廣西香蕉根系內(nèi)生真菌的群落組成與多樣性

陳艷露　謝玲　劉斌　曾鳳花　廖仕同　張艷

摘? 要：本研究對廣西香蕉主產(chǎn)區(qū)的香蕉根系樣本進(jìn)行內(nèi)生真菌分離，采用形態(tài)學(xué)與ITS序列分析相結(jié)合的方法進(jìn)行菌株鑒定，開展其物種組成與多樣性分析，對了解廣西香蕉與其根部內(nèi)生真菌間的關(guān)系以及探索其內(nèi)生真菌功能具有重要意義。從168個(gè)香蕉根段中共分離獲得352株內(nèi)生真菌，分別歸屬于5綱17目34科43屬62個(gè)分類單元，不同分類單元的代表菌株中，有41株菌株能夠產(chǎn)生分生孢子（66.13%）。其中，優(yōu)勢綱為糞殼菌綱（Sordariomycetes）和散囊菌綱（Eurotiomycetes），相對頻率（RF）分別為66.19%和20.45%;優(yōu)勢目為肉座菌目（Hypocreales）、散囊菌目（Eurotiales）和格孢腔菌目（Pleosporales），相對頻率分別為55.4%、17.61%和9.66%;優(yōu)勢屬為鐮刀菌屬（）、青霉屬（）、木霉屬（）、未鑒定屬3、帚枝霉屬（）、未鑒定屬2、彎孢屬（）和突臍蠕孢屬（），相對頻率分別為32.39%、15.06%、13.35%、5.11%、3.98%、3.41%、3.13%和2.84%，后5個(gè)屬的相對頻率未超過10%，其優(yōu)勢不明顯。多樣性指數(shù)和均勻度系數(shù)結(jié)果表明，南寧地區(qū)壇洛鎮(zhèn)TL2樣地和鑼圩鎮(zhèn)LX樣地的香蕉根系內(nèi)生真菌種群多樣性較豐富，群落分布較均勻。相似度系數(shù)分析顯示，欽州地區(qū)大成鎮(zhèn)2個(gè)樣地（DC1、DC2）間香蕉根系內(nèi)生真菌種群組成相似度最高（=0.67）。不同采樣點(diǎn)的地理環(huán)境和氣候條件給香蕉提供了不同的生境，是影響香蕉根系內(nèi)生真菌種類組成及多樣性差異的主要因素之一。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌;形態(tài)特征;系統(tǒng)發(fā)育分析;多樣性指數(shù)

中圖分類號(hào)：S668.1??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Community Composition and Diversity of Endophytic Fungi in Banana Root in Guangxi

CHEN Yanlu XIE Ling ?LIU Bin ?ZENG Fenghua ?LIAO Shitong ZHANG Yan

1. Institute of Applied Microbiology， College of Agriculture， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China; 2. Institute of Plant Protection Research， Guangxi Academy of Agricultural Sciences / Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests， Nanning， Guangxi 530007， China

