不同因素對包埋質(zhì)量的影響

張睿，羅錦*，朱正鵬，馬健波，徐佳佳

（1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院病理科，十堰 442008；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院影像科，十堰 442008)

包埋是指將組織放于受熱熔化的載體中，通過載體冷卻固化后支撐組織的過程[1]，是組織制片中重要的環(huán)節(jié)之一。日常工作中最常用的包埋方法即石蠟包埋。石蠟包埋質(zhì)量的好壞會直接影響后續(xù)的切片、染色效果，但石蠟包埋的過程中細(xì)節(jié)多，容易出現(xiàn)包埋不佳的情況。為了達(dá)到滿意的包埋效果我們進(jìn)行了技術(shù)探索，通過優(yōu)化操作細(xì)節(jié)，以期提升包埋質(zhì)量。

資料與方法

1 材料與分組

從國藥東風(fēng)總醫(yī)院病理科2020年6月的病理標(biāo)本中，選取800例標(biāo)本，其中大標(biāo)本（直徑＞0.4 cm）650塊，小標(biāo)本（直徑≤0.4 cm）150塊，將標(biāo)本隨機(jī)分成對照組（325個大標(biāo)本+75個小標(biāo)本）和實驗組（325個大標(biāo)本+75個小標(biāo)本），各400塊。

2 方法

對照組：先往常溫包埋模具中開始第一次注蠟，一次性注滿模具，置于熱臺上[2]，放入組織，蓋上包埋盒，進(jìn)行第二次注蠟，蠟液的液面高度接近包埋盒上緣。實驗組：每例取1個加熱至70 ℃的包埋模具，將熱包埋模具放置包埋機(jī)蠟嘴下方熱臺（溫度為70℃），開始第一次注蠟，注蠟量為包埋模具容量的2/3；用加熱的包埋鑷夾取組織，放入模具底部中央；將包埋模具移至表面添加有少量水的包埋機(jī)冷臺上，輕壓組織，使組織穩(wěn)穩(wěn)的黏連在包埋模具上；待模具側(cè)壁的石蠟稍凝固后加蓋包埋盒底盒，包埋底盒傾斜一定夾角，先將長軸一側(cè)接觸蠟液再緩緩放平，輕壓；二次注蠟時包埋模具連同包埋盒傾斜10°~25°（圖1），蠟液液面沒過包埋盒下緣，置于凍臺充分冷卻，再進(jìn)行常規(guī)切片，然后行HE染色（表1）。

圖1 包埋過程中的操作要點。A，包埋盒蓋于包埋模具時，包埋盒傾斜一定夾角，先將長軸一側(cè)接觸蠟液再緩緩放平，輕壓，可減少氣泡的殘留；B，二次注蠟時包埋模具連同包埋盒傾斜10°～25°Fig.1 Key points of the embedding procedure.A, when the embedding box was covered with the embedding mold, the embedding box was inclined at a certain angle.First touch the wax liquid on one side of the long axis, then slowly flatten it and press lightly to reduce the residual air bubbles; B, during the second injection of wax, the embedding mold and the embedding box were inclined at an angle of 10°~25°.

表1 實驗組與對照組蠟包埋方法對比Tab.1 Comparison of paraffin embedding methods between experimental group and control group

3 觀察指標(biāo)

3.1 組織包埋合格標(biāo)準(zhǔn)

組織蠟塊與包埋盒平行無裂隙、包埋組織居中、組織排列整齊、排列方向一致、包埋面準(zhǔn)確、包埋面高低一致、石蠟與組織融合、注蠟適宜、蠟塊無氣泡、包埋無污染。包埋合格率=達(dá)到包埋合格標(biāo)準(zhǔn)的蠟塊數(shù)/蠟塊總數(shù)。

3.2 撬出蠟塊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

甲級：四周邊緣無殘蠟；乙級：一邊或兩邊僅有少量殘蠟；丙級：一邊有大量殘蠟或三邊以上有少量殘蠟；丁級：兩邊及以上有大量殘蠟。

3.3 后續(xù)工作質(zhì)量觀察指標(biāo)

