連花解毒合劑解熱、抗炎、止咳及祛痰作用的實(shí)驗(yàn)研究

葉曉楠，朱路文，亢玉瑩，梁潤昱，王琳晶，李書霖，王有鵬，唐強(qiáng)*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

新型冠狀病毒肺炎，簡稱“新冠肺炎”，WHO將其命名為2019冠狀病毒?。╟oronavirus disease 2019,COVⅠD?19），其病原體為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS?CoV?2）[1]。其早期臨床癥狀以發(fā)熱、干咳、乏力為主要表現(xiàn)，少數(shù)患者可伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹瀉等癥狀，臨床分為輕型、普通型、重型、危重型。經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播是其主要傳播途徑[2?3]。連花解毒合劑是我院專家組根據(jù)國家衛(wèi)健委、國家中醫(yī)藥管理局《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》（試行第三版）及《黑龍江省新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(yī)藥防治方案（試行）》，探討并制定的新型冠狀病毒肺炎的中醫(yī)預(yù)防方案（院內(nèi)協(xié)定方），該方由連翹、金銀花、白術(shù)、佩蘭、桑葉、桔梗和甘草[4?5]7味中藥組成，具有清熱解毒、健脾化濕、宣肺利咽的功效，用于風(fēng)熱、濕熱類的溫病所致的發(fā)熱頭痛、咳嗽痰多、咽喉腫痛、氣短、動(dòng)輒汗出者。在疫情期間，廣泛應(yīng)用于臨床上的中青年人群，具有良好的臨床基礎(chǔ)，目前正在將其開發(fā)成院內(nèi)制劑。為了進(jìn)一步明確連花解毒合劑的藥理作用，本文進(jìn)行了連花解毒合劑的解熱、抗炎、止咳以及祛痰作用的研究[6?8]，為連花解毒合劑的進(jìn)一步研制及臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016?0006；SPF級(jí)ⅠCR小鼠，購自遼寧長生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2020?0001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度23~25℃，濕度55%~65%，人工光照12 h∶12 h明暗交替。實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物自由飲食與飲水。

1.2 藥物與試劑

連花解毒合劑（由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：20200722），每1.0 mL合劑相當(dāng)于生藥0.5 g；阿司匹林泡騰片（阿斯利康，批號(hào)：1905213）；氫溴酸右美沙芬片（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，A1910011）；高活性干酵母（安琪酵母有限公司，批號(hào)：20200418）；碳酸氫鈉（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：201909）；苯酚紅（天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心，批號(hào)：20191211）；氯化銨（天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20200122）；二甲苯（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20190505）；氨水（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號(hào)：20191215）；凡士林（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190101）。

1.3 主要儀器

FA2004分析天平（SOPTOP/舜宇恒平儀器）；TGL?16E臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（YⅠNGTAⅠ）；電熱恒溫水浴鍋（天津天泰儀器有限公司）；Synergy MX型酶標(biāo)儀（BⅠO TEK公司）；YP5002電子天平（常州市衡正電子儀器有限公司）；LY?301C電子體溫計(jì)（北京綠源恒泰醫(yī)療器械有限公司）。

2 方法

2.1 解熱作用：酵母致大鼠發(fā)熱實(shí)驗(yàn)

Wistar大鼠，體質(zhì)量180~200 g，雌雄各半，適應(yīng)環(huán)境3 d，于第4天起，每天早晚2次對(duì)大鼠實(shí)行適應(yīng)性測量肛溫，測量前用凡士林涂抹于大鼠肛門周圍，待大鼠排空糞便后將體溫計(jì)插入大鼠肛門，保持每次插入深度一致，連續(xù)測量3 d，2次/d，篩選出體溫波動(dòng)不超過0.5℃，平均體溫在36.6~38.3℃的動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。正式實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日上午每隔1 h測體溫1次，連續(xù)測2次，取平均值為基礎(chǔ)體溫。隨機(jī)抽取雌雄大鼠各5只大鼠作為空白對(duì)照組，除空白對(duì)照組外，其他組均背部皮下注射20%干酵母懸液10 mL/kg，空白對(duì)照組背部皮下注射等體積的生理鹽水[9?13]。致熱6 h后，選取體溫升高0.8℃以上的50只大鼠，將雌雄動(dòng)物各隨機(jī)分為連花解毒合劑低、中、高劑量組（1.8、3.6、7.2 g/kg）、模型組、阿司匹林組（陽性藥組，0.2 g/kg），每組10只（雌雄各半）。各給藥組灌胃給予相應(yīng)的藥物，空白對(duì)照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水。分別于給藥后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h測定記錄各組大鼠體溫。按公式計(jì)算各組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)的體溫升溫值ΔT。