Endophytic fungi were isolated from banana roots in main banana producing areas of Guangxi using the routine tissue isolation method. The endophytic fungi strains were identified based on morphology combined with phylogenetic analysis of ITS sequence. The analysis of composition and diversity of endophytic fungi associated with banana roots in Guangxi is of great significance in studying symbiotic relationship between banana and endophytic fungi and exploring function development of endophytic fungi in banana roots. A total of 352 isolates of culturable endophytic fungi were obtained from 168 tissues of banana roots collected from 7 sampling sites， and they were classified as 62 taxa. The identifiable taxa belonged to 3 phylums （Ascomycota， Basidiomycota and Zygomycota） with 5 classes， represented by 17 orders with 43 genera. Observation of colony morphology and diameter of 62 representative fungi showed that most of them grew rapidly on CMMY medium in a week while some of them grew slowly. The color of the fungi colonies was different. Light-colored fungi colonies were generally white， light yellow or pink while dark colonies were generally brown， gray， gray-black or black. The colonies of a few strains were slightly purple or red. The colonies of some strains appeared to be light-colored in the early stage of growth and became dark gradually， which might be caused by the production of a large number of conidia or chlamydospores. In addition， a tiny minority of strains produced yellow or red pigments on CMMY medium. 41 representative fungi showed reproductive structures （66.13%）. Among the endophytic fungi， the dominant classes were Sordariomycetes and Eurotiomycetes and the relative frequency （RF） was 66.19% and 20.45% respectively. The dominant orders were Hypocreales （RF=55.4%）， Eurotiales （RF= 17.61%） and Pleosporales （RF=9.66%） with the dominant genera （RF=32.39%）， （RF=15.06%）， （RF=13.35%）， unidentifiable genus 3 （RF=5.11%），（RF=3.98%）， unidentifiable genus 2 （RF=3.41%）， （RF=3.13%） and（RF=2.84%）. Many endophytic fungi isolated from the banana roots in the study were common plant pathogenic fungi， such as ， ， ， etc. The change law of Shannon-Wiener， Simpson’ Diversity and Evenness indicated that the endophytic fungi communities in Tanluo Town （TL2） and Luoxu Town （LX） of Nanning City were abundant and well-proportioned. The endophytic fungal communities from two locations of Dacheng Town （DC1 and DC2） of Qinzhou City showed the maximum similarity coefficients （Sorenson’s similarit coefficiens， =0.67）. Habitats with different geographical conditions and climates are the main factors influencing the community composition and diversity of endophytic fungi in the roots of banana.

endophytic fungi; morphological characteristics; phylogenetic analysis; diversity index

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.02.020

植物內(nèi)生真菌（endophytic fungi）指那些其生活史的特定階段或全部階段寄生在植物組織內(nèi)，而不對植物產(chǎn)生有害癥狀的一類真菌。許多證據(jù)表明，內(nèi)生真菌與植物的結(jié)合對植物的適應(yīng)性很重要，內(nèi)生真菌定殖對植物的免疫系統(tǒng)、病害抑制、營養(yǎng)獲取和對非生物脅迫的耐受性等方面都起著積極的影響。一些植物內(nèi)生真菌的活性代謝產(chǎn)物不僅可以促進(jìn)其宿主的生長、提高宿主抵抗病蟲侵害的能力，對人類病原體還具有一定抑菌活性。

香蕉（spp.）歸屬于芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（），為多年生大型草本單子葉植物，多生長于溫暖潮濕的熱帶地區(qū)，是世界重要的熱帶和亞熱帶水果。有研究表明，一些分離自香蕉健康植株的內(nèi)生真菌不僅可以促進(jìn)植物根系定殖和植株的生長，還具有一定生防潛力，如抑制病原真菌菌絲生長、對植物病原線蟲具有殺蟲活性等。國內(nèi)外對香蕉內(nèi)生真菌種群多樣性的研究較少，已有研究從香蕉的假莖、球莖、葉片、根系等組織中分離獲得多種不同類群的內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)香蕉體內(nèi)具有種類豐富多樣的內(nèi)生真菌。根系是植物與微生物相互作用的重要場所，蘊(yùn)含著大量內(nèi)生真菌。香蕉的根系較為發(fā)達(dá)，可深入土壤生長，不同土層的根系內(nèi)很可能含有豐富多樣的內(nèi)生真菌。廣西是我國香蕉的主產(chǎn)區(qū)，香蕉產(chǎn)業(yè)是廣西特色農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)，然而目前對廣西香蕉的研究多集中在枯萎病的相關(guān)研究，未見對其內(nèi)生真菌的相關(guān)研究報(bào)道。為了發(fā)掘廣西香蕉內(nèi)生真菌的資源，本研究采用純培養(yǎng)法分離獲得廣西香蕉根系內(nèi)生真菌，通過形態(tài)學(xué)觀察及分子系統(tǒng)學(xué)方法確定內(nèi)生真菌的分類地位，了解其主要類群與物種多樣性，不僅豐富了植物內(nèi)生真菌資源庫，也為開發(fā)利用內(nèi)生真菌潛在的生態(tài)功能提供理論基礎(chǔ)。

