ims.ut-okyo.ac.jp /form.html）進行亞細胞定位預(yù)測。MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD（http：//nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/jakj/dianzi/Bioinf7/Expasy/Expasy8.htm）預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測并繪制三維立體結(jié)構(gòu)。所用序列均來自NCBI（（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）。

1.2.3 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2表達研究 選擇長勢健壯、大小一致的杜梨8葉齡幼苗分別置于含100 mmol/L NaCl、10% PEG-6000、180 mmol/L Mannitol或20 μmol/L ABA的1/4改良MS營養(yǎng)液中，處理0、0.5、1、3、6、9、12 h后，分別收集葉片和根，保存于-70 ℃冰箱待用。以各處理或?qū)φ諛悠返? μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，利用PbbHLH122-1和PbbHLH122-2跨內(nèi)含子特異性引物 7841-E-F（5′-GAGCTTGTACCGAACATGGACAAG-3′）/7841-E-S（5′-CTACTGCTGCTTGTTTGAACAGG-3′）和 3544-E-F（5′-AGCTTGTACCAAACATGGACAAG-3′）/3544-E-S（5′-CTACTGCTGCTTGTTTGAGCAAG-3′），在Bio-rad熒光定量CFX96TM PCR儀進行實時定量PCR。選用PbActin基因引物qPBactS（5′-AACGGACATCAAGCCAAAAA AA-3′）/qPBactA（5′-CAGTTAGCACGCAATTCAGCCA-3′）為內(nèi)參。反應(yīng)體系為：SYBR熒光染料10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各0.8 μL、ddH2O 6.4 μL，總計20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 20 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。按照2-ΔΔCT法計算出待測基因相對表達量，應(yīng)用Excel 2003整理試驗數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2 基因特征

以經(jīng)100 mmol /L NaCl處理6 h的杜梨8葉齡幼苗葉片cDNA為模板，以7841-F/7841-S為引物，克隆獲得1條長度為1 302 bp的cDNA序列，編碼1條含有433個氨基酸的多肽，命名為PbbHLH122-1；以3544-F/3544-S為引物，克隆獲得1條長度為1 251 bp的cDNA序列，編碼1條含有416個氨基酸的多肽，命名為PbbHLH122-2。以DNA為模板，以7841-F/7841-S為引物，克隆獲得1條長度為 2 105 bp 的DNA序列；以3544-F/3544-S為引物，克隆獲得1條2 056 bp的DNA序列。對擴增得到的cDNA序列和對應(yīng)的DNA進行分析發(fā)現(xiàn)：PbbHLH122-1和PbbHLH122-2基因均由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成（圖1）。序列比對表明杜梨的PbbHLH122-1與白梨（Pyrus × bretschneideri）的

LOC103967841序列完全一致，而PbbHLH122-2與白梨的LOC103963544序列完全一致，因此不再登陸新的基因序列。

2.2 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的生物信息學特征

運用ExPaSy-Protparam Tool對PbbHLH122-1和PbbHLH122-2編碼蛋白的理化性質(zhì)進行了預(yù)測。PbbHLH122-1分子式C2 014H3 180N612O669S19，分子量 47.29 ku，預(yù)測的等電點（pI）為6.27，親水性為-0.775，表明此蛋白為親水性蛋白，脂溶性較差。PbbHLH122-2分子式C1 926H3 028N580O645S19，分子量45.23 ku，預(yù)測的等電點（pI）為5.86，親水性為-0.758，表明此蛋白為親水性蛋白，脂溶性較差。由表1可見，PbbHLH122-1和PbbHLH122-2所編碼的多肽相似性為84.63%。PbbHLH122-1和PbbHLH122-2分別與蘋果的MdbHLH122的同源性最高（83.49%和9351%）。利用DNAman對擬南芥（NP_564583）、蘋果（XP_008352410）、大豆（XP_003540708），芝麻（XP_015571362）、棗子（XP_015876019）的bHLH122基因編碼的蛋白進行多序列比對分析，發(fā)現(xiàn)PbbHLH122-1和PbbHLH122-2與擬南芥等其他植物的bHLH122轉(zhuǎn)錄因子在C端存在著明顯的保守區(qū)域。利用Conserved Domains Search Service（CD Search）對PbbHLH122-1和PbbHLH122-2進行保守結(jié)構(gòu)域的分析，PbbHLH122-1在C端366～417位氨基酸（PRSIAERV RRTRISERMRKLQELVPNMDKQTNTSDMLDLAVEYIKDLQTQV Q）存在1個HLH結(jié)構(gòu)域，而PbbHLH122-2在C端349～400位氨基酸（PRSIAERVRRTRISERMRKLQELVPNMDKQA HTSDMLDLAVE YIKDLQTQVQ）也存在1個HLH結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖2所示。endprint

