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    阿爾茨海默病小鼠模型海馬組織AtP5a1基因甲基化改變

    2017-02-06 17:12:22唐曉琴唐紅鄧飛阮思蓓李昕陳波
    中國(guó)醫(yī)藥科學(xué) 2016年13期
    關(guān)鍵詞:DNA甲基化阿爾茨海默病

    唐曉琴+唐紅+鄧飛+阮思蓓+李昕+陳波+楊朝鮮+熊小明+唐明希

    [摘要]目的初步探討中期阿爾茨海默?。ˋD)的presenilin-1/presenilin-2雙基因條件性敲除小鼠(dKOmice)模型中海馬組織Atp5al基因的甲基化改變情況。方法運(yùn)用簡(jiǎn)化的表觀亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)(RRBS)檢測(cè)3只12月齡雌性dKO mice和3只同系同齡雌性野生型小鼠海馬組織基因組DNA異常甲基化情況,利用Bismark(v0.7.4)軟件進(jìn)行對(duì)照分析獲取異常甲基化基因。結(jié)果二代測(cè)序結(jié)果顯示12月齡中度神經(jīng)退行性病變AD dKO mice海馬中Atp5al基因呈低甲基化狀態(tài)(P<0.05)。結(jié)論Atp5al基因在中期ADdKO mice的海馬中呈低甲基化狀態(tài),提示低甲基化的Atp5al基因可能作為參與中期AD病程的潛在候選基因。

    [關(guān)鍵詞]Atp5al基因;阿爾茨海默??;DNA甲基化;dKO inlce

    阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease,AD)是一種以進(jìn)行性記憶障礙及認(rèn)知功能減退為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,典型病理改變是大腦皮層和海馬細(xì)胞外主要由β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,A p)沉積形成的老年斑和tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及遺傳因素、環(huán)境因素、成千上萬(wàn)個(gè)基因表達(dá)的改變及多種信號(hào)途徑的調(diào)節(jié),如Aβ的沉積、tau蛋白的過(guò)度磷酸化、氧化應(yīng)激、炎癥、能量代謝及細(xì)胞凋亡周期異常等。Mastroeni D等以同卵雙胞胎作為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)正常的和患AD的雙胞胎盡管遺傳基因相同,但是他們的表觀遺傳修飾卻不同,AD患者的雙顳側(cè)皮層神經(jīng)元中DNA甲基化水平顯著低于正常的同卵同胎,而且,其發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)和病程都相差很大??梢?jiàn),表觀遺傳機(jī)制在AD的發(fā)病過(guò)程中扮演著十分重要的角色。

    隨著高通量測(cè)序技術(shù)的開(kāi)展,AD相關(guān)基因的甲基化分析已經(jīng)取得一些進(jìn)展。本研究采用簡(jiǎn)化的表觀亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)(reduced representationbisulphite sequencing,RRBS)初步構(gòu)建起了中期AD dKO mice海馬組織基因組DNA甲基化圖譜,從中發(fā)現(xiàn)Atp5a1基因呈低甲基化狀態(tài),可為后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證并探討AD的表觀遺傳學(xué)機(jī)制提供潛在候選靶基因。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    美國(guó)Ya-Ping Tang教授(Louisiana State University,USA)為本實(shí)驗(yàn)提供了親代小鼠(基因型為fPSl/fPSl,PS2-/-,Cre+/-),其遺傳背景為B6CBAFl,是利用Cre/loxP系統(tǒng)條件性敲除前腦presenilin-1(PS1)基因,所得雜合子與利用基因打靶技術(shù)將presenilin-2(PS2)基因進(jìn)行全身性敲除所得雜合子雜交而來(lái)。子代dKO mice的飼養(yǎng)、繁殖與基因型鑒定等如我們已報(bào)道所述。實(shí)驗(yàn)分組:12月齡雌性dKOmice(體重=35.0±2.6g)和同齡雌性野生型小鼠(體重=37.0±1.8g)各3只用于RRBS測(cè)序檢測(cè)。

