測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中酪蛋白磷酸肽（CPP）樣品前處理方法的優(yōu)化

◎ 王澤琪，唐 輝，劉 洋，李金龍

（飛鶴（甘南）乳品有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 162100）

酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides，CPP）是以牛乳酪蛋白為原料，通過(guò)生物技術(shù)制得的具有生物活性的多肽，CPP分子由二十到三十幾個(gè)氨基酸殘基組成，其中包括4～7個(gè)成簇存在的磷酸絲氨酸殘基。大量試驗(yàn)證明，CPP能有效促進(jìn)人體對(duì)鈣、鐵、鋅等二價(jià)礦物營(yíng)養(yǎng)素的吸收和利用[1]。我國(guó)居民膳食組成以植物性食物為主，其中植酸、草酸、纖維素等物質(zhì)會(huì)對(duì)鈣、鐵、鋅吸收產(chǎn)生極大的影響，目前，酪蛋白磷酸肽作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑應(yīng)用在嬰幼兒食品中[2]。

目前，對(duì)于CPP的檢測(cè)主要有電泳法、鋇鹽沉淀法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[3]。高效液相色譜法檢測(cè)CPP操作相對(duì)簡(jiǎn)單快捷，但由于嬰幼兒配方乳粉樣品基質(zhì)復(fù)雜，在CPP特征峰附近常有干擾峰存在，影響CPP的定量準(zhǔn)確性[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，利用離子交換固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行了凈化處理，減少了樣液中的雜質(zhì)，但經(jīng)過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)凈化效果未能有效適用于所實(shí)驗(yàn)用的嬰幼兒配方奶粉；在對(duì)照配料表后，使用RP柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，有效去除了對(duì)樣品中CPP干擾較大的水解蛋白類(lèi)原料，該方法可以使樣品中CPP含量的定量更為精準(zhǔn)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰兒配方乳粉、幼兒配方乳粉及對(duì)應(yīng)CPP原料。

實(shí)驗(yàn)室用水為GB/T 6682—2008所規(guī)定一級(jí)水；乙腈（色譜純，默克公司）；乙酸（優(yōu)級(jí)純，天津科密歐公司）；0.1%乙酸溶液，10%乙酸溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

0.22 μm水系濾膜；cleanert IC-RP固相萃取柱，2.5 mL；PCX陽(yáng)離子交換柱；Waters2695型高效液相色譜儀，配備紫外檢測(cè)器（2489），Waters公司；電子天平、pH計(jì)（梅特勒-托利多公司）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；渦旋混合器（其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

（1）溶解。稱(chēng)取配方乳粉1 g（精確至0.000 1 g）于100 mL燒杯中，試樣用15 mL約40 ℃的熱水溶解，超聲 10 min。

（2）沉淀及過(guò)濾。使用10%乙酸溶液調(diào)節(jié)樣液pH至4.60±0.05，轉(zhuǎn)移至25 mL具塞比色管中，用一級(jí)水定容，混勻，過(guò)濾待凈化。

（3）樣液的凈化。IC-RP柱依次用10 mL甲醇和10 mL水活化（流速2～4 mL·min-1），將樣液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，之后過(guò)活化后的IC-RP柱，棄去前8 mL樣液（流速2～4 mL·min-1），收集3 mL樣液（流速2～4 mL·min-1），渦旋混勻后等待上機(jī)測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

稱(chēng)取酪蛋白磷酸肽原料0.05 g（精確至0.000 01 g）于100 mL燒杯中，用25 mL約40 ℃的熱水溶解，超聲10 min后，用10%乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.60±0.05，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用一級(jí)水定容至刻度線。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

分別吸取1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL和10 mL酪蛋白磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至50 mL容量瓶中，用一級(jí)水定容至50 mL后，配制成濃度為20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、120 μg·mL-1、160 μg·mL-1和200 μg·mL-1的酪蛋白磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)工作液按照1.3.1中（3）進(jìn)行凈化后等待上機(jī)測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A：0.1%乙酸溶液，B：乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL，梯度洗脫參數(shù)如表1所示。

表1 梯度洗脫參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 嬰幼兒配方乳粉樣品前處理方法優(yōu)化