? 材料與方法

材料

植物材料：分別于2018、2019年從廣西香蕉主產(chǎn)區(qū)南寧和欽州采集香蕉‘威廉斯’品種根系樣本，采樣地及采樣日期等信息見表1。每個(gè)樣地按五點(diǎn)采樣法采集香蕉健康植株根樣，混合后放入自封袋，置于冰盒保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后放入4℃冰箱。

培養(yǎng)基：內(nèi)生真菌菌株分離使用1/2玉米粉培養(yǎng)基（1/2CM）：玉米粉瓊脂8.5?g，瓊脂粉7.5?g，蒸餾水1000?mL。菌株純化使用玉米粉麥芽汁培養(yǎng)基（CMMY）：麥芽汁瓊脂10?g，玉米粉瓊脂8.5?g，酵母提取物2?g，瓊脂粉7.5?g，蒸餾水1000?mL。燕麥培養(yǎng)基（OA）：MgSO·7HO 1.0?g，KHPO 1.5 g，NaNO 1.0?g，燕麥粉10 g，瓊脂粉11?g，蒸鎦水1000?mL。水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：瓊脂15?g，蒸餾水1000?mL。

方法

1.2.1? 內(nèi)生真菌的分離純化與保存? 用自來水將

香蕉根樣沖洗干凈后，在超凈工作臺(tái)將根樣剪為1?cm左右的根段，隨機(jī)選取24個(gè)根段，以75%酒精進(jìn)行表面消毒40?s，用無菌水漂洗3次，再用0.1%升汞表面消毒4～5?min，無菌水漂洗3次后用無菌濾紙吸干根段表面的水分，隨后將根段放置于1/2CM培養(yǎng)基上，每皿放置3個(gè)根段，每個(gè)樣本5皿，同時(shí)吸取最后一次漂洗的無菌水100?μL涂布于CMMY培養(yǎng)基以驗(yàn)證消毒效果。置于25℃下培養(yǎng)，每天觀察，待有菌絲從根段長出后及時(shí)轉(zhuǎn)接至CMMY培養(yǎng)基上。純化后的內(nèi)生真菌菌株均保存于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院應(yīng)用微生物研究所和廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

1.2.2? 內(nèi)生真菌形態(tài)觀察? 分離獲得的內(nèi)生真菌菌株經(jīng)純化后，接種于CMMY培養(yǎng)基，觀察和記錄菌株菌落的生長速度以及菌落的形態(tài)特征，包括菌落質(zhì)地、顏色、有無色素產(chǎn)生等。真菌產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)觀察：將菌株培養(yǎng)在OA培養(yǎng)基上，在菌落邊緣45°插入滅菌蓋玻片，28℃下培養(yǎng)至菌絲長到蓋玻片上，取出蓋玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)（包括分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)、大小和顏色）等。對產(chǎn)孢量少或不產(chǎn)孢的菌株，可切取0.5?cm×0.5?cm的OA培養(yǎng)基方塊，上下各夾一片無菌蓋玻片，共置于WA培養(yǎng)基上，將菌株接種于OA培養(yǎng)基方塊上，于28℃下培養(yǎng)10～14?d后放入4℃冰箱低溫刺激產(chǎn)孢。取出蓋玻片進(jìn)行形態(tài)觀察時(shí)，可根據(jù)觀察需要使用乳酸酚棉蘭染色后進(jìn)行顯微觀察。

