茯苓酸對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的保護作用及機制

陳云，王婷婷，郝明明，胡立杰

（1.衡水市第四人民醫(yī)院兒科，河北 衡水 053000；2.衡水市人民醫(yī)院小兒內(nèi)科，河北 衡水 053000；3.衡水市第四人民醫(yī)院藥劑科，河北 衡水 053000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALⅠ）是一種嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，以快速肺泡損傷、嚴重低氧血癥、血管通透性增加以及不可控的炎癥反應(yīng)為病理表現(xiàn)，嚴重可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），是臨床上導(dǎo)致多器官衰竭和高死亡率的主要原因之一[1?2]。盡管當前醫(yī)療和衛(wèi)生保健水平已有所改善，但針對ALⅠ尚缺乏特異性和有效的治療方法。因此，尋找新的有效的治療藥物對提高ALⅠ治療水平具有重要意義。天然產(chǎn)物是發(fā)現(xiàn)新藥化合物的主要來源之一。茯苓酸（pachymic acid,PA）是從中藥茯苓中提取的蒽酮型三萜化合物。PA被報道具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理作用[3?5]。在體外實驗研究中，PA可以抑制H2O2誘導(dǎo)的腦微血管細胞凋亡[6]。PA對ALⅠ是否具有保護作用尚不清楚。本研究旨在觀察PA對脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）誘導(dǎo)的巨噬細胞活化以及ALⅠ模型小鼠的保護作用，并初步探討其作用機制，以期為臨床ALⅠ的治療尋找新的潛在治療藥物。

1 材料與方法

1.1 細胞及實驗動物

小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7（武漢普諾賽生命科技有限公司），肺巨噬細胞參照文獻[7]方法取自雄性C57BL/6小鼠，即處死小鼠后剝離肺葉，使用1.0 mg/mL膠原酶、25 U/mL脫氧核糖核酸酶從小鼠全肺中分離巨噬細胞。收集細胞，在含有10%（φ）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37℃，5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中1 h后，沖洗掉未貼壁細胞。健康雄性新C57BL/6小鼠36只，6~8周齡，購自河北省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK（冀）2021?001。本實驗根據(jù)實驗動物管理與保護的有關(guān)規(guī)定飼養(yǎng)動物并進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器

PA（質(zhì)量分數(shù)＞98%，中國藥品生物制品檢定所）；LPS（美國Sigma公司）；Western blot一抗（美國CST公司）；HRP標記的羊抗兔ⅠgG二抗（北京索萊寶科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；NO檢測試劑盒（Abbkine公司）；MPO比色法檢測試劑盒（Biovision公司）；PrimeScript RT reagent Kit試劑盒（寶生物工程有限公司）；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（賽默飛世爾科技公司）；Mini?Protean聚丙烯酰胺凝膠電泳儀（美國Bio?Rad公司）；MK3型酶標免疫分析儀（Biotek公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)與處理

收集分離的肺巨噬細胞，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37℃，5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中1 h后，沖洗掉未貼壁細胞。根據(jù)實驗要求，使用指示濃度的PA和/或LPS處理貼壁細胞。RAW264.7細胞接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長匯合率達80%以上傳代培養(yǎng)。在LPS（100 ng/mL）刺激前30 min，使用相應(yīng)濃度的PA處理細胞。

1.4 MTT實驗檢測細胞活力

將RAW264.7及肺巨噬細胞以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單細胞懸液后以5 000個/孔接種于96孔板中，放入溫度為37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入不同濃度PA（0、5、10、20、40、80μmol/L）干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入20μL的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去MTT溶液，并加入100μL DMSO，使用酶標儀測定570 nm處各孔的吸光度（A570）值。

1.5 細胞培養(yǎng)上清液NO水平測定

將RAW264.7及肺巨噬細胞以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單細胞懸液后以5×105個/孔密度接種于12孔板中培養(yǎng)過夜，使用40μmol/L的PA處理細胞30 min，然后使用100 ng/mL的LPS刺激24 h。收集上清液，使用NO測定試劑盒測定NO釋放水平。