由兩名高年資醫(yī)師對HE染色效果進(jìn)行評判，評判組織結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)胞透明度和核質(zhì)對比度，每項10分，根據(jù)質(zhì)量缺陷扣減相應(yīng)分值，每項指標(biāo)的分?jǐn)?shù)取其均值。選取兩組中進(jìn)行免疫組化染色的切片各120張，進(jìn)行閱片評分，分值≥90分為優(yōu)良切片，分別統(tǒng)計兩組的免疫組化切片優(yōu)良率。評分標(biāo)準(zhǔn)參考《免疫組織化學(xué)病理診斷》[3]。

結(jié) 果

1 蠟塊包埋質(zhì)量

對照組合格率為86.75%（347/400），實驗組包埋合格率為93.50%（374/400），顯著高于對照組；其中實驗組與對照組在包埋面高低一致、石蠟與組織融合、蠟塊無氣泡方面也顯著優(yōu)于對照組（表2）。

表2 蠟塊包埋質(zhì)量統(tǒng)計學(xué)分析Tab.2 Statistical analysis of wax block embedding quality

2 撬出蠟塊質(zhì)量

對照組蠟塊質(zhì)量甲級率為68.75%，實驗組蠟塊質(zhì)量甲級率為98.25%，實驗組蠟塊質(zhì)量甲級率顯著高于對照組（表3）。

表3 撬出蠟塊質(zhì)量統(tǒng)計學(xué)分析Tab.3 Statistical analysis of the quality of pried wax block

3 HE染色切片質(zhì)量

對HE染色切片比較發(fā)現(xiàn)，對照組HE切片完整度欠佳，組織結(jié)構(gòu)欠清晰，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)對比欠清晰；實驗組組織切面較為完整，無刀痕、裂隙、顫痕，切片厚薄均勻，組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)清晰（圖2）；實驗組的組織結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)胞顯示效果評分均顯著高于對照組（表4）。

圖2 實驗組與對照組包埋質(zhì)量和切片質(zhì)量檢測。A，對照組蠟塊中有氣泡殘留，且四周殘蠟較多（黑框示蠟塊周圍殘蠟，箭頭示蠟塊中殘留氣泡）；B，實驗組蠟塊包埋位置居中，排列整齊，包埋面高低一致且無氣泡；C和E ，對照組HE染色切片組織結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)對比不清（星號示組織結(jié)構(gòu)不完整）；D、F 實驗組HE染色切片完整，厚薄均勻，無刀痕、裂隙、顫痕，組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)清晰。比例尺：C和D，100 μm；E和F，20 μmFig.2 Examination of embedding quality and section quality of experimental group and control group.A, there are bubbles remaining in the wax block of the control group, and there are more residual waxes around (the black frame shows the residual wax around the wax block; the arrow head indicates residual air bubbles in the wax block); B, in the experimental group, the embedding position of the wax block was centered, arranged neatly, and the embedding surface had the same height and no air bubbles; C and E, in the control group, the tissue structure of HE-stained sections was incomplete, and the contrast between the nucleus and cytoplasm was unclear (asterisk indicating incomplete organizational structure); D and F, the HE-stained sections of the experimental group were complete, with uniform thickness, no knife marks, fissures, and chatter marks, and the tissue structure and cell morphology were clear.Scale bar: 100 μm in C and E；20 μm in E and F

表4 HE染色切片質(zhì)量統(tǒng)計學(xué)分析Tab.4 Statistical analysis of quality of HE stained sections

4 免疫組織化學(xué)染色切片質(zhì)量

對照組切片中皺褶較多，皺褶區(qū)域組織結(jié)構(gòu)不清，且有背景著色（圖3A、C）；實驗組切片平整，無皺褶折疊，組織結(jié)構(gòu)清晰，對比鮮明（圖3B、D）；實驗組切片優(yōu)良率（97.50%）顯著高于對照組切片優(yōu)良率（90.83%）（表5）。