1.2.3? 內(nèi)生真菌的ITS序列分析? 根據(jù)菌落形態(tài)等特征將分離的內(nèi)生真菌菌株歸類為71種不同的形態(tài)型，每種形態(tài)型選取1株代表菌株進(jìn)行測序。挑取適量真菌菌絲體，按照真菌基因組DNA提取試劑盒（索萊寶，中國）的方法提取真菌DNA。rRNA基因的ITS1-5.8S-ITS4-28S部分區(qū)域PCR擴(kuò)增使用引物為ITS1（5?TCCGT-AGGTG-AACCTGCGG?3）和ITS4（5?TCCTCCGC-T-T-A-TT-GATATGC?3）。PCR反應(yīng)體系為：2×Easy PCR SuperMix 25?μL，正反引物各1?μL，模板DNA 1?μL，超純水定容至50?μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5?min，94℃變性1?min，53℃退火1?min，72℃延伸1?min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化和測序工作由華大基因科技服務(wù)有限公司完成。測序獲得的序列通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源序列比對，下載相似序列或參考相應(yīng)文獻(xiàn)下載構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所需的序列，使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行序列比對，基于Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)Bootstrap 1000次循環(huán)檢驗(yàn)系統(tǒng)樹的可靠性。

數(shù)據(jù)處理

相對頻率（relative frequency， RF）是指樣本中分離到的某種真菌的菌株數(shù)占分離到的總菌株數(shù)的百分比。優(yōu)勢菌可通過Camargo指數(shù)（Camargo’s index）來確定。Camargo’s index=1/，其中代表物種豐富度，指樣品中內(nèi)生真菌的分類單元。如果RF>1/，則該分類單元可以確定為優(yōu)勢菌。物種豐富度（species richness， ）、香農(nóng)-維納指數(shù)（Shannon-Wiener index， ）、辛普森指數(shù)（Simpson index， ）、均勻度指數(shù)（Evenness index， ）和相似性系數(shù)（Sorenson’s similarit coefficiens， ）計(jì)算公式如下：

=/ln

= 2/（+）

上述公式中，p為屬相對頻率，指樣本中分離到的某屬內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占分離到的總菌株數(shù)的百分比。代表2個(gè)樣本共有真菌屬數(shù)量，和分別代表2個(gè)樣本中各自分離到的真菌屬數(shù)量。

結(jié)果與分析

?內(nèi)生真菌分離結(jié)果

不同樣地香蕉根系內(nèi)生真菌的分離結(jié)果如表2。從168個(gè)香蕉根段分離的內(nèi)生真菌菌株經(jīng)過分離純化后共獲得352株內(nèi)生真菌，其中，南寧地區(qū)222株，欽州地區(qū)130株。不同樣地分離獲得的內(nèi)生真菌菌株數(shù)量存在差異，其中，金陵鎮(zhèn)樣地香蕉根部分離到的最多，共獲得72株內(nèi)生真菌，其次為大成鎮(zhèn)2，獲得69株內(nèi)生真菌;壇洛鎮(zhèn)2的香蕉根樣分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量最少，為25株。金陵鎮(zhèn)和壇洛鎮(zhèn)2樣地分離獲得內(nèi)生真菌菌株數(shù)差別較大的原因可能是2個(gè)樣地香蕉根樣采集的時(shí)間、季節(jié)不同（前者于2019年9月13日采集，后者于2018年6月27日采集），或是2個(gè)樣地香蕉的種植年限及栽培管理措施不同。此外，內(nèi)生真菌分離具有隨機(jī)性也可能是不同樣地根樣中所獲內(nèi)生真菌數(shù)量不同的原因。