    1.1.2海馬組織的準(zhǔn)備(1)乙醚麻醉后快速斷頸處死實(shí)驗(yàn)小鼠;(2)用組織剪剪開(kāi)皮毛,暴露頭骨;(3)更換剪刀撥開(kāi)顱骨,暴露全腦;(4)用眼科剪剝離全腦組織,轉(zhuǎn)移至放于碎冰上的無(wú)菌平皿中;(5)用手術(shù)刀沿矢狀縫把左右半球分開(kāi),迅速分離海馬組織,裝入已標(biāo)記好的凍存管中,用封口膠封口,置于液氮罐中約30min后,轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存。

    1.2方法

    1.2.1 DNA提取TIANamp DNA提取試劑盒(貨號(hào)DP304)購(gòu)自天根生化科技有限公司。提取海馬組織基因組DNA主要步驟包括:(1)將組織處理成細(xì)胞懸液;(2)裂解:在變性條件下用蛋白酶K裂解樣本;(3)吸附:DNA吸附于純化柱中的硅膠膜上;(4)清洗:將硅膠膜上吸附的蛋白、脂質(zhì)等雜質(zhì)洗掉;(5)洗脫:利用洗脫液TE將高純度的DNA從硅膠膜上洗脫。運(yùn)用紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD值(0D260/280和0D260/230)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳(100V,40min)進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)。

    1.2.2RRBS測(cè)序?qū)⒓兓蟮腄NA提交到杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司進(jìn)行甲基化譜RRBS測(cè)序(Illumina HiSeq 2500)。RRBS測(cè)序原理:運(yùn)用限制性內(nèi)切酶MsPI處理基因組DNA,產(chǎn)生末端包含CpG二核苷酸的片段后,在末端修復(fù)并加A尾和接頭,根據(jù)大?。?0-220bp)選擇CpG豐富DNA片段,經(jīng)重亞硫酸鹽處理及PCR擴(kuò)增后使用Illumina基因組分析儀進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后,采用NGSQCToolkit_v2.3軟件進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制,將5%以上堿基質(zhì)量數(shù)低于30的序列過(guò)濾掉,并在Bismark(v0.7.4)軟件中將過(guò)濾后的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到小鼠參考基因組序列上,分別計(jì)算每個(gè)樣本Atp5al基因發(fā)生甲基化的碳(C)數(shù)比上總C數(shù)而得到其相對(duì)甲基化水平,再提取6個(gè)樣本的相對(duì)甲基化水平,采用edgeR軟件進(jìn)行差異分析,獲得異常甲基化基因。發(fā)生甲基化的篩選標(biāo)注為P<0.05。

    2結(jié)果

    2.1海馬組織DNA質(zhì)量鑒定結(jié)果

    經(jīng)紫外線分光光度計(jì)測(cè)定,用于RRBS檢測(cè)的海馬組織基因組DNA樣品滿足:0D260/280≥1.8,0D260/230≥1.5(表1)。將提取的DNA進(jìn)行0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)(100V,40min),結(jié)果顯示:DNA樣品電泳條帶完整清晰,符合RRBS檢測(cè)及單基因甲基化檢測(cè)要求(圖1)。

    2.2Atp5a1基因甲基化篩選結(jié)果

    RRBS檢測(cè)完成后,利用Bismark(v0.7.4)軟件同小鼠參考基因組序列進(jìn)行對(duì)比分析,篩選出異常甲基化基因Atp5a1呈低甲基化狀態(tài)。如表2所示,Atp5a1基因位于第十八號(hào)染色體外顯子起始位點(diǎn)為77778732,終止位點(diǎn)為77778899,通過(guò)Bismark(v0.7.4)軟件中將過(guò)濾后的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到小鼠參考基因組序列上,利用實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組測(cè)序結(jié)果,采取edger軟件進(jìn)行相對(duì)甲基化率差異分析,獲得異常甲基化基因Atp5a1(P<0.05)。