圖3 實驗組與對照組免疫組織化學(xué)染色切片質(zhì)量比較。A和C，對照組，箭示組織中皺褶；B和D， 實驗組；比例尺：A和B，100 μm；C 和D，20 μmFig.3 Comparison of the quality of immunohistochemically stained sections between the experimental group and the control group.A and C, control group, the arrow indicating a wrinkle; B and D, experimental group.Scale bar, 100 μm in A and B; 20 μm in C and D

表5 免疫組織化學(xué)染色切片質(zhì)量統(tǒng)計學(xué)分析Tab.5 Statistical analysis of quality of immunohistochemically stained sections

討 論

包埋是組織制片過程中的重要環(huán)節(jié)，包埋質(zhì)量的好壞直接影響到后續(xù)的制片效果。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，胃腸鏡、纖維支氣管鏡活檢及超聲引導(dǎo)下粗針穿刺技術(shù)的日益發(fā)展和成熟，臨床送檢的體積微小，穿刺標(biāo)本的數(shù)量日益增多，對我們的包埋技術(shù)提出了更高的要求。

如果包埋模具常溫放置，包埋時只有底部與熱臺接觸受熱，其余部分均為常溫，注入石蠟后底部石蠟為熔化狀態(tài)，四周溫度迅速下降，很快形成半凝固狀態(tài)[4]，多塊組織或細(xì)小組織包埋時，難以在短時間內(nèi)將所有組織包埋在同一平面[5]。特別是細(xì)小穿刺組織往往體積小、質(zhì)量輕，在蠟液中很難沉降到包埋盒底部，如果沒有按壓平整，極易出現(xiàn)組織不在同一平面上，而造成切片不全影響診斷。通過將包埋模具加熱至與石蠟熔點相近的溫度70 ℃，可減緩石蠟?zāi)?，保證包埋人員有足夠的時間將組織按正確的包埋方向放置到包埋盒底部中央。

對于完成組織定位的包埋模具一般放置于冷臺冷卻，此種冷卻方式，模具只有底部受冷，石蠟?zāi)叹徛窠M織容易發(fā)生移位，且放置包埋盒時易發(fā)生蠟液上涌。通過在冷臺上加入少量的水，包埋模具大部置于水中，受冷面積顯著增加，靠近模具的石蠟快速凝固，這樣不僅減少組織移位的風(fēng)險，而且避免加蓋包埋盒輕壓時石蠟上涌，蠟塊四周殘蠟較多的情況。

注蠟量的控制是減少殘蠟產(chǎn)生的關(guān)鍵，對照組第一次注蠟，一次性注滿包埋模具，在放入組織后大量石蠟外涌導(dǎo)致蠟塊四周殘蠟較多。實驗組將注蠟量調(diào)整為包埋模具容量的2/3，既有效緩解二次注蠟時的沖擊力又避免石蠟的大量涌出。同時將第二次注蠟量調(diào)整為沒過包埋盒下緣，這樣既不影響撬出蠟塊和后續(xù)切片又降低石蠟漏出的風(fēng)險。

包埋時二次注蠟的注蠟量較多，如果包埋模具與注蠟方向垂直，液態(tài)石蠟的沖擊力較大易在包埋面及以下產(chǎn)生氣泡。將包埋模具傾斜10°～25°，可緩沖液態(tài)石蠟的沖擊，減少氣泡的產(chǎn)生。結(jié)果顯示，實驗組的組織包埋合格率、撬出蠟塊質(zhì)量明顯高于對照組，后期HE和免疫組織化學(xué)染色后，切片組織結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)胞顯示效果評分較對照組有所增加，免疫組化染色優(yōu)良率也高于對照組。