?內(nèi)生真菌的鑒定

根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)特征（包括菌落形態(tài)、質(zhì)地、顏色、有無色素產(chǎn)生等）將分離到的352株內(nèi)生真菌劃分為71個(gè)不同的形態(tài)型，每個(gè)形態(tài)型各選擇1株代表菌株進(jìn)行ITS序列測定，測得序列分別在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，盡量選用已發(fā)表文章的序列或真菌鑒定權(quán)威機(jī)構(gòu)的序列進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，結(jié)合菌株形態(tài)特征，352株菌株共劃分為62個(gè)分類單元，它們歸屬于5綱17目34科43屬。每個(gè)分類單元選擇一株代表菌株作進(jìn)一步的形態(tài)特征觀察和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2.2.1? 菌株形態(tài)學(xué)特征? 將62株代表菌株接種至CMMY培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后，觀察記錄菌株的菌落形態(tài)和直徑，發(fā)現(xiàn)大部分菌株生長速度較快，少數(shù)菌株長速較慢，其中有10株菌株長速很快，培養(yǎng)3～5?d即可長滿90?mm培養(yǎng)皿，因此本研究單獨(dú)記錄這些菌株接種2?d后的菌落直徑（表3）。這些代表菌株菌落顏色各異，淺色系的菌落一般呈白色、淺黃色或粉色等，深色的菌落一般為褐色、灰色、灰黑色至黑色，少數(shù)菌株菌落略呈紫色或紅色。部分菌株在生長初期為淺色，后期菌落顏色逐漸變深，這可能是因?yàn)楫a(chǎn)生了大量分生孢子或厚垣孢子所致。此外，還有個(gè)別菌株可產(chǎn)生黃色或紅色色素。觀察發(fā)現(xiàn)這些代表菌株中有41株菌株能夠產(chǎn)生分生孢子（66.13%），因此對這些產(chǎn)孢菌株的形態(tài)特征作進(jìn)一步的觀察和拍照，部分產(chǎn)孢內(nèi)生真菌菌落和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2.2.2? 菌株基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析? 對不同形態(tài)型的菌株進(jìn)行ITS序列測定后在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，盡量選用已發(fā)表文章的序列或權(quán)威機(jī)構(gòu)的序列與本研究中62株代表菌株的ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。系統(tǒng)發(fā)育樹中（圖2），目標(biāo)菌株的序列分別與不同屬/種真菌的序列聚在獨(dú)立的分支上。由于一些屬真菌的種間差異性較小，在ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹中也未能明顯分開，因此一些代表菌株未能鑒定到種。3個(gè)未鑒定屬（包括5個(gè)代表菌株）的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對，與其相似性較高的均為未知分類地位的菌株序列，而且這些代表菌株均未產(chǎn)孢，難以通過形態(tài)學(xué)方法鑒定，因此將它們歸為未鑒定菌株。

?內(nèi)生真菌的種類組成

7個(gè)樣地分離獲得的352株內(nèi)生真菌歸屬于5綱17目34科43屬62個(gè)分類單元，其中有3個(gè)未鑒定屬（表4）。從表中可知，2株菌株屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes， 0.57%），2株菌株屬于毛霉菌門（Mucoromycota）毛霉菌綱（Mucoromycetes， 0.57%），32株菌株屬于子囊菌門（Ascomycota）座囊菌綱（Dothideo-my-cetes， 12.22%），72株菌株屬于子囊菌門散囊菌綱（Eurotiomycetes， 20.45%），233株菌株屬于子囊

菌門糞殼菌綱（Sordariomycetes， 66.19%）。

相對頻率（RF）反映了樣本真菌群落中某類真菌的優(yōu)勢度。所有分離菌株中，優(yōu)勢綱為糞殼菌綱（Sordariomycetes， RF=66.19%）和散囊菌綱（Eurotiomycetes， RF=20.45%）。優(yōu)勢目為肉座菌目（Hypocreales， RF=55.4%）、散囊菌目（Euro-ti-ales， RF=17.61%）和格孢腔菌目（Pleosporales， RF=9.66%）。優(yōu)勢屬為鐮刀菌屬（， RF= 32.39%）、青霉屬（， RF=15.06%）、木霉屬（， RF=13.35%）、未鑒定屬3（RF= 5.11%）、帚枝霉屬（， RF=3.98%）、未鑒定屬2（RF=3.41%）、彎孢屬（， RF= 3.13%）和突臍蠕孢屬（， RF=2.84%），但后5個(gè)屬的相對頻率未超過10%，其優(yōu)勢不明顯。