2.2 抗炎作用：二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)

雄性ⅠCR小鼠50只，體質(zhì)量18~20 g，適應(yīng)環(huán)境3 d，按體質(zhì)量隨機(jī)分為連花解毒合劑低、中、高劑量組（2.6、5.2、10.4 g/kg）、模型組、陽性藥組（阿司匹林，0.2 g/kg），每組10只。每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，模型組給予等體積蒸餾水。正式試驗(yàn)前禁食不禁水12 h，末次給藥0.5 h后，取二甲苯50μL均勻涂于小鼠右耳廓內(nèi)外，0.5 h后將小鼠頸椎脫臼處死，沿耳廓基線剪下2耳，用直徑8 mm打孔器分別在同一部位打下雙耳片，精密稱質(zhì)量，以兩耳片質(zhì)量之差作為腫脹度[14?17]，并按公式計(jì)算腫脹度抑制率（%）。腫脹度抑制率=

2.3 止咳作用：濃氨水引咳實(shí)驗(yàn)

ⅠCR小鼠50只，體質(zhì)量18~20 g，雌雄各半，適應(yīng)

環(huán)境3 d，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方式同“2.2”，僅陽性藥組小鼠改為灌胃給予氫溴酸右美沙芬（18 mg/kg），連續(xù)給藥7 d。末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥0.5 h后，進(jìn)行濃氨水引咳，將小鼠放入倒置于桌面的500 mL玻璃鐘罩內(nèi)，用移液槍將0.5 mL濃氨水（25%氫氧化銨）滴于棉球上（100±5）mg，置于鐘罩內(nèi)引咳30 s后立即取出，觀察小鼠的咳嗽反射（腹肌收縮，張大嘴，有時(shí)有咳嗽聲），記錄從放入小鼠到小鼠發(fā)生咳嗽反射的時(shí)間即咳嗽潛伏期和2 min內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù)，并按公式計(jì)算咳嗽抑制率[18?20]。

咳嗽抑制率=

2.4 祛痰作用：小鼠氣管酚紅排泄實(shí)驗(yàn)

ⅠCR小鼠50只，體質(zhì)量18~20 g，雌雄各半，適應(yīng)環(huán)境3 d，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方式同“2.2”，僅陽性藥組小鼠改為灌胃給予氯化銨（1 g/kg），連續(xù)給藥7 d。末次給藥前禁食不禁水16 h，末次給藥0.5 h后，腹腔注射2.5%酚紅生理鹽水溶液0.2 mL/10 g，注射0.5 h后，頸椎脫臼處死動(dòng)物，仰位固定，頸部拉直，解剖分離出氣管，剪下自甲狀軟骨至氣管分支處的一段相同長度的氣管，放入盛有2 mL 5%的NaHCO3的試管中，超聲30 min，2 000 r/min離心5min，取上清液，用酶標(biāo)儀于546 nm處測定吸光度（A）值[21?25]。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示。采用單因素方差分析比較各組間、組內(nèi)差異，方差齊者用LSD?t檢驗(yàn)比較兩兩之間差異，不齊者則用Tamhane'sT2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 連花解毒合劑對(duì)酵母致大鼠發(fā)熱的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠在致熱6 h后，體溫顯著升高（P＜0.01），升溫約1.27℃，提示大鼠發(fā)熱模型建立成功。與模型組相比，給藥后各時(shí)間點(diǎn)，阿司匹林和連花解毒合劑高劑量組大鼠的ΔT值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），連花解毒合劑中、低劑量組大鼠的ΔT值分別在在給藥后2~5 h顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 連花解毒合劑對(duì)酵母所致大鼠發(fā)熱的影響Table 1 Effect of Lianhuajiedu mixture on yeast?induced fever in rats （±s，n=10）

表1 連花解毒合劑對(duì)酵母所致大鼠發(fā)熱的影響Table 1 Effect of Lianhuajiedu mixture on yeast?induced fever in rats （±s，n=10）

與空白對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

?