綜上，通過優(yōu)化包埋模具的溫度、第一次注蠟量、包埋機(jī)冷臺、加蓋包埋底盒方式、二次注蠟角度等條件，可顯著提升包埋質(zhì)量。

做好組織包埋還需要注意以下幾點：①包埋石蠟的選擇至關(guān)重要，直接影響后續(xù)的制片效果。熔點較低的石蠟適用于室溫偏低時包埋質(zhì)軟組織，而室溫較高時則需要選擇熔點較高的石蠟。如果室溫較高而選擇低熔點石蠟會造成蠟塊偏軟，切片時易發(fā)生卷片、無法連續(xù)切片，所制切片皺褶較多難以展開；如果室溫偏低而選擇高熔點石蠟則蠟塊偏硬，切片易產(chǎn)生裂隙。②包埋工作開始前，需保證鑷子、組織塊儲存框、包埋模具儲存框及包埋模具處于清潔狀態(tài)，減少組織污染的風(fēng)險。③組織塊暫存框中的蠟液量應(yīng)為脫水盒2/3高度左右，保證組織一直處于浸蠟狀態(tài)，避免出現(xiàn)組織與蠟液不溶。④在包埋時應(yīng)隨時清潔工作臺面，用紙擦拭熱臺的溝槽、臺面，包埋時打開一份包埋盒包埋一份組織[6]，包埋完成后立即清潔鑷子，再進(jìn)行下一份組織的包埋，避免交叉污染。切不可同時打開多個包埋盒，同時包埋極易造成組織混淆，導(dǎo)致醫(yī)療差錯。打開包埋盒時動作要輕柔，避免組織崩出，注意包埋盒蓋有無組織存留。⑤針對不同的組織選擇適宜的包埋方式，如皮膚組織包埋時應(yīng)將組織塊45 ℃傾斜放入石蠟中，宮頸錐切組織應(yīng)按組織的內(nèi)膜至漿膜面呈90℃包埋，食管粘膜或標(biāo)注立埋的組織則需要垂直包埋等。⑥單塊組織包埋時應(yīng)放置于包埋模具中央，多塊組織居中呈正方形或長方形排列，組織間聚攏[7]。宮頸、宮腔等組織較松散，包埋時應(yīng)注意組織塊四周與包埋盒底邊緣的距離，至少保持1 mm空隙。⑦將包埋盒蓋于包埋模具時，包埋盒傾斜一定夾角，先用長軸一側(cè)接觸蠟液面再輕輕放下，可減少氣泡的殘留。操作時動作需迅速平穩(wěn)，若動作太慢，蠟?zāi)毯蠹由w包埋盒，易造成組織蠟塊與包埋盒不平行。⑧二次注蠟時，動作要輕柔，傾斜角度不宜過大，防止包埋盒底盒移位。液面高度必須沒過包埋盒下緣，如注蠟量過少則切片時蠟塊易產(chǎn)生震顫，過度蠟塊不宜與切片機(jī)夾具吻合，影響切片質(zhì)量。⑨包埋完成后將包埋模具倒扣，置于烤箱中，模具上殘留雜質(zhì)可隨融化的殘蠟流出，再放置于包埋機(jī)中備用。也可定期將包埋模具同包埋框一起放入脫水機(jī)，應(yīng)用清洗程序清潔。⑩建立包埋的質(zhì)控，登記每日的包埋的蠟塊總數(shù)，核對每個包埋盒內(nèi)組織塊數(shù)?？偟南瀴K數(shù)與切片數(shù)，在染色結(jié)束后應(yīng)該核對一下，切片與對應(yīng)號碼的蠟塊進(jìn)行比較:檢查是否一致，有無差錯，是否切全，有無遺漏，標(biāo)簽是否有誤等[8]。

提高包埋質(zhì)量的關(guān)鍵在于對包埋過程中細(xì)節(jié)的優(yōu)化，需要根據(jù)不同標(biāo)本的組織特點制定更加個性化的操作方案[9]。只有在工作中不斷的積累經(jīng)驗針對問題作出改進(jìn)，才能使包埋質(zhì)量不斷提升。本研究樣本量有限，對于包埋樣本分類不夠細(xì)致，下一步將進(jìn)一步細(xì)化研究。