不同地理位置香蕉根系內(nèi)生真菌群落的優(yōu)勢類群在目和屬水平上有差異。如圖3所示，內(nèi)生真菌優(yōu)勢目中，所有樣地的共有優(yōu)勢目為肉座菌目（Hypocreales），壇洛鎮(zhèn)2、鑼圩鎮(zhèn)、金陵鎮(zhèn)和大成鎮(zhèn)2這4個(gè)樣地的優(yōu)勢目有3個(gè)，雙定鎮(zhèn)、壇洛鎮(zhèn)1和大成鎮(zhèn)1這3個(gè)樣地的優(yōu)勢目有2個(gè)。除了大成鎮(zhèn)2的最優(yōu)勢目為散囊菌目（Eurotiales），其余樣地的最優(yōu)勢目均為肉座菌目（Hypocr-eales）。所有樣地均沒有特有優(yōu)勢目。

如圖4所示，在內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬中，所有樣地的共有優(yōu)勢屬為鐮刀菌屬（）和木霉屬（）;大成鎮(zhèn)1樣地香蕉根系內(nèi)生真菌的最優(yōu)勢屬為木霉屬，大成鎮(zhèn)2的最優(yōu)勢屬為青霉屬（），其余5個(gè)樣地的最優(yōu)勢屬均為鐮刀菌屬。鑼圩鎮(zhèn)特有優(yōu)勢屬為（），

金陵鎮(zhèn)特有優(yōu)勢屬為曲霉屬（），其余5個(gè)樣地均沒有特有優(yōu)勢屬。

? 內(nèi)生真菌的多樣性和相似性分析

2.4.1? 內(nèi)生真菌的α-多樣性? α-多樣性可用來分析內(nèi)生真菌群落的物種多樣性，香農(nóng)-維納指數(shù)（）與物種豐富度（）的關(guān)系最密切，而辛普森指數(shù)（）則與物種豐富度關(guān)系較遠(yuǎn)，對物種均勻度（）的敏感性高于香農(nóng)-維納指數(shù)（）。地理位置對香蕉根系內(nèi)生真菌群落多樣性的影響見表5，結(jié)果表明，這些樣地香蕉根系內(nèi)定殖有豐富多樣的內(nèi)生真菌。其中，壇洛鎮(zhèn)2的香農(nóng)-維納指數(shù)（）最高，其次為鑼圩鎮(zhèn)。金陵鎮(zhèn)的辛普森指數(shù)（）最高，其次為壇洛鎮(zhèn)的2個(gè)樣地。所有樣地中，金陵鎮(zhèn)和大成鎮(zhèn)2樣地的香農(nóng)-維納指數(shù)（）較低，分別為2.15和1.94;雙定鎮(zhèn)和大成鎮(zhèn)2樣地的辛普森指數(shù)（）較低，分別為0.67和0.6。均勻度指數(shù)（）用于分析內(nèi)生真菌群落分布的均勻程度。壇洛鎮(zhèn)2的均勻度指數(shù)最高，說明該樣地中香蕉根系內(nèi)生真菌群落的分布最均勻，其次為鑼圩鎮(zhèn)，均勻度指數(shù)為1.22;而金陵鎮(zhèn)的均勻度指數(shù)最低，說明該樣地的香蕉根系內(nèi)生真菌群落分布的均勻程度最低。香農(nóng)-維納指數(shù)（）、辛普森指數(shù)（）和均勻度指數(shù)（）在7個(gè)樣地間的變化規(guī)律不完

全一致。綜合來看，壇洛鎮(zhèn)2和鑼圩鎮(zhèn)樣地香蕉根系的內(nèi)生真菌種群多樣性較豐富，群落分布較均勻。

2.4.2? 內(nèi)生真菌的相似性? 由表6看出，7個(gè)不同樣地香蕉根系內(nèi)生真菌的相似性存在差異，欽州地區(qū)2個(gè)樣地（大成鎮(zhèn)1、大成鎮(zhèn)2）的相似性系數(shù)最大，為0.67，說明這2個(gè)樣地香蕉根系內(nèi)生真菌種類組成最為相似;其次是金陵鎮(zhèn)和鑼圩