系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，PbbHLH122-1和PbbHLH122-2與蘋果的MdbHLH122的親緣關(guān)系最近，與豆科的大豆以及苜蓿的bHLH122也處于同一個進化分支上，表明它們有較近的親緣關(guān)系（圖3）。二級結(jié)構(gòu)分析表明（圖4），PbbHLH122-1 中α螺旋占27.94%，無規(guī)則卷曲占68.59%，延伸鏈占 3.46%，而PbbHLH122-2中α螺旋占 30.53%，無規(guī)則卷曲占66.11%，延伸鏈占3.37%。PbbHLH122-1和PbbHLH122-2在C端均有明顯的連續(xù)α螺旋，與保守結(jié)構(gòu)域的分析完全一致。利用SWISS-MODEL自由匹配模板，預(yù)測擬南芥AtbHLH122、PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的C端保守域的3維結(jié)構(gòu)（圖5），可以看到三個蛋白C端保守域均含有1個螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，僅在“環(huán)”位置上有微小差異，根據(jù)結(jié)構(gòu)決定功能的原理，推測PbbHLH122-1和PbbHLH122-2與擬南芥AtbHLH122會有相似的功能。

2.3 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的表達特點

正常生長條件下，PbbHLH122-1和PbbHLH122-2在杜梨的根和葉中都有表達，其中葉中的相對表達量顯著高于根部，而PbbHLH122-1 的表達量略高于PbbHLH122-2（圖6）。鹽脅迫條件下，PbbHLH122-1 在6 h后達到表達高峰（圖7-A）， 而PbbHLH122-2 的表達高峰在1 h之后便已出

現(xiàn) （圖7-B）；PEG-6000模擬干旱脅迫條件下，PbbHLH122- 1直至12 h才出現(xiàn)表達高峰（圖7-C），而PbbHLH122-2 在 3 h 出現(xiàn)高峰（圖7-D）；甘露醇處理條件下，PbbHLH122-1 于處理9 h后出現(xiàn)表達高峰（圖7-E），而PbbHLH122-2 仍是在3 h就出現(xiàn)表達高峰（圖7-F）；ABA處理條件下，PbbHLH122-1和PbbHLH122-2 的表達量在12 h內(nèi)均無顯著變化（圖7-G、圖7-H）。綜上所述，鹽、干旱以及滲透脅迫均能提高PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的表達量，PbbHLH122-2的相對表達量雖然不及PbbHLH122-1，但是其[CM（25]到達表達峰值的時間均比PbbHLH122-1 早，由此表明，2 個基因在杜梨應(yīng)對非生物脅迫過程中所發(fā)揮的作用可能有所區(qū)別，并且它們所參與的信號途徑不受ABA調(diào)控。

3 討論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員蛋白質(zhì)C端都具有螺旋-環(huán)-螺旋的堿性保守功能域，該區(qū)域由2個含有疏水性氨基酸的偶極性α螺旋組成，第一個α螺旋也稱識別螺旋，與識別蛋白結(jié)合特異的DNA序列有關(guān)；第二個α螺旋位于第一個α螺旋之上，基本上平行于雙螺旋鏈，這種結(jié)構(gòu)有利于氫鍵形成和范德華力作用，對于DNA結(jié)合至關(guān)重要[19]。這2個bHLH蛋白通過結(jié)合到下游基因的啟動子上來調(diào)控下游基因的表達。本研究中克隆獲得的2個杜梨bHLH轉(zhuǎn)錄因子，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)它們所編碼的蛋白在C端都具有螺旋-環(huán)-螺旋保守功能域。然而，并不是所有的bHLH基因家族成員只[CM（25]在蛋白質(zhì)C端擁有保守結(jié)構(gòu)域，例如云南紅皮梨的1；個bHLH轉(zhuǎn)錄因子（HM622265） 除了在C端具有螺旋-環(huán)-螺旋保守功能域外，在N端也擁有bHLH-MYC保守結(jié)構(gòu)域[20]。不同的結(jié)構(gòu)決定不同的功能，云南紅皮梨bHLH轉(zhuǎn)錄因子（HM622265） 主要參與了果實成熟過程中對果皮著色的調(diào)控作用，而PbbHLH122-1和PbbHLH122-2 則極有可能只參與植株對逆境條件的響應(yīng)。

bHLH家族基因在逆境條件下被誘導(dǎo)表達的條件差異很大。例如，棉花的GhbHLH130 在逆境脅迫條件下，顯著受高鹽、干旱、ABA、低溫脅迫的迅速誘導(dǎo)，而GhbHLH1 能夠迅速響應(yīng)ABA處理和干旱脅迫，卻不受高鹽和低溫的影響[21]。本研究中，PbbHLH122-1和PbbHLH122-2 同源性為 84.63%，在C端都具有螺旋-環(huán)-螺旋保守功能域，表明其具有相似的功能，其表達規(guī)律也相似。然而，其在對逆境響應(yīng)的過程中仍然具有一些差異。在高鹽、干旱以及滲透脅迫條件下，PbbHLH122-2在1～3 h內(nèi)即可達到表達峰值，而PbbHLH122-1通常需要6～12 h才能達到表達峰值。然而，從表達量上來看，PbbHLH122-1在上述條件下的相對表達量要略高于PbbHLH122-2。由此表明，PbbHLH122-1和PbbHLH122-2在逆境條件下發(fā)揮的作用可能略有不同。