對(duì)酪蛋白磷酸肽（CPP）原料理論添加量相同的嬰兒配方乳粉和幼兒配方乳粉Ⅱ的CPP含量進(jìn)行檢測(cè)，色譜圖如圖1、圖2所示。結(jié)果表明，嬰兒配方乳粉中CPP含量較幼兒配方乳粉中CPP含量低30%。由于嬰幼兒配方乳粉樣品基質(zhì)復(fù)雜，在CPP特征峰附近常有干擾峰存在，影響CPP的定量準(zhǔn)確性，根據(jù)嬰兒配方奶粉CPP色譜峰（圖1）和幼兒配方奶粉CPP色譜峰（圖2）峰后干擾峰峰面積的差異，選擇根據(jù)配料表的差異來(lái)測(cè)試是何種原料帶來(lái)的后方干擾峰。

根據(jù)二者后干擾峰峰面積不同選擇二者配料表中存在差異原料對(duì)原料進(jìn)行篩查，選擇對(duì)脫鹽乳清粉D90、脫鹽乳清粉D70、乳白蛋白粉、濃縮乳清蛋白粉這幾種原料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比，同時(shí)也對(duì)在嬰兒配方奶粉和幼兒奶粉中添加量差異較大的乳清蛋白粉（水解工藝）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比，通過(guò)保留時(shí)間定性，探究CPP特征峰后的干擾峰是何種原料帶來(lái)的影響，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)干擾峰來(lái)自于乳清蛋白粉（水解工藝）原料。根據(jù)配料表中原料乳清蛋白粉（水解工藝）的添加量模擬該原料在嬰兒配方奶粉中添加量和幼兒奶粉添加量，得到與樣品后干擾峰峰型一致的峰型，如圖3所示。選擇可以對(duì)有機(jī)大分子產(chǎn)生過(guò)濾效果的IC-RP柱進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)柱后該原料所帶來(lái)的干擾峰被有效凈化，如圖4所示，使用嬰兒配方奶粉進(jìn)行驗(yàn)證，過(guò)柱前后CPP特征峰處凈化效果良好，如圖5所示。

2.2 前處理方法優(yōu)化及方法優(yōu)化后的線性、重復(fù)性、定量限、加標(biāo)回收結(jié)果

2.2.1 前處理方法優(yōu)化

稱(chēng)取配方乳粉1 g（精確至0.000 1 g），放入100 mL燒杯中，試樣用15 mL約40 ℃的熱水溶解，超聲10 min；使用10%乙酸溶液調(diào)節(jié)樣液pH至4.60±0.05，轉(zhuǎn)移至25 mL具塞比色管中，用一級(jí)水定容，混勻，過(guò)濾待凈化；IC-RP柱依次用甲醇10 mL和10 mL水活化（流速2～4 mL·min-1），樣液分別過(guò)0.22 μm濾膜和活化后的RP柱，棄去前8 mL樣液（流速2～4 mL·min-1），收集3 mL樣液（流速2～4 mL·min-1），渦旋混勻后等待上機(jī)測(cè)定，過(guò)柱凈化后樣品濃度得到有效提升，如表2所示。

表2 樣品過(guò)柱前后數(shù)值對(duì)比表

2.2.2 線性結(jié)果

采用優(yōu)化方案，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1.3.3）進(jìn)行色譜分析，結(jié)果如圖6所示。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，20～200 μg·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 723。

2.2.3 重復(fù)性

選取嬰兒配方奶粉，采用優(yōu)化方案對(duì)其進(jìn)行7次平行測(cè)定，所得重復(fù)性結(jié)果見(jiàn)表3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為4.06%，精密度良好。

表3 方法精密度表

2.2.4 定量限

如圖7所示，采用優(yōu)化方案后在稱(chēng)樣量為1 g定容25 mL時(shí)，信噪比為8.7，檢出限為4 mg/100 g，定量限為12 mg/100 g。

2.2.5 加標(biāo)回收結(jié)果

采用優(yōu)化方案進(jìn)行6次加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4，回收率為95.6%～100%（RSD＜2.31%），說(shuō)明方法重復(fù)性良好，回收率穩(wěn)定。

表4 加標(biāo)回收率結(jié)果表

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探究了影響CPP特征峰定量的原料，且通過(guò)對(duì)前處理步驟中沉淀去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)的方法進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)采用乙酸調(diào)節(jié)pH后，過(guò)IC-RP柱凈化，能夠有效去除水解蛋白對(duì)CPP檢測(cè)的干擾；經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的前處理方法準(zhǔn)確度高，精密度好，在20～200 μg·mL-1線性關(guān)系良好，平均回收率為97.1%；優(yōu)化后的方法去除了由水解蛋白引起的定量誤差，準(zhǔn)確度更高。