鎮(zhèn)，相似性系數(shù)為0.59。壇洛鎮(zhèn)1和金陵鎮(zhèn)的香蕉根系內(nèi)生真菌相似性最低，相似性系數(shù)僅為0.19，說明這2個(gè)樣地香蕉根系內(nèi)生真菌種類組成差異較大，其次為雙定鎮(zhèn)和金陵鎮(zhèn)，這2個(gè)樣地間的相似性系數(shù)為0.21。

討論

真菌菌株形態(tài)特征結(jié)合ITS序列分析方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于內(nèi)生真菌的鑒定及多樣性研究中。本研究通過采用形態(tài)特征觀察和ITS序列分析相結(jié)合的方法，對獲得的352株內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明廣西香蕉根系內(nèi)生真菌具有豐富的物種多樣性。這些內(nèi)生真菌大部分為子囊菌，少部分屬于接合菌和擔(dān)子菌，這與其他學(xué)者對香蕉內(nèi)生真菌的研究結(jié)果一致。國內(nèi)外學(xué)者對香蕉植株各部位內(nèi)生真菌種群的研究結(jié)果表明，香蕉根系內(nèi)生真菌常見類群主要有：曲霉屬（）、枝孢屬（）、彎孢屬（）、鐮刀菌屬（）、、青霉屬（）以及一些無孢菌類真菌;葉部內(nèi)生真菌常見類群主要有：炭疽菌屬（）、彎孢屬、盤長孢屬（）、球座菌屬（）、、黑孢屬（）、青霉屬、擬盤多毛孢屬（）、擬莖點(diǎn)霉屬（）、、輪枝菌屬（）、以及無孢菌類真菌，此外，假莖中常見類群有：、鐮刀菌屬、黑孢屬、、木霉屬（），球莖中常見類群有鐮刀菌屬、、葡萄穗霉屬（），葉軸中鐮刀菌屬較為常見。本研究中香蕉根系內(nèi)優(yōu)勢屬為彎孢屬、突臍蠕孢屬（）、鐮刀菌屬、青霉屬、帚枝霉屬（）、木霉屬和2個(gè)未鑒定屬，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果相似。彎孢屬、突臍蠕孢屬、鐮刀菌屬、青霉屬和木霉屬真菌產(chǎn)孢量大，適應(yīng)性強(qiáng)，這類真菌在自然界廣泛存在，能在多種生境、多種類型的植物組織中定殖，也因此常常在植物內(nèi)生真菌中占據(jù)優(yōu)勢地位。本研究所有樣地香蕉根系內(nèi)生真菌的共有優(yōu)勢屬為鐮刀菌屬和木霉屬，這也說明了這2個(gè)屬真菌廣泛存在于植物組織內(nèi)。

有研究表明，、鏈格孢屬（）、枝孢屬、、炭疽菌屬、間座殼屬（）、鐮刀菌屬、毛霉屬（）和莖點(diǎn)霉屬（）等常為植物根系內(nèi)生真菌的主要類群，但本研究僅分離到這些屬真菌的少量菌株，并未作為香蕉根系內(nèi)生真菌的主要類群存在，可見地域環(huán)境和宿主種類等因素的差異性對植物內(nèi)生真菌種群多樣性的影響較大。本研究分離到的內(nèi)生真菌中有不少菌株為常見的植物病原真菌，如鐮刀菌屬、炭疽菌屬、枝孢屬等。鐮刀菌屬真菌經(jīng)常作為植物病原菌存在，但也有不少報(bào)道證明該屬真菌作為植物內(nèi)生菌時(shí)，一般情況下不會(huì)引起其宿主產(chǎn)生病害癥狀，甚至具有促生、抗病蟲等正面作用。一些研究表明，植物健康組織中定殖著大量常見病原真菌，如擬莖點(diǎn)霉屬、鏈格孢菌（）、博寧炭疽菌（）、小孢擬盤多毛孢（）等，這些真菌在內(nèi)生階段不會(huì)對其宿主產(chǎn)生明顯的負(fù)面作用，但在環(huán)境條件或植物生理?xiàng)l件改變，如植株衰退時(shí)，這些內(nèi)生的潛在病原菌可能會(huì)產(chǎn)生致病性。