1.6 ALⅠ動物模型制備

將36只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機分為Control組、LPS組和LPS+PA組，每組12只。造模當日將小鼠以戊巴比妥麻醉后，LPS組和LPS+PA組小鼠經(jīng)氣管內(nèi)滴入5 mg/kg的LPS（以50μL PBS溶解）誘導(dǎo)ALⅠ模型，Control組滴入等量PBS溶液。造模結(jié)束后LPS+PA組小鼠經(jīng)腹腔注射10 mg/kg PA[8]（PA預(yù)先使用橄欖油配置成0.5 mg/mL），Control組和LPS組小鼠給予等體積橄欖油注射。在給予LPS后24 h每組取8只小鼠處死。結(jié)扎小鼠右肺，行左肺肺泡灌洗并收集肺泡灌洗液，用PBS洗肺2次收集BALF，用裂解緩沖液裂解紅細胞，離心后收集上清液。無菌條件下分離右肺組織，用生理鹽水充分沖洗并吸取表面水分。

1.7 小鼠肺組織HE染色及病理評分

取10%（φ）甲醛溶液固定的右上肺組織，洗滌后進行常規(guī)的脫水、透明、包埋和4μm連續(xù)切片。將切片采用二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水后，依次采用蘇木精和伊紅染色，最后中性樹膠封片。在光鏡下觀察肺組織病理改變，每張切片隨機取10個視野觀察，參照Zhang等[9]的方法進行評分，取其平均值為病理評分。

1.8 RT?PCR檢測mRNA表達

使用Trizol試劑從收集的細胞及小鼠肺組織中提取總RNA，測定RNA濃度和純度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進行擴增，按照試劑盒操作方法檢測iNOS、TNF?α、ⅠL?6、ⅠL?1β、ⅠL?12 mRNA表達水平，采用2-ΔΔCt法計算RNA相對表達量。

1.9 小鼠肺泡灌洗液總蛋白濃度及肺組織MPO檢測

使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測BALF中總蛋白濃度。取小鼠右下肺組織制備肺組織勻漿，將取好的50 mg肺組織加入冷生理鹽水（體積比1∶9）置于專用試管中，使用勻漿機打勻后，置于離心機以1 500 r/min、4℃條件離心10 min，離心結(jié)束后取上清液，使用比色法檢測肺組織中髓過氧化物酶（MPO）活性，操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.10 Western blot實驗

BCA法定量提取的細胞或肺組織蛋白后，取適量樣品蛋白經(jīng)SDS?PAGE電泳轉(zhuǎn)印至PVDF膜，然后以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，以β?actin為內(nèi)參，分別加入p38、p?p38、MK2、p?MK2、Akt、p?Akt、p65、p?p65一抗于4℃條件下孵育過夜，TBST洗膜3次；最后加入二抗（1∶1 000）室溫下孵育2 h，ECL法顯色，采用Ⅰmage J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 20.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，多組間比較使用單因素方差分析，進一步兩兩比較采取SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PA對RAW264.7細胞和肺巨噬細胞活力的影響

與Control組比較，PA（5~80μmol/L）對RAW264.7細胞系和肺巨噬細胞活力均無明顯不良影響（P＞0.05）。見圖1。在后續(xù)實驗中采用40μmol/L PA進行功能實驗研究。

圖1 PA對巨噬細胞活力的影響Figure 1 Effects of PA on the activity of macrophages

2.2 PA對LPS處理的巨噬細胞iNOS表達及NO生成的影響

與Control組比較，使用LPS處理RAW264.7細胞和肺巨噬細胞后，iNOSmRNA水平及NO生成增加（P＜0.01）；與LPS組比較，PA干預(yù)顯著降低了iNOS水平及NO生成增加（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組巨噬細胞iNOS表達及NO水平Figure 2 The expression of iNOSand the NO level in macrophages of each group

2.3 PA對LPS處理的巨噬細胞促炎介質(zhì)和細胞因子表達的影響

與Control組比較，使用LPS處理RAW264.7細胞和肺巨噬細胞后，TNF?α、ⅠL?6、ⅠL?1β、ⅠL?12 mRNA水平均顯著升高（P＜0.01）；與LPS組比較，PA干預(yù)顯著降低了TNF?α、ⅠL?6、ⅠL?1β、ⅠL?12 mRNA水平（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組巨噬細胞促炎細胞因子水平Figure 3 The levels of pro?inflammatory cytokines in macro‐phages of each group