在植物中，轉(zhuǎn)錄信號的級聯(lián)在植物激素ABA和非生物脅迫的信號通路之間組成了一個復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)錄因子在其中發(fā)揮了重要作用[22-23]。然而，擬南芥中AtbHLH122顯著受高鹽、干旱和甘露醇的誘導(dǎo)，而ABA則不能誘導(dǎo)其表達，表明其可能直接調(diào)控逆境響應(yīng)基因，而并不是通過ABA代 謝途徑參與植株抗逆活動[12，24]。本研究中無論是PbbHLH122-1 還是PbbHLH122-2均對ABA脅迫無響應(yīng)，表明與AtbHLH122具有相似的功能特點。

[HS2][HT8.5H]參考文獻：

[1] Li X L，Zhang H M，Ai Q，et al. Two bHLH transcription factors，bHLH34 and bHLH104，regulate Iron homeostasis in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Physiology，2016，170（4）：2478-2493.

[2]Xu W D，Lepiniec L. Transcriptional control of flavonoid biosynthesis by MYB-bHLH-WDR complexes[J]. Trends in Plant Science，2015，20（3）：176-185.endprint

[3]Bailey，C P. Update on the basic helix-loop-helix transcription factor gene family in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell，2003，15（11）：2497-2501.

[4]Toledo-Ortiz G H，Quail P H. The Arabidopsis basic/helix-loop-helix transcription factor family[J]. Plant Cell，2003，15（8）：1749-1770.

[5]Li X X，Duan X P，Jiang H X，et al. Genome-wide analysis of basic/helix-loop-helix transcription factor family in rice and Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2006，141（4）：1167-1184.

[6]Kavas M，Baloglu M C，Atabay E S，et al. Genome-wide characterization and expression analysis of common bean bHLH transcription factors in response to excess salt concentration[J]. Molecular Genetics and Genomics，2016，291（1）：129-143.

[7]Outchkourov N S，Carollo C A，Gomez-Roldan V，et al. Control of anthocyanin and non-flavonoid compounds by anthocyanin-regulating MYB and bHLH transcription factors in Nicotiana benthamiana leaves[J]. Frontiers in Plant Science，2014，5：519.

[8]Ito S，Song Y H，Josephson-Day A R，et al. FLOWERING BHLH transcriptional activators control expression of the photoperiodic flowering regulator CONSTANS in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（9）：3582-3587.

[9]Tani E. The study of a SPATULA-like bHLH transcription factor expressed during peach（Prunus persica） fruit development[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2011，49（6）：654-663.

[10] Groszmann M P，Smyth D R. Functional domains of SPATULA，a bHLH transcription factor involved in carpel and fruit development in Arabidopsis[J]. Plant Journal，2008，55（1）：40-52.

[11]Ling H Q，Bauer P，Bereczky Z，et al. The tomato fer gene encoding a bHLH protein controls iron-uptake responses in roots[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99（21）：13938-13943.

[12]Liu W W，Tai H H，Li S S，et al. bHLH122 is important for drought and osmotic stress resistance in Arabidopsis and in the repression of ABA catabolism[J]. New Phytologist，2014，201（4）：1192-1204. [HJ1.76mm]

[13]Li F，Guo S Y，Zhao Y，et al. Overexpression of a homopeptide repeat-containing bHLH protein gene （OrbHLH001） from Dongxiang wild rice confers freezing and salt tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Cell Reports，2010，29（9）：977-986.

[14]王 宏. 耐鹽杜梨蛋白磷酸酶基因PbPP2C 的克隆及表達分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2014，30（6）：1464-1471.

[15]韓金龍. 杜梨CBL1和CBL7基因?qū)Ψ巧锬婢车捻憫?yīng)[J]. 果樹學報，2014（4）：529-535.

[16]李 慧. 杜梨PbPEAMT的克隆、序列分析及表達特征[J]. 植物生理學報，2012（5）：449-455.

[17]李 慧，叢 郁，常有宏，等. 杜梨CPI基因的克隆、序列分析及表達[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2011，27（5）：1070-1077.

[18]Hu B，Jin J P，Guo A Y，et al. GSDS 2.0：an upgraded gene feature visualization server[J]. Bioinformatics，2015，31（8）：1296-1297.

[19]Ding W N，Yu Z M，Tong Y L，et al. A transcription factor with a bHLH domain regulates root hair development in rice[J]. Cell Research，2009，19（11）：1309-1311.

[20]孟富宣，周 軍，辛培堯，等. 云南紅皮梨bHLH轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學分析[J]. 基因組學與應(yīng)用生物學，2013（5）：652-659.

[21]光楊其，宋桂成，張金鳳，等. 1個新棉花bHLH類基因GhbHLH130 的克隆及表達分析[J]. 棉花學報，2014，26（4）：363-370.

[22]許園園，李曉剛，李 慧，等. 梨CDPK基因家族全基因組序列鑒定分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2015，31（3）：659-666.

[23]田 鵬，蘇艷麗，康保珊，等. 兩個紅梨品種花色苷合成相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子MYB10表達模式分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2015，31（1）：166-171.

[24]劉文文. bHLH122提高植物抗逆能力的分子機制初探[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2013.endprint