本研究中，不同地理位置的香蕉根系內(nèi)生真菌群落種類、組成和分布有所差異。有研究表明，內(nèi)生真菌的種類、分布與多樣性受到多種因素影響，如氣溫、光照等環(huán)境因素、植物種類等。對植物根系內(nèi)生真菌而言，土壤類型，土壤因子（如土壤pH等）對其定殖率、種類組成及種群多樣性的影響也比較明顯。本研究對香蕉根樣的采集時(shí)間不同，部分樣本是在夏季采集（雙定鎮(zhèn)、壇洛鎮(zhèn)1、壇洛鎮(zhèn)2、大成鎮(zhèn)1、大成鎮(zhèn)2），而一部分樣本是在秋冬季節(jié)采集（鑼圩鎮(zhèn)、金陵鎮(zhèn)），當(dāng)時(shí)的環(huán)境因素如溫度、濕度、降雨量等對內(nèi)生真菌種類組成也有一定影響。梁雪娟等的研究表明，在秋季杜仲中分離得到的內(nèi)生真菌種類和數(shù)量較多，但在本研究中，由于不同季節(jié)所采集的樣本數(shù)量有限，也未針對不同采集時(shí)間進(jìn)行內(nèi)生真菌的研究和比較，因此，樣本采集時(shí)間對香蕉內(nèi)生真菌種群組成及分布的影響還有待進(jìn)一步研究。α-多樣性指數(shù)和均勻度結(jié)果表明，廣西香蕉根系定殖有豐富多樣的內(nèi)生真菌。不同樣地香蕉根系內(nèi)生真菌的種類和組成有所不同，其中欽州地區(qū)大成鎮(zhèn)2個(gè)樣地的相似性系數(shù)最大（0.67），說明這2個(gè)樣地之間的香蕉根系內(nèi)生真菌組成最為相似，產(chǎn)生該結(jié)果的原因可能是這2個(gè)樣地的采集時(shí)間相近，且樣地間距離較近，其平均溫度、日照、降雨量等氣候環(huán)境較為相似。不同采樣點(diǎn)的地理環(huán)境和氣候給香蕉提供了不同的生境條件，是影響香蕉根系內(nèi)生真菌種類組成及多樣性差異的主要因素之一。

62株代表菌株中有41株菌株產(chǎn)孢，可進(jìn)行產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的觀察，其余22株不產(chǎn)孢的菌株通過低溫刺激和黑光燈間歇照射培養(yǎng)后仍未能產(chǎn)孢。產(chǎn)孢菌株中由于部分屬內(nèi)種間親緣關(guān)系較近，種間的形態(tài)特性差異較小，不產(chǎn)孢菌株也未觀察到可作為真菌鑒定依據(jù)的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征，而且僅菌株ITS序列分析結(jié)果也無法明確區(qū)分屬內(nèi)不同物種之間的差異，因此部分菌株仍未能確定到種，這對真菌鑒定工作造成一定困難。對不產(chǎn)孢菌株今后可采用菌絲損傷、更換培養(yǎng)基、添加鴨跖草汁、紫外線照射等方法進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)孢，對未鑒定菌株還可采用多序列分析方法進(jìn)一步完成真菌鑒定工作。

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36. 收稿日期 2021-07-06;修回日期 2021-10-23

    基金項(xiàng)目 廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目（No. YCBZ2018015）;廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 2019GXNSFAA185051）;廣

    西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目（桂農(nóng)科2019M18）

    作者簡介 陳艷露（1987—），女，博士研究生，研究方向：真菌分類學(xué)。*同等貢獻(xiàn)作者：謝 玲（1977—），女，研究員，研

    究方向：植物內(nèi)生真菌資源及其開發(fā)利用。**通信作者（Corresponding author）：劉 斌（LIU Bin），E-mail：

    liubin@gxu.edu.cn。