2.4 PA對LPS處理的巨噬細胞p38 MARK/Akt/NF?κB信號通路的影響

與Control組比較，使用LPS處理RAW264.7細胞和肺巨噬細胞顯著促進p38、MK2、Akt和NF?κB（p65）蛋白的磷酸化（P＜0.05）；與LPS組比較，PA干預(yù)顯著抑制p38、MK2、Akt和NF?κB（p65）蛋白的磷酸化（P＜0.05）。見圖4。

圖4 PA對LPS處理的RAW264.7細胞系和原代肺巨噬細胞p38、MK2、Akt和NF?κB（p65）蛋白表達的影響Figure 4 Effects of PA on the expressions of p38，MK2，Akt and NF?κB（p65）proteins in LPS?treated RAW264.7 cell line and primary lung macrophages

2.5 PA對LPS誘導(dǎo)的小鼠ALⅠ的影響

HE染色后光鏡下可見Control組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔清晰、形態(tài)規(guī)則，肺泡及間質(zhì)無明顯充血、滲出及炎癥細胞浸潤；與Control組比較，LPS組小鼠肺泡壁毛細血管充血、擴張明顯，肺泡腔和肺組織間隙滲出明顯且較多炎性細胞浸潤，肺組織病理評分顯著增加（P＜0.05），肺泡灌洗液中總蛋白濃度及肺組織MPO水平均顯著升高（P＜0.01）；與LPS組比較，LPS+PA組肺組織損傷情況減輕，炎性細胞浸潤明顯減少，病理評分降低（P＜0.05），肺泡灌洗液中總蛋白濃度及肺組織MPO水平均顯著降低（P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組小鼠肺組織損傷情況Figure 5 The damage of lung tissuesfrom mice in each group

2.6 PA對LPS誘導(dǎo)的ALⅠ小鼠促炎介質(zhì)、細胞因子及p38 MARK/Akt/NF?κB信號通路的影響

RT?PCR檢測結(jié)果顯示，與Control組比較，LPS組 小 鼠 肺 組 織iNOS、TNF?α、ⅠL?6、ⅠL?1β、ⅠL?12 mRNA水平均顯著升高（P＜0.01）；與LPS組比較，PA干預(yù)顯著降低了肺組織iNOS、TNF?α、ⅠL?6、ⅠL?1β、ⅠL?12 mRNA（P＜0.01）。見圖6。

圖6 RT?PCR檢測各組小鼠肺組織促炎細胞因子水平Figure 6 The levels of pro?inflammatory cytokines in lung tissues of each group

Western blot實驗檢測結(jié)果顯示，與Control組比較，LPS組小鼠肺組織p38、MK2、Akt和NF?κB（p65）的磷酸化水平顯著增加（P＜0.05）；與LPS組比較，PA干預(yù)顯著抑制p38、MK2、Akt和NF?κB（p65）的磷酸化（P＜0.05）。見圖7。

圖7 PA對LPS誘導(dǎo)的ALⅠ小鼠肺組織p38、MK2、Akt和NF?κB（p65）蛋白表達的影響Figure 7 Effects of PA on expressions of p38，MK2，Akt and NF?κB（p65）proteins in lung tissues of mice with LPS?induced ALⅠ

3 討論

ALⅠ是重癥監(jiān)護病房患者發(fā)病率和死亡率的主要原因之一。炎癥細胞浸潤增強的炎癥反應(yīng)和肺內(nèi)促炎細胞因子表達升高是ALⅠ發(fā)病的關(guān)鍵因素[10]。炎癥通常被認為是對包括微生物感染在內(nèi)的各種攻擊的一種防御反應(yīng)，然而過度炎癥往往會導(dǎo)致廣泛的組織損傷、急性呼吸衰竭、全身功能障礙甚至死亡。越來越多的證據(jù)表明巨噬細胞在炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，作為抵抗感染的第一道防線，其釋放多種促炎介質(zhì)，并促進中性粒細胞從血管內(nèi)被招募到肺部，最終導(dǎo)致ALⅠ[11]。因此，抗巨噬細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是ALⅠ治療的有效策略。