    3討論

    隨著人口老齡化的日益加重,對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的研究也越來(lái)越緊迫。流行病學(xué)調(diào)查顯示,2014年用于護(hù)理患AD和其他癡呆患者的費(fèi)用超過(guò)2170億美元,預(yù)計(jì)到2015年用于65歲及以上AD患者的衛(wèi)生保健、長(zhǎng)期護(hù)理和臨終關(guān)懷等服務(wù)的總費(fèi)用將達(dá)2260億美元。目前,每67秒就會(huì)有一個(gè)人被診斷為AD患者,預(yù)計(jì)到2050年,這個(gè)時(shí)間將縮短為33秒,每年將導(dǎo)致近100萬(wàn)新發(fā)病例。顯然,AD已經(jīng)成為一個(gè)舉世矚目的社會(huì)和醫(yī)學(xué)問(wèn)題。dKO mice模型已被證實(shí)具有AD樣神經(jīng)退行性疾病的典型表型,如大腦皮質(zhì)和海馬萎縮、側(cè)腦室和第三腦室擴(kuò)大、嚴(yán)重神經(jīng)元的損失、神經(jīng)膠質(zhì)過(guò)多癥、tau蛋白的過(guò)度磷酸化、學(xué)習(xí)和記憶功能喪失等。該動(dòng)物模型容易存活、飼養(yǎng)和繁殖,于2個(gè)月齡時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)輕度記憶障礙,6個(gè)月齡時(shí)大腦皮層明顯變薄,皮層神經(jīng)元丟失達(dá)18%左右;12月齡時(shí)表現(xiàn)出中期AD樣表型。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RRBS測(cè)序檢測(cè)12月齡dKO mice和野生型小鼠海馬組織中基因組DNA異常甲基化分布情況,利用相關(guān)生物軟件對(duì)照分析,發(fā)現(xiàn)了存在于第十八號(hào)染色體外顯子的Atp5al(ATP synthase-a)基因呈低甲基化狀態(tài)。

    Atp5a1基因編碼的是ATP合成酶的a-亞基,ATP合成酶廣泛分布于線粒體內(nèi)膜上,負(fù)責(zé)將呼吸鏈中的ADP合成為ATP,Atp5a1基因缺失將導(dǎo)致該酶失活,使細(xì)胞凋亡。研究表明,Atp5a1在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常,如在結(jié)直腸癌的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)減少,而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、食管癌的腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)。此外,Seth R等還發(fā)現(xiàn)高水平的Atp5al表達(dá)與某些單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和TP53突變有關(guān),能促進(jìn)宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的發(fā)生,從而發(fā)展為腫瘤,而Atp5a1低水平的表達(dá)可能促進(jìn)基因的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)腫瘤的發(fā)生。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)該基因在AD發(fā)生機(jī)制中的研究報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)RRBS測(cè)序結(jié)果顯示,Atp5a1基因在12月齡dKO mice的海馬中呈低甲基化狀態(tài),初步提示中期AD dKO mice模型的病理過(guò)程中低甲基化的Atp5a1基因可能發(fā)揮著一定作用。但由于本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳皟H限于二代測(cè)序結(jié)果,研究樣本量又有限,要進(jìn)一步確定Atp5a1基因是否真正參與到中期AD dKO mice的病程,還需進(jìn)一步采用甲基化特異性PCR、單基因甲基化測(cè)序、RT-PCR、免疫組化及免疫印跡等方法進(jìn)一步驗(yàn)證并分析該基因甲基化狀態(tài)、轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平等改變等情況,并將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,且結(jié)合早期及晚期dKO mice相應(yīng)基因甲基化改變情況進(jìn)行對(duì)比分析,為全面了解Vps33b基因的甲基化狀態(tài)在中期AD中的生物學(xué)功能提供候選基因。

    綜上所述,RRBS測(cè)序結(jié)果初步顯示Atp5a1基因在中度神經(jīng)退行性病變AD dKO mice的病理進(jìn)程中呈低甲基化狀態(tài),為進(jìn)一步證實(shí)、篩選及研究AD發(fā)生的表觀遺傳機(jī)制、病理進(jìn)程,以及AD基因靶向預(yù)防、治療、預(yù)后判斷等提供重要的候選線索。

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