3.2 連花解毒合劑對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

與模型組相比，陽性藥組（阿司匹林）、連花解毒合劑中、高劑量組小鼠耳腫脹度顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。陽性藥組小鼠的腫脹度抑制率為61.43%，連花解毒合劑低、中、高劑量組小鼠的腫脹度抑制率分別為13.21%、24.64%、36.64%，見圖1。

圖1 連花解毒合劑對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響Figure1 Effect of Lianhuajiedu mixture on ear swelling in mice(±s,n=10)

3.3 連花解毒合劑對(duì)濃氨水致咳小鼠的影響

與模型組比較，陽性藥組（氫溴酸右美沙芬）和高劑量的連花解毒合劑對(duì)小鼠咳嗽的潛伏期有顯著的延長作用（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥組、連花解毒合劑各劑量組小鼠2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），且各劑量組呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。陽性藥組小鼠的咳嗽抑制率為50.55%，連花解毒合劑低、中、高劑量組小鼠的咳嗽抑制率分別為24.18%、32.97%、和37.36%，見圖2。

3.4 連花解毒合劑對(duì)小鼠氣管酚紅排泌量的影響

與模型組相比，陽性藥組（氯化銨）、連花解毒合劑中、高劑量組小鼠氣管酚紅排泌量明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），連花解毒合劑低劑量組小鼠氣管酚紅排泌量也有增加的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 連花解毒合劑對(duì)小鼠氣管酚紅排泌量的影響Figure 3 Effect of Lianhuajiedu mixture on excretion of phenol red in mice(±s,n=10)

4 討論

《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第六版）》將新冠肺炎歸屬于“疫”病范疇?！耙摺辈∈枪糯t(yī)學(xué)對(duì)烈性傳染病的總稱。專家對(duì)新冠肺炎感染者的臨床特點(diǎn)分析指出：患病者癥狀出現(xiàn)頻率較高的是發(fā)熱、倦怠乏力、干咳、納呆、口干、腹瀉等，基本符合中醫(yī)學(xué)中疫病的臨床特點(diǎn)[26?27]。連花解毒合劑為我院院內(nèi)協(xié)定方，該方以抗邪氣、祛疫濁為主略兼調(diào)暢氣機(jī)為總旨，功能清熱解毒、健脾化濕、宣肺利咽。本研究結(jié)果表明，在酵母致大鼠發(fā)熱模型中，連花解毒合劑高劑量組在給藥后1~5 h，大鼠體溫均顯著下降，降溫作用持續(xù)時(shí)間較長；連花解毒合劑低劑量組在給藥后2 h，與模型組相比，體溫顯著降低，但持續(xù)時(shí)間較短。發(fā)熱與炎癥密切相關(guān)，且炎癥表現(xiàn)可能參與外感及肺炎癥狀的全過程[28]。本研究在確定了連花解毒合劑具有解熱作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，連花解毒合劑中、高劑量組與模型組相比，腫脹度顯著降低，表現(xiàn)出良好的抗炎效果。在小鼠氣管酚紅排泌實(shí)驗(yàn)中，連花解毒合劑中、高劑量組與模型組相比，小鼠氣管酚紅排泌量顯著增加，提示本藥具有較好的祛痰作用。此外，在小鼠濃氨水引咳實(shí)驗(yàn)中，連花解毒合劑低、中、高劑量組小鼠咳嗽次數(shù)顯著減少，且高劑量組小鼠的咳嗽潛伏期顯著縮短，表明連花解毒合劑有良好的止咳效果。

綜上所述，連花解毒合劑具有明顯的解熱、抗炎、止咳以及祛痰作用。本研究為連花解毒合劑的功效主治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和科學(xué)闡釋，但其藥理作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。