PA是一種三萜類化合物，被廣泛報道具有抗氧化應(yīng)激和抗腫瘤作用[12?13]，而PA對ALⅠ的作用卻較少被研究。在本研究中，PA抑制了巨噬細胞中p38 MAPK/MK2和Akt的磷酸化激活，而此兩者均為Toll樣受體4（toll like receptor 4,TLR4）/髓樣分化蛋白88（myeloid differentiation protein 88,MyD88）信號通路的關(guān)鍵下游信號分子，通過進一步活化NF?κB（p65）促進炎癥介質(zhì)和細胞因子的表達。PA對相關(guān)信號分子的抑制以及整個三萜類化合物藥理學(xué)特征提示PA可能是通過調(diào)節(jié)巨噬細胞功能發(fā)揮抗炎作用。

NO是一種炎癥標志物，用于預(yù)測炎癥的進展，是巨噬細胞在LPS暴露時在iNOS誘導(dǎo)下產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)使用PA預(yù)處理抑制了原代肺巨噬細胞和小鼠巨噬細胞RAW264.7中NO的產(chǎn)生?；罨木奘杉毎€可以分泌大量的促炎細胞因子，如TNF?α、ⅠL?1β、ⅠL?6和ⅠL?12，這些細胞因子可以招募中性粒細胞進入肺微血管，并促進其遷移到肺實質(zhì)，促進ALⅠ的發(fā)展。LPS誘導(dǎo)的肺損傷小鼠模型已被廣泛用于探索針對ALⅠ的治療策略。經(jīng)氣管滴入肺內(nèi)LPS可增加肺泡上皮通透性和炎癥細胞浸潤，進而導(dǎo)致炎癥細胞因子在支氣管和肺中積累，這與人類ALⅠ的病理過程非常相似。因此，本研究利用該小鼠模型研究PA對LPS誘導(dǎo)ALⅠ的潛在保護作用，實驗造模中觀察到滴入LPS后小鼠出現(xiàn)一系列ALⅠ癥狀，如呼吸及膚色改變，此外肺組織的HE染色顯示LPS組小鼠肺泡壁毛細血管充血、擴張明顯，肺泡腔和肺組織間隙滲出明顯且較多炎性細胞浸潤，與文獻報道的ALⅠ模型的病理改變一致[14]。結(jié)合上述幾點可見本例中小鼠ALⅠ模型構(gòu)建成功。而給予PA預(yù)處理顯著改善了脂LPS誘導(dǎo)的肺組織病理改變、炎癥細胞浸潤，以及減少了肺組織中促炎細胞因子的釋放。這些結(jié)果為PA治療LPS引起的ALⅠ提供了有力的證據(jù)。

NF?κB是三萜類化合物調(diào)節(jié)炎癥性疾病中研究最多的機制之一，NF?κB作為一種重要的細胞轉(zhuǎn)錄因子，正常狀態(tài)下與ⅠκB結(jié)合，以非活性形式存在于細胞質(zhì)中，在外源性配體如LPS等被TLR4識別后信號傳遞入胞內(nèi)，并引起ⅠκB先后被磷酸化和泛素化，ⅠκB構(gòu)象因此發(fā)生改變并被降解，解離后的NF?κB進入胞核與靶序列結(jié)合，促進靶基因的表達[15?16]。重要的是，NF?κB是LPS結(jié)合TLR4/Myd88啟動細胞內(nèi)通路后p38 MAPK和Akt信號通路的關(guān)鍵靶點。p38 MAPK/MK2和PⅠ3K?Akt均可以通過調(diào)控NF?κB（p65）的磷酸化和核易位來調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的基因表達。本研究體內(nèi)外實驗數(shù)據(jù)顯示PA抑制了LPS刺激的巨噬細胞NF?κB（p65）磷酸化。這些結(jié)果表明，PA可能通過抑制p38 MAPK/MK2和Akt介導(dǎo)的NF?κB的活化，導(dǎo)致巨噬細胞中促炎細胞因子的減少，從而抑制LPS誘導(dǎo)的肺損傷。

綜上所述，PA能抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞活化和炎癥反應(yīng)，并對LPS誘導(dǎo)的ALⅠ小鼠肺損傷具有保護作用，其機制與抑制p38 MAPK和Akt介導(dǎo)的NF?κB信號通路激活相